Name: visualizing the conformational dynamics of membrane receptors using single-molecule fret
Uploaded: 2022-08-17T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET at JoVE.com

Agradecemos aos membros do laboratório Reza Vafabakhsh pelas discussões. Este trabalho foi apoiado pelo subsídio R01GM140272 dos Institutos Nacionais de Saúde (para R.V.), pelo Searle Leadership Fund for the Life Sciences da Northwestern University e pelo Chicago Biomedical Consortium com o apoio dos Searle Funds no The Chicago Community Trust (para R.V.). B.W.L. foi apoiado pelo National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061.

O fluxo de trabalho geral do protocolo é descrito na Figura 1.
1. Preparação da câmara de amostra
<ol><li>Limpeza de deslizamento e tampa NOTA: Estas etapas visam limpar as superfícies das lâminas, bem como as coberturas e prepará-las para a aminossilanização. Um requisito crítico para a realização de experimentos de fluorescência de molécula única em moléculas ligadas à superfície é uma superfície passivada. A técnica de passivação...

<ol>
	<li>Smock, R. G., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sending+signals+dynamically.">Sending signals dynamically.</a> Science. 324 (5924), 198-203 (2009).</li><li>Changeux, J. P., Christopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+modulation+as+a+unifying+mechanism+for+receptor+function+and+regulation.">Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation.</a> Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).</li><li>Tang, X. -. l., Wang, Y., Li, D. -. l., Luo, J., Liu, M. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orphan+G+protein-coupled+receptors+(GPCRs):+biological+functions+and+potential+drug+targets.">Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).</li><li>Chung, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+in+the+G+protein+Gs+induced+by+the+&#946;2+adrenergic+receptor.">Conformational changes in the G protein Gs induced by the &#946;2 adrenergic receptor.</a> Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).</li><li>Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+dynamics+of+a+class+C+G-protein-coupled+receptor.">Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor.</a> Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).</li><li>Niswender, C. M., Conn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+glutamate+receptors:+Physiology,+pharmacology,+and+disease.">Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).</li><li>Pin, J. P., Bettler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+functions+of+mGlu+and+GABA(B)+receptor+complexes.">Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes.</a> Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).</li><li>Kniazeff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closed+state+of+both+binding+domains+of+homodimeric+mGlu+receptors+is+required+for+full+activity.">Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).</li><li>Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer.">Single-molecule fluorescence resonance energy transfer.</a> Methods. 25 (1), 78-86 (2001).</li><li>Schuler, B., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+studied+by+single-molecule+FRET.">Protein folding studied by single-molecule FRET.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).</li><li>Liauw, B. W. -. H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+rearrangement+during+activation+of+a+metabotropic+glutamate+receptor.">Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor.</a> Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).</li><li>Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+site-specific+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins.">A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins.</a> Science. 244 (4901), 182-188 (1989).</li><li>Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-catalyzed+azide-alkyne+click+chemistry+for+bioconjugation.">Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).</li><li>Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unnatural+amino+acid+mutagenesis+of+GPCRs+using+amber+codon+suppression+and+bioorthogonal+labeling.">Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling.</a> G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).</li><li>Serfling, R., Coin, I., Pecoraro, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+Four+-+Incorporation+of+Unnatural+Amino+Acids+into+Proteins+Expressed+in+Mammalian+Cells.">Chapter Four - Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells.</a> Methods in Enzymology. 580, 89-107 (2016).