Name: polysome purification from soybean symbiotic nodules
Uploaded: 2022-07-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules at JoVE.com

تم تمويل هذا البحث من قبل منحة CSIC I + D 2020 رقم 282 ، ومنحة FVF 2017 رقم 210 ، و PEDECIBA (ماريا مارثا ساينز).

1. نمو النبات وتلقيح الجذور
<ol><li>لتوليد العقيدات المطلوبة ، زرع بذور فول الصويا المفضلة في الركيزة المختارة في غرفة النمو في ظل ظروف خاضعة للرقابة. ملاحظة: في هذا البروتوكول ، زرعت البذور في زجاجة بلاستيكية سعة 0.5 لتر مملوءة بمزيج من الرمل: الفيرميكوليت (1: 1). تم ضبط غرفة النمو مع د...

<ol>
	<li>Limpens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-+and+tissue-specific+transcriptome+analyses+of+Medicago+truncatula+root+nodules.">Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules.</a> PLoS ONE. 8 (5), 64377 (2013).</li><li>Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+nitrogen-fixing+symbiosis+with+legumes:+How+many+rhizobium+recipes.">Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes: How many rhizobium recipes.</a> Trends in Microbiology. 17 (10), 458-466 (2009).</li><li>King, H. A., Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translatome+profiling:+Methods+for+genome-scale+analysis+of+mRNA+translation.">Translatome profiling: Methods for genome-scale analysis of mRNA translation.</a> Briefings in Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2014).</li><li>Chass&#233;, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).</li><li>Y&#225;ng&#252;ez, E., Castro-Sanz, A. B., Fern&#225;ndez-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genome-wide+changes+in+the+translatome+of+Arabidopsis+seedlings+subjected+to+heat+stress.">Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress.</a> PloS ONE. 8 (8), 71425 (2013).</li><li>Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+new+world+of+the+genome+with+DNA+microarrays.">Exploring the new world of the genome with DNA microarrays.</a> Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).</li><li>Krishnamurthy, A., Ferl, R. J., Paul, A. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+RNA-Seq+and+microarray+gene+expression+data+in+two+zones+of+the+Arabidopsis+root+apex+relevant+to+spaceflight.">Comparing RNA-Seq and microarray gene expression data in two zones of the Arabidopsis root apex relevant to spaceflight.</a> Applications in Plant Sciences. 6 (11), 1197 (2018).</li><li>Shulse, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+transcriptome+profiling+of+plant+cell+types.">High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types.</a> Cell Reports. 27 (7), 2241-2247 (2019).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+A+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Kawaguchi, R., Girke, T., Bray, E. A., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+mRNA+translation+contributes+to+gene+regulation+under+non-stress+and+dehydration+stress+conditions+in+Arabidopsis+thaliana.">Differential mRNA translation contributes to gene regulation under non-stress and dehydration stress conditions in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 38 (5), 823-839 (2004).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).</li><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+regulation+of+protein+abundance+from+proteomics+and+transcriptomis+analyses.">Insights into regulation of protein abundance from proteomics and transcriptomis analyses.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2013).</li><li>Tebaldi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+uncoupling+between+transcriptome+and+translatome+variations+after+a+stimulus+in+mammalian+cells.">Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells.</a> BMC Genomics. 13 (220), 1-15 (2012).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+mRNAs+strongly+correlate+to+proteins+in+a+multivariate+manner+and+their+translation+ratios+are+phenotype+specific.">Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific.</a> Nucleic Acids Research. 41 (9), 4743-4754 (2013).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+New+views+of+translation,+from+single+codons+to+genome+scale.">Ribosome profiling: New views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).</li><li>Lukoszek, R., Feist, P., Ignatova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+adaptive+response+of+Arabidopsis+thaliana+to+prolonged+thermal+stress+by+ribosomal+profiling+and+RNA-Seq.">Insights into the adaptive response of Arabidopsis thaliana to prolonged thermal stress by ribosomal profiling and RNA-Seq.</a> BMC Plant Biology. 16 (1), 1-13 (2016).