Automatisert analyse av intracellulære fenotyper av Salmonella ved bruk av ImageJ

Denne fluorescensmikroskopimetoden kvantifiserer salmonellafenotyper inne i tarmepitelceller på en automatisert måte, noe som gjør det mulig å studere salmonella på et stort antall stammer med skalerbar oppløsning. Vår metode har fordelen av å være kvantitativ, høy gjennomstrømning og automatisert samtidig, avhengig av både et område og en enkeltcelleanalyse. Den intracellulære oppførselen er sentral for vertspatogeninteraksjonen til mange bakterier.

Vår metode kan enkelt tilpasses andre bakterielle patogener enn salmonella, noe som bidrar til forståelsen av deres patogenese. Etter å ha anskaffet bildene, utfør enkeltcelleanalyse ved å åpne oppkjøpet. czi-fil i ImageJ.

Del kanalene ved å klikke på bildet og velge Farge, etterfulgt av Del kanaler. For cellesegmentering velger du bildet av Z-planet i tittelvinduet for C1-anskaffelse. Velg tittelvinduet C1 og klikk på bildet etterfulgt av duplikatet.

Skriv deretter nummeret på det valgte Z-planet. Skriv C1Zplane i tittelboksen, fjern merket for Duplikat-stakken, og klikk OK for å duplisere bare det valgte Z-planbildet. Et vindu kalt C1Zplane som viser det valgte Z-planbildet åpnes.

Forbedre nå bildekontrasten til det oppnådde C1Zplane-bildet ved å velge Prosess og klikke på Forbedre kontrast. Juster de mettede bildepunktene, merk av for Normaliser, og klikk OK for å bruke kontrastforbedringsteknikken for å få et kontrastnormalisert C1Zplane-bilde. Gå til Prosess og klikk Finn Maxima for å segmentere epitelcellene i kontrastnormalisert C1Zplane-bilde.

Hvis du deretter bare vil tilordne ett maksimumspunkt til hver epitelcelle, flagger du valget av forhåndsvisningspunkt og angir støytoleransen. Hvis du vil hente det C1Zplane-segmenterte bildet, et nytt binært maskelignende bilde som viser hver segmenterte partikkel per maksimumspunkt merket, flagger du Ekskluder kantmaksimum, velger de segmenterte partiklene som Utdatatype og klikker OK. Deretter oppretter du en maske med segmenterte celler i det C1Zplane-segmenterte bildet. Klikk på Analyser, etterfulgt av Analyser partikler, og velg deretter alternativene Vis masker og Utelat på kanter.

Angi størrelsesintervallet og klikk OK for å hente masken til C1Zplane-segmentert binærmaske. Klikk oppslagstabellen, og velg Inverter oppslagstabell på verktøylinjen. For å begrense det kontrastnormaliserte C1Zplane-bildet, gå til bildet, velg Juster, velg Terskel og sjekk den mørke bakgrunnen.

Sett innstillingen for automatisk terskel til standard, og velg det røde alternativet. Juster minimumsgrenseverdien til cellene vises helt røde, og etterlater en mørk bakgrunn. Klikk på Bruk for å konvertere det kontrastnormaliserte C1Zplane-bildet til et binært bilde med celler i hvitt og bakgrunnen i svart.

Videre, for å korrigere cellesegmenteringen i masken til C1Zplane-segmentert binærmaske, velg Prosess og klikk på Bildekalkulatoren. Velg deretter masken til C1Zplane segmentert som bilde én, velg operasjonen AND i rullegardinlisten, og velg den terskelerte kontrastnormaliserte C1Zplane som bilde to. Klikk OK og ImageJ vil automatisk navngi utdatabildet som resultater av Mask of C1Zplane Segmentert.

Hvis du vil merke hver enkelt segmentert celle i C1Zplane som et interesseområde, klikker du Analyser, etterfulgt av Analyser partikler. Juster størrelsen som vist tidligere, og velg alternativet vis ingenting. Legg til alle partiklene i ROI Manager-verktøyet ved å merke av for Legg til i manager.

Sjekk også Ekskluder på kanter og klikk OK. Lagre ROI-dataene som roi-cells-acquisitiontitle. zip gjennom ROI Manager-menyen ved å klikke på Mer og velge Lagre. Etter å ha fullført cellesegmenteringen, arbeid på C2-anskaffelsestittelvinduet for å analysere vacuolar salmonella.