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+Trolox+as+antiblinking+and+antibleaching+reagent.">On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments.">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+short+chain+nonionic+detergents+destabilize+G-protein-coupled+receptors.">How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).</li><li>Cao, A. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+modulators+enhance+agonist+efficacy+by+increasing+the+residence+time+of+a+GPCR+in+the+active+state.">Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).</li><li>Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -. H., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cross-correlation+filtering+of+one-and+two-color+single+molecule+localization+microscopy+data.">Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data.</a> Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).</li><li>Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+locus+specific+chromatin+structure+and+dynamics+with+correlative+conventional+and+super-resolution+imaging+in+living+cells.">Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells.</a> Nucleic Acids Research. , (2022).</li><li>Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+FRET+efficiency+and+ratio+of+donor+to+acceptor+concentration+in+living+cells.">Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells.</a> Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).</li><li>Gopich, I. V., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+efficiency+distributions+of+multistate+single+molecules.">FRET efficiency distributions of multistate single molecules.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).</li><li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-molecule+FRET.">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li><li>Hellenkamp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+accuracy+of+single-molecule+FRET+measurements-A+multi-laboratory+benchmark+study.">Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study.</a> Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).</li><li>Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+rates+and+states+from+biophysical+time+series:+A+Bayesian+approach+to+model+selection+and+single-molecule+FRET+data.">Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data.</a> Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+structural+elements+of+the+T-box+riboswitch+drive+the+two-step+binding+of+the+tRNA+ligand.">Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand.</a> Elife. 7, 39518 (2018).</li><li>Goodman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+analysis+based+on+a+certain+multivariate+complex+Gaussian+distribution+(an+introduction).">Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction).</a> The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).</li><li>Brown, R. B., Audet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+techniques+for+single-cell+lysis.">Current techniques for single-cell lysis.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5, 131-138 (2008).</li><li>Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+sensitivity+modulation+in+the+calcium-sensing+receptor+via+electrostatic+tuning.">Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning.</a> Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).</li><li>Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+pull-down+for+studying+protein+interactions.">Single-molecule pull-down for studying protein interactions.</a> Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).</li><li>Huang, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineating+the+conformational+landscape+of+the+adenosine+A(2A)+receptor+during+G+protein+coupling.">Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling.</a> Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).</li><li>Wingler, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+analogs+with+divergent+bias+stabilize+distinct+receptor+conformations.">Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations.</a> Cell. 176 (3), 468-478 (2019).</li><li>Gordon, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivity+of+biarylazacyclooctynones+in+copper-free+click+chemistry.">Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).</li><li>Kim, E., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+applications+of+copper-free+click+chemistry:+In+vitro,+in+vivo,+and+ex+vivo.">Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo.</a> Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).</li><li>Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations,+challenges,+and+limitations+of+bioconjugation+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).</li><li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+of+ligand+activation+in+human+calcium-sensing+receptor.">Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor.</a> Elife. 5, 13662 (2016).</li></ol>