</li><li>Broughton, W. J., Dilworth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+leghaemoglobin+synthesis+in+snake+beans.">Control of leghaemoglobin synthesis in snake beans.</a> Biochemical Journal. 125 (4), 1075-1080 (1971).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+An+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).</li><li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondenaturing+agarose+gel+electrophoresis+of+RNA+nondenaturing+agarose+gel+electrophoresis+of+RNA.">Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), 1-3 (2012).</li><li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., K&#228;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+Summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Marcel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>. Sickle: A sliding-window, adaptive, quality-based trimming tool for FastQ files (Version 1.33) Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/najoshi/sickle">https://github.com/najoshi/sickle</a> (2011)</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+Accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14 (4), 1-13 (2013).</li><li>Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmon+provides+fast+and+bias-aware+quantification+of+transcript+expression.">Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression.</a> Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).</li><li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=featureCounts:+An+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features.">featureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+A+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (550), 1-21 (2014).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).</li><li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Galaxy+platform+for+accessible,+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses:+2018+update.">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update.</a> Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).</li><li>Hunt, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEOexplorer:+A+webserver+for+gene+expression+analysis+and+visualisation.">GEOexplorer: A webserver for gene expression analysis and visualisation.</a> Nucleic Acids Research. , (2022).</li><li>Imbeaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1-12 (2005).</li><li>Di Paolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDCD4+regulates+axonal+growth+by+translational+repression+of+neurite+growth-related+genes+and+is+modulated+during+nerve+injury+responses.">PDCD4 regulates axonal growth by translational repression of neurite growth-related genes and is modulated during nerve injury responses.</a> RNA. 26 (11), 1637-1653 (2020).</li><li>Smircich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+translation+control+as+a+key+mechanism+generating+differential+gene+expression+in+Trypanosoma+cruzi.">Ribosome profiling reveals translation control as a key mechanism generating differential gene expression in Trypanosoma cruzi.</a> BMC Genomics. 16 (1), 443 (2015).</li><li>Eastman, G., Sharlow, E. R., Lazo, J. S., Bloom, G. S., Sotelo-Silveira, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+and+translatome+regulation+of+pathogenesis+in+Alzheimer's+disease+model+mice.">Transcriptome and translatome regulation of pathogenesis in Alzheimer's disease model mice.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 86 (1), 365-386 (2022).</li><li>Zanetti, M. E., Chang, I. -. F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopurification+of+polyribosomal+complexes+of+Arabidopsis+for+global+analysis+of+gene+expression.">Immunopurification of polyribosomal complexes of Arabidopsis for global analysis of gene expression.</a> Plant physiology. 138 (2), 624-635 (2005).</li><li>Mustroph, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis.">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18843-11848 (2009).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+the+what,+when,+where+and+how+of+protein+synthesis.">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 16 (11), 651-664 (2015).</li><li>Eastman, G., Smircich, P., Sotelo-Silveira, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+ribosome+footprints+to+understand+translation+at+a+genome+wide+level.">Following ribosome footprints to understand translation at a genome wide level.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 167-176 (2018).</li><li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host.">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 618-630 (2012).</li></ol>