Gå først til Prosess, klikk på Bildekalkulator, velg C2-anskaffelsestittelen som bilde en, og velg operasjonen Trekk fra i rullegardinlisten. Velg deretter C3-anskaffelsestittelen som bilde to, merk av for Opprett nytt vindu og klikk OK. Bruk subtraksjon på hele Z-stakken ved å klikke Ja i prosessstakkvinduet. Dupliser resultatene av tittelvinduet for C2-anskaffelse ved å klikke på Bilde-menyen og velge Dupliser.

Kontroller deretter duplikatstakken og trykk OK for å få resultatene av C2-anskaffelsestittel ett vindu. Bruk Gaussisk uskarphet på resultatene av C2-anskaffelsestittel ett vindu ved å gå til prosessen, klikke filteret og velge Gauss-uskarphet. La Sigma-verdien være to eller tilpass den.

Klikk på OK og bruk Gauss-uskarphet på hele Z-stakken ved å klikke Ja i prosessstabelvinduet. Trekk de gaussiske filtrerte resultatene av C2-anskaffelsestittel én til resultatene av C2-anskaffelsestittelen ved å klikke på Prosess og velge Bildekalkulatoren. Velg nå resultatene av C2-anskaffelsestittelen som bilde én, velg operasjonen Trekk fra i rullegardinlisten, velg resultatene av C2-anskaffelsestittel én som bilde to, og klikk OK. Bruk subtraksjon på hele Z-stakken ved å klikke Ja i prosessstakkvinduet for å få et vindu automatisk navngitt av ImageJ som resultatene av C2-anskaffelsestittelen.

Hvis du vil skille salmonella fra bakgrunnen av resultatene av C2-oppkjøpstittelen, klikker du på bildet, velger Juster og klikker på terskelen. Kontroller deretter den mørke bakgrunnen og sett autoterskelen til Otsu. Juster minimumsgrenseverdien til salmonellae ser helt rød ut, og etterlater en mørk bakgrunn.

Klikk på Bruk og et vindu som heter Konverter til binær åpnes. Sjekk den svarte bakgrunnen og klikk på OK. Velg det midterste Z-planet som tilsvarer det intracellulære salmonellaefokusplanet i resultatene av C2-oppkjøpstittelens binære vindu. Klikk på bildet etterfulgt av Stabler, og velg deretter Angi stykke.

Skriv nå nummeret på det valgte Z-planet og klikk OK. Deretter angir du målingene til å registreres for hver avkastning ved å klikke på Analyser og velge Angi måling. Kontroller deretter området som tilsvarer det totale arealet for hver avkastning. Hvis du vil registrere områdebrøken som opptas av terskelbildepunkter for hver avkastning, kontrollerer du områdebrøken og grensen til-terskelen.

Kontroller displayetiketten for å merke hver eneste avkastning med bildetittel, kanal, Z-plan og X/Y-koordinater. Bruk det valgte Z-planet for intracellulære salmonellaer til plateselskaper, areal og prosentvis areal okkupert av salmonella for hver enkelt celle. Åpne roi-cells-acquisitiontitle.

zip-fil ved å klikke på Fil-menyen og velge Åpne. Klikk deretter på Mål i ROI Manager-menyen. Resultatet er en tabell som rapporterer de valgte målingene.

Til slutt lagrer du resultattabellen ved å velge filen og klikke på Lagre som i resultatvinduet. Den cellulære invasjonen, den vacuolære belastningen og den cytosoliske hyperreplikasjonen av salmonella ble visualisert inne i epitelceller. Områdeanalysen viste et signifikant høyere infeksjonsforhold i Salmonella typhimurium sammenlignet med begge Salmonella derbystammer, og demonstrerte effekten av områdeanalyse for å oppdage forskjeller i salmonellastammers evne til å kolonisere epitelceller.

Salmonella derby sipA-slettet mutantstamme viste et redusert hyperreplikasjonsforhold sammenlignet med Salmonella derby villtype, i samsvar med sipAs rolle i å indusere hyperreplikasjon. Ingen hyperreplikasjonsforskjell ble observert mellom Salmonella typhimurium og Salmonella derby villtype. Encelleanalysen viste ingen signifikant forskjell i prosentandelen infiserte celler i Salmonella derbystammer sammenlignet med Salmonella typhimurium.

Ellers genererte Salmonella derbystammer en gjennomsnittlig vacuolar belastning betydelig lavere enn Salmonella typhimurium. Ingen forskjell ble observert mellom Salmonella typhimurium og Salmonella derby villtype, mens Salmonella derby sipA viste en signifikant reduksjon i hyperreplikasjon, i samsvar med resultatet av områdeanalysen. Salmonella inneholder flere serovarer med variert virulens.

Å undersøke et stort antall stammer ved hjelp av denne raske og automatiserte metoden bidrar betydelig til å forstå dette patogenets virkelige virulenspotensial.