GPCRs são proteínas que operam na membrana celular para iniciar a transdução de sinal. Muitos GPCRs consistem em vários domínios, com a sinalização sendo dependente da interação cooperativa entre os domínios. Para modular as propriedades desses receptores de membrana, é essencial entender o comportamento dinâmico dos múltiplos domínios. A transferência de energia por ressonância de fluorescência de molécula única (smFRET) é uma técnica de fluorescência que permite a medição da conformação e din...

A transferência de informações através da membrana plasmática é fortemente dependente da função dos receptores de membrana1. A ligação do ligante a um receptor leva a uma alteração conformacional e à ativação do receptor. Este processo é muitas vezes alostérico na natureza2. Com mais de 800 membros, os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são a maior família de receptores de membrana em humanos3. Devido ao seu papel em quase todos os processos celulares, os GPCRs tornaram-se alvos importantes para o desenvolvimento terapêutico. No modelo canônico de sinalização GPCR, a ativação do agonista resulta em alterações conformacionais do receptor que subsequentemente ativam o complexo proteico G heterotrimérico via troca de PIB por GTP na bolsa de ligação de nucleotídeos de Gα. As subunidades G α-GTP e Gβγ ativadas controlam a atividade das proteínas efetoras a jusante e propagam a cascata de sinalização 4,5. Este processo de sinalização depende essencialmente da capacidade dos ligantes de alterar a forma tridimensional do receptor. Uma compreensão mecanicista de como os ligantes conseguem isso é fundamental para o desenvolvimento de novas terapêuticas e o design de receptores e sensores sintéticos.
Os receptores metabotrópicos de glutamato (mGluRs) são membros da família GPCR classe C e são importantes para os efeitos neuromoduladores lentos do glutamato e para a excitabilidade neuronal de sintonia 6,7. Entre todos os GPCRs, os GPCRs de classe C são estruturalmente únicos, pois funcionam como dímeros obrigatórios. Os mGluRs contêm três domínios estruturais: o domínio da armadilha de Vênus (VFT), o domínio rico em cisteína (CRD) e o domínio transmembrana (TMD)8. As mudanças conformacionais durante o processo de ativação são complexas e envolvem acoplamento conformacional local e global que se propagam a uma distância de 12 nm, bem como a cooperatividade do dímero. As conformações intermediárias, a ordenação temporal dos estados e a taxa de transição entre os estados são desconhecidas. Seguindo a conformação de receptores individuais em tempo real, é possível identificar os estados intermediários transitórios e a sequência de alterações conformacionais durante a ativação. Isso pode ser conseguido por meio da aplicação de transferência de energia de ressonância de fluorescência de molécula única 9,10 (smFRET), como foi recentemente aplicado para visualizar a propagação de alterações conformacionais durante a ativação do mGluR2 11. Um passo fundamental nos experimentos FRET é a geração de sensores FRET pela inserção site-specific dos fluoróforos doador e aceitador na proteína de interesse. Uma estratégia de incorporação de aminoácidos não naturais (AIA) foi adotada 12,13,14,15 para superar as limitações das tecnologias típicas de marcação fluorescente site-specific que exigem a criação de mutantes sem cisteína ou a inserção de uma grande etiqueta geneticamente codificada. Isso permitiu observar o rearranjo conformacional do essencial ligador alostérico compacto, que uniu os domínios de ligação e sinalização do ligante do mGluR2. Neste protocolo, um guia passo-a-passo para a realização de experimentos smFRET em mGluR2 é apresentado, incluindo a abordagem para marcação site-specific de mGluR2 com UAA para anexar fluoróforos usando a reação de ciclização azida catalisada por cobre. Além disso, este protocolo descreve a metodologia para a captura direta de proteínas de membrana e análise de dados. O protocolo descrito aqui também é aplicável ao estudo da dinâmica conformacional de outras proteínas de membrana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(+)-Sodium L-Ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat # 11140-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-azido-L-phenylalanine</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>Cat # 06162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>548UAA</td>
			<td>Liauw et al. 2021</td>
			<td></td>
			<td>Transfected construct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator (2022)</td>
			<td>https://www.adobe.com/</td>
			<td>RRID:SCR_010279</td>
			<td>Software, algorithm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminoguanidine (hydrochloride)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>81530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>919-30-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Sonicator 2.8 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic Bath 2.8 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTTES</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1237-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat # 451657-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-306</td>
			<td>Sample chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Alkyne</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>TA117-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 Alkyne</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>TA116-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Part# D310 1 GM</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM-CHS (10:1)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Part# D310-CH210 1 ML</td>
			<td>Detergent with cholecterol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di01-R405/488/561/635</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>Notch filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897U</td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET542lp</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td>Long pass emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF640-FDi01</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>Emission dichroic filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG-tag antibody</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>A01429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent bead</td>
			<td>Invitrogen T7279</td>
			<td>TetraSpeck microspheres</td>
			<td>Spherical bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td>sample chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat # 6106-04-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat # 12022001</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>FisherBioReagents</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>OptoSplit II</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Oxxius</td>
			<td></td>
			<td>4-line laser combiner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>Transfection Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td></td>
			<td>Water Deionizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m-PEG</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>Item# MPEG-SIL-5000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NF03-405/488/532/635</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>Dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51985091</td>
			<td>Reduced Serum Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM/Reduced serum medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro (2020b)</td>
			<td>https://www.originlab.com/</td>
			<td>RRID:SCR_014212</td>
			<td>Data analysis and graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pIRE4-Azi</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid # 105829</td>
			<td>Transfected construct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat # P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid (PCA)</td>
			<td>HWI group</td>
			<td>99-50-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>smCamera (Version 1.0)</td>
			<td>http://ha.med.jhmi.edu/resources/</td>
			<td></td>
			<td>Camera software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>FisherBioReagents</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Whatman UNIFLO</td>
			<td>Cat#9914-2502</td>
			<td>Liquid filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolox</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>53188-07</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the conformational dynamics of membrane receptors using single-molecule fret