تعد دراسة تنظيم التعبير الجيني على المستوى الانتقالي أمرا بالغ الأهمية لفهم العمليات البيولوجية المختلفة بشكل أفضل لأن نقطة النهاية للتعبير الجيني للخلية هي وفرة البروتين13,14. يمكن تقييم ذلك من خلال تحليل translatome للنسيج أو الكائن الحي محل الاهتمام الذي يجب ?...

يمكن للنباتات البقولية ، مثل فول الصويا (Glycine max) ، أن تنشئ تكافلا مع بكتيريا تربة محددة تسمى ريزوبيا. هذه العلاقة المتبادلة تثير تشكيل أعضاء جديدة ، العقيدات التكافلية ، على جذور النباتات. العقيدات هي الأعضاء النباتية التي تستضيف البكتيريا وتتكون من خلايا مضيفة يستعمر السيتوبلازم الخاص بها مع شكل متخصص من الجذور يسمى البكتيريا. تحفز هذه البكتيريا على تقليل النيتروجين الجوي (N 2) إلى الأمونيا ، والتي يتم نقلها إلى النبات مقابل الكربوهيدرات 1,2.
على الرغم من أن هذا التكافل المثبت للنيتروجين هو واحد من أكثر التكافل بين النبات والميكروبات دراسة جيدة ، إلا أنه لا يزال يتعين فهم العديد من الجوانب بشكل أفضل ، مثل كيفية قيام النباتات المعرضة لظروف الإجهاد اللاأحيائي المختلفة بتعديل تفاعلها مع شريكها التكافلي وكيف يؤثر ذلك على استقلاب العقيدات. ويمكن فهم هذه العمليات بشكل أفضل من خلال تحليل ترانسلاتوم العقيدات (أي المجموعة الفرعية من الحمض النووي الريبي المرسال [mRNAs] التي تترجم بنشاط). البولي ريبوسومات أو البوليسومات هي مجمعات من الريبوسومات المتعددة المرتبطة بالحمض النووي الريبوزي المرسال ، وتستخدم عادة لدراسة الترجمة3. تتكون طريقة التنميط المتعدد من تحليل الحمض النووي الريبوزي المرسال المرتبط ب polysomes وقد تم استخدامه بنجاح لدراسة آليات ما بعد النسخ التي تتحكم في التعبير الجيني الذي يحدث في العمليات البيولوجية المتنوعة 4,5.
تاريخيا ، ركز تحليل التعبير الجيني في المقام الأول على تحديد وفرة الحمض النووي الريبوزي المرسال6،7،8،9. ومع ذلك ، هناك نقص في العلاقة بين مستويات النسخ والبروتين بسبب المراحل المختلفة لتنظيم ما بعد النسخ للتعبير الجيني ، وخاصة الترجمة 10،11،12. علاوة على ذلك ، لم يلاحظ أي اعتماد بين التغييرات على مستوى النسخ وتلك التي تحدث على مستوى translatome13. يسمح التحليل المباشر لمجموعة الحمض النووي الريبوزي المرسال التي يتم ترجمتها بقياس أكثر دقة واكتمالا للتعبير الجيني للخلية (الذي تكون نقطة نهايته وفرة البروتين) من ذلك الذي تم الحصول عليه عندما يتم تحليل مستويات الحمض النووي الريبوزي المرسال فقط14،15،16.
يصف هذا البروتوكول كيفية تنقية البوليسومات المشتقة من النباتات من عقيدات فول الصويا السليمة عن طريق الطرد المركزي التفاضلي من خلال وسادة السكروز المكونة من طبقتين (الشكل 1). ومع ذلك ، نظرا لأن الريبوسومات المشتقة من البكتيريا موجودة أيضا في العقيدات ، يتم تنقية مزيج من أنواع الريبوسومات والحمض النووي الريبي ، على الرغم من أن الأنواع حقيقية النواة تمثل الجزء الرئيسي (90٪ -95٪). كما يتم وصف عزل الحمض النووي الريبي اللاحق ، والقياس الكمي ، ومراقبة الجودة (الشكل 1). يجب أن يوفر هذا البروتوكول ، بالاقتران مع RNA-seq ، نتائج تجريبية حول التنظيم الانتقالي للحمض النووي الريبي المرسال حقيقيات النواة في نسيج معقد مثل العقيدات التكافلية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64269/64269fig01.jpg"> الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على المنهجية المقترحة لتنقية تنقية الصبغات متعددة حقيقيات النواة من العقيدات التكافلية. يقدم المخطط لمحة عامة عن الخطوات المتبعة في البروتوكول من (1) نمو النبات و (2) حصاد العقيدات إلى (3) إعداد المستخلصات الخلوية ، (3) الحصول على عينات TOTAL و (4) عينات PAR ، و (5) استخراج الحمض النووي الريبي ومراقبة الجودة. الاختصارات: PEB = مخزن مؤقت لاستخراج polysome ؛ RB = المخزن المؤقت لإعادة التعليق; المجموع = إجمالي الحمض النووي الريبي. PAR = الحمض النووي الريبوزي المرسال المرتبط بالبوليسومات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64269/64269fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plant growth and rhizobia inoculation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Daihan Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Model SHO-1D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YEM-medium</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J850 (yeast extract) 0122 (mannitol)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water deficit treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>221295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porometer</td>
			<td>Decagon Device</td>
			<td></td>
			<td>Model SC-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of cytosolic extracts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij L23</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Model 2K15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloranphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA 360</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tissue grinder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12649595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15504-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing dish&#160;</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>1911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of sucrose cushions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 40 Ti rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Optima L-100K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td>13.2 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction and quality control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>DI</td>
			<td>41191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Dorwil</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>3032-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10814-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol LS</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>102960028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>10-0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 10 &#181;L</td>
			<td>BioPointe Scientific</td>
			<td>321-4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 1000 &#181;L</td>
			<td>BioPointe Scientific</td>
			<td>361-1050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 20 &#181;L</td>
			<td>BioPointe Scientific</td>
			<td>341-4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 200 &#181;L</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>528104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>500020-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing company</td>
			<td>Macrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 250 mL flask</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>4110207</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome purification from soybean symbiotic nodules