A capacidade das células de responder a sinais externos é essencial para o desenvolvimento, crescimento e sobrevivência celular. Para responder a um sinal do ambiente, uma célula deve ser capaz de reconhecê-lo e processá-lo. Esta tarefa baseia-se principalmente na função dos receptores de membrana, cujo papel é converter sinais na linguagem bioquímica da célula. Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) constituem a maior família de proteínas receptoras de membrana em humanos. Entre os GPCRs, os receptores metabotrópicos de glutamato (mGluRs) são uma subclasse única que funcionam como dímeros obrigatórios e possuem um grande domínio extracelular que contém o sítio de ligação do ligante. Avanços recentes em estudos estruturais de mGluRs melhoraram a compreensão de seu processo de ativação. No entanto, a propagação de alterações conformacionais em larga escala através de mGluRs durante a ativação e modulação é pouco compreendida. A transferência de energia de ressonância de fluorescência de molécula única (smFRET) é uma técnica poderosa para visualizar e quantificar a dinâmica estrutural de biomoléculas no nível de proteína única. Para visualizar o processo dinâmico de ativação do mGluR2, foram desenvolvidos sensores conformacionais fluorescentes baseados na incorporação de aminoácidos não naturais (UAA) que permitiram a marcação de proteínas site-specific sem perturbação da estrutura nativa dos receptores. O protocolo descrito aqui explica como realizar esses experimentos, incluindo a nova abordagem de rotulagem de UAA, preparação de amostras e aquisição e análise de dados smFET. Essas estratégias são generalizáveis e podem ser estendidas para investigar a dinâmica conformacional de uma variedade de proteínas de membrana.

Expressão e marcação fluorescente do sensor FRET baseado em EAU Aqui, são discutidos resultados exemplares da inserção e marcação fluorescente de uma AIU (AZP) dentro da DRC de mGluR2 (548UAA)11. Como mencionado anteriormente, para inserir o AZP no mGluR2, é necessária a co-expressão do maquinário translacional projetado, que inclui uma tRNA sintetase modificada e um tRNA complementar (pIRE4-Azi) e mGluR2 contendo um códon âmbar na posição 548, criado usando mut...

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Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET

Este estudo apresenta um procedimento detalhado para realizar experimentos de transferência de energia de ressonância de fluorescência de molécula única (smFRET) em receptores acoplados à proteína G (GPCRs) usando marcação site-specific via incorporação de aminoácidos não naturais (UAA). O protocolo fornece um guia passo a passo para a preparação de amostras smFET, experimentos e análise de dados.

Visualizando a dinâmica conformacional de receptores de membrana usando FRET de molécula única

The ability of cells to respond to external signals is essential for cellular development, growth, and survival. To respond to a signal from the ...