الهدف من هذا البروتوكول هو توفير استراتيجية لدراسة ترانسلاتوم حقيقيات النواة للعقيدات التكافلية لفول الصويا (الجلايسين ماكس). تصف هذه الورقة الطرق المحسنة لعزل البوليريبوسومات المشتقة من النباتات والحمض النووي الريبوزي المرسال المرتبط بها ليتم تحليلها باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي. أولا ، يتم الحصول على التحلل السيتوبلازمي من خلال التجانس في ظروف الحفاظ على الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي من عقيدات فول الصويا الكاملة المجمدة. بعد ذلك ، يتم مسح الليزات عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة ، ويتم استخدام 15٪ من المادة الفائقة لعزل الحمض النووي الريبي الكلي (TOTAL). يتم استخدام المحللات المتبقية التي تم تطهيرها لعزل البوليسومات عن طريق الطرد المركزي الفائق من خلال وسادة السكروز المكونة من طبقتين (12٪ و 33.5٪). يتم تنقية الحمض النووي الريبوزي المرسال المرتبط بالبوليسومات (PAR) من الكريات متعددة الصبغيات بعد إعادة التعليق. يتم تقييم كل من TOTAL و PAR بواسطة الرحلان الكهربائي الشعري عالي الحساسية لتلبية معايير الجودة لمكتبات التسلسل ل RNA-seq. كمثال على تطبيق المصب ، بعد التسلسل ، يمكن استخدام خطوط الأنابيب القياسية لتحليل التعبير الجيني للحصول على جينات معبر عنها بشكل تفاضلي على مستويات النسخ و translatome. باختصار ، تسمح هذه الطريقة ، بالاقتران مع RNA-seq ، بدراسة التنظيم الانتقالي للحمض النووي الريبي المرسال حقيقيات النواة في نسيج معقد مثل العقيدات التكافلية.

يعد تقييم كمية ونوعية كسور TOTAL و PAR التي تم تنقيتها بالإجراء المذكور أعلاه أمرا أساسيا لتحديد نجاحها ، حيث أنه بالنسبة لمعظم التطبيقات النهائية ، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي ، تعد العينات عالية الجودة أساسية لإعداد المكتبة وتسلسلها. علاوة على ذلك ، تسمح سلامة جزيئات الحمض النووي الريبي ?...

Watch this Scientific Journal Video about Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules at JoVE.com

Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules

يصف هذا البروتوكول طريقة لتنقية متعدد حقيقيات النواة من عقيدات فول الصويا السليمة. بعد التسلسل ، يمكن استخدام خطوط الأنابيب القياسية لتحليل التعبير الجيني لتحديد الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي على مستويات النسخ و translatome.

تنقية بوليسوم من العقيدات التكافلية لفول الصويا

The aim of this protocol is to provide a strategy for studying the eukaryotic translatome of the soybean (Glycine max) symbiotic nodule. This paper ...

هذا البروتوكول مهم لأنه ، على حد علمنا ، أول بروتوكول يصف معدنا جديدا قائما على أجهزة الطرد المركزي لتنقية البوليسوم الحركي من العقيدات التكافلية لفول الصويا. الميزة الكبيرة لهذه التقنية هي أنه بالاشتراك مع RNA-Seq ، يسمح بدراسة العلاقة وتنظيمها في نسيج معقد مثل العقيدات التكافلية. للبدء ، وزن حوالي 0.2 جرام من العقيدات السليمة في طبق وزن ، ونقلها إلى أنبوب ملليلتر مبرد مسبقا.ثم أضف 1.2 ملليلتر من المخزن المؤقت لاستخراج polysome ، واترك العينة تذوب لمدة دقيقتين ، وتجانس مع مطحنة الأنسجة حتى التعطيل الكامل والتجانس للعقيدات. بعد ذلك ، احتضن العينات على الجليد بإثارة لطيفة لمدة 10 دقائق أو حتى تتم معالجة جميع العينات وأجهزة الطرد المركزي بسرعة 16،000 مرة من الغرام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية لتكسير الحطام. ثم ، قم باستعادة supernatant ، وكرر خطوة جهاز الطرد المركزي.بعد استعادة مستخلص الخلايا المصفاة بعناية ، قم بنقل أليكوت 200 ميكرولتر إلى أنبوب طرد مركزي صغير نظيف 1.5 ملليلتر للعزل التام. ثم ، صب 4.5 ملليلتر من طبقة السكروز 33.5 ٪ في أنابيب أجهزة الطرد المركزي ، وإضافة 4.5 ملليلتر من طبقة 12 ٪ بعناية وببطء مع ماصة دقيقة P-1000. بعد ذلك ، ضع الأنابيب على الجليد حتى إضافة مستخلص الخلايا المصفح.قم بتحميل ملليلتر واحد من مستخلص السيتوسوليك المصفى فوق وسادة السكروز عن طريق السحب بعناية على الجدار الجانبي للأنبوب. بعد ذلك ، انقل أنابيب أجهزة الطرد المركزي الفائقة إلى دلاء مبردة مسبقا ، وأجهزة طرد مركزي عند 217،874 جم لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية. بعد التخلص من المستخلص الخلوي المتبقي ووسادة السكروز ، أعد تعليق الكريات متعددة الصبغيات مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المبرد مسبقا لإعادة التعليق.بعد ذلك ، احتضن لمدة 30 دقيقة على الجليد ، ثم انقل