Aqui, usamos FRET de molécula única e marcação de proteína site-specific através de uma incorporação natural de aminoácidos para estudar a dinâmica conformacional do mGluR2. Isso permite estudar a dinâmica da proteína sem perturbar a estrutura da proteína. A estrutura atômica fornece uma imagem estática de uma proteína.No entanto, o FRET de molécula única nos permite visualizar toda a gama de movimentos de proteínas em tempo real e solução. Este método pode ser aplicado para estudar a dinâmica de qualquer proteína. Além disso, uma incorporação natural de aminoácidos pode ser usada para estudar as interações proteína-proteína e a engenharia de receptores sintéticos.O carregamento de amostras e a otimização de imagens exigem paciência e prática. Para começar, marque os orifícios a serem perfurados na lâmina de vidro com um marcador. Use um Dremel para fazer pequenos furos no escorregador enquanto o escorregador é mergulhado em água.Sonicate as lâminas e cobrir deslizamentos em acetona por 30 minutos em um sonicator de banho a 23 graus Celsius. Elimine a acetona do slide e cubra os frascos deslizantes. Enxágue bem com água e sonicate em hidróxido de potássio de cinco molares por 30 minutos.Em seguida, lave as lâminas e cubra o deslizamento com água e sonicate em metanol por dois minutos. Deixe os frascos cheios de metanol até a etapa de salinização de aminoácidos. Despeje a mistura de salinização de aminoácidos recém-preparada na lâmina e cubra os frascos deslizantes.Incubar, sonicatar e novamente incubar as lâminas e cobrir as lâminas em uma mistura de salinização de aminoácidos antes de descartar a solução. Em seguida, lave os frascos com metanol antes de enchê-los com água. Em seguida, lave as lâminas com água.Seque-os com sopro de ar e coloque-os nas caixas de montagem. Aplique 60 mililitros de solução de PEGylation na lâmina e coloque uma tampa em cima dela. Marque o lado não PEGylated antes do armazenamento.Após a incubação, desmonte suavemente, enxágue as lâminas e cubra as lâminas com água. Em seguida, seque-os soprando ar e coloque-os em um tubo estéril de 50 mililitros com a superfície PEGylated virada para longe um do outro. Após a passagem das células HEK 293T com EDTA de tripsina a 0,05%, semear as células na cobertura de poli-L/D-lisina desliza.Coloque o meio padrão com o meio suplementado com AZP para células em crescimento e receptor metabotrópico de glutamato 2, ou expressão de mGluR2. Em seguida, transfecte as células com um reagente de transfecção e incube por 24 horas antes de mudar o meio com meio fresco suplementado com AZP. 20 minutos antes de rotular com corantes alquinos cianino, lave os boletins de cobertura duas vezes com Recording Buffer quente, ou RB, e coloque-os em um meio padrão quente sem AZP.Em seguida, remova o meio padrão e lave as células com RB antes de adicionar a solução de rotulagem recém-preparada. Incubar por 15 minutos a 37 graus Celsius no escuro. Após a incubação, retire a solução de rotulagem.Lave a folha de cobertura contendo células transfectadas duas vezes com o RB e volte a suspender no mesmo meio. Em seguida, exija as células girando a 1.000 g a quatro graus Celsius por cinco minutos e remova o sobrenadante antes de ressuspender o pellet em 80 a 130 microlitros da solução de lise. Quebre o pellet por pipeta.Em seguida, envolva-o em papel alumínio e coloque-o no balancim a quatro graus Celsius por 30 minutos a uma hora para lisar as células. Pellet a fracção insolúvel por centrifugação a 20 000 g e quatro graus Celsius durante 20 minutos. Em seguida, transfira o sobrenadante para um tubo frio fresco e armazene-o no gelo.Remova o slide e o deslizamento da tampa do congelador e deixe-os aquecer à temperatura ambiente no escuro. Monte a câmara colocando as tiras de fita dupla face entre o deslizamento e o deslizamento da tampa, garantindo que as superfícies PEGylated formem o interior da câmara de fluxo. Usando uma ponta de pipeta, pressione a folha de tampa para garantir que a fita esteja em contato com a folha de tampa e deslize.Aplique epóxi nas bordas do slide. Aplique 40 microlitros de NeutrAvidin 500-nanomolar em cada pista e incube dentro de uma caixa escura umidificada. Após dois minutos, lave cada pista da câmara com 100 microlitros de tampão T50.Em seguida, adicione 20 solução de anticorpos biotinilados nanomolares e incube por 30 minutos antes de lavar com 200 microlitros de tampão T50 por pista. Ligue o computador e o microscópio. Em seguida, ligue os lasers para aquecer.Em seguida, ligue a câmera EMCCD e abra o software. Monte a câmara de amostra no estágio de microscópio e adicione a amostra de proteína gradualmente para atingir aproximadamente 400 moléculas por campo de visão. Lave a câmara com 100 microlitros de tampão de imagem suplementado com 0,3 unidades de protocatecuato 3, 4-dioxigenase.Ajuste o ganho, a taxa de aquisição e as potências do laser para detectar sinais de fluorescência de molécula única nos canais doador e aceitador. Em seguida, excite o doador e adquira vestígios de tempo até que 80% das moléculas doadoras no campo de visão sejam fotobranqueadas. No final do filme, ligue o laser de 640 nanômetros para excitar diretamente o aceitador até que algumas das moléculas sejam fotobranqueadas.Altere o campo de visão e repita as etapas para excitação do doador e do aceitador para coletar três filmes por condição. Para selecionar traços FRET de molécula única de coleta de partículas, selecione os traços em que a intensidade total dos traços do doador e do aceitador é estável ao longo do tempo. Em seguida, selecione os traços com mudanças anti-correlacionadas nas intensidades do doador e do aceitador.Selecione as moléculas doadoras e receptoras que mostram fotobranqueamento de passo único e vestígios com mais de cinco segundos de duração. Calcule a deficiência de FET. Finalmente, identifique o estado conformacional pela Modelagem Oculta de Markov, ou HMM, seguindo as etapas descritas no manuscrito.A marcação do AZP por corantes de cianina foi obtida por uma reação de cicloadição catalisada por cobre e resultou em marcação efetiva da membrana plasmática de 548UAA com a população da superfície celular marcada com fluoróforos doadores e aceitadores. Na eletroforese SDS-PAGE, uma única banda a 250 kilodalton foi observada em células HEK 293T expressando 548UAA, que coincidiu com o mGluR2 dimérico de comprimento total. Traços seletivos representativos para múltiplos eventos de branqueamento de curta e longa duração para doadores e aceitadores são mostrados aqui.Os estados conformacionais foram identificados por meio da análise HMM. Transições entre estados FRET discretos foram extraídas dos ajustes idealizados e plotadas como um mapa de calor de densidade de transição. Os traços idealizados do FRET também fornecem informações sobre o tempo de permanência para cada confirmação identificada.Os traços da molécula única com o canal doador e aceitador são mostrados aqui. Além disso, a FRET de molécula única revela quatro estados conformacionais do domínio rico em cisteína mGluR2. A preservação eficiente do pico é essencial para a retirada de uma única molécula, e deve-se tomar cuidado durante esse processo.Além disso, o agente eliminador de oxigênio deve ser adicionado imediatamente antes da imagem. Este método de marcação e experimentos FRET de molécula única foram aplicados a múltiplos receptores e forneceram novos insights sobre o mecanismo de ativação do receptor e modulação da função do receptor.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Única molécula-Super-Resolution Imaging da fosfatidilinositol 4,5-bifosfato na membrana plasmática com o romance fluorescentes Sondas

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Bioquímica

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Informação estrutural de uma única molécula de FRET experimentos usando a Nano-posicionamento sistema rápido

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

FRET de alta precisão em nível de molécula única para determinação de estrutura de biomoléculas

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Manipulação de único-molécula de G-quadruplexes por pinça magnética

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Usando três cores único-molécula FRET para estudar a correlação de interações da proteína

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Definição da atividade de chaperona regulada por redox de Hsp33 e mapeamento de alterações conformacionais em Hsp33 usando espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Quantificação de Proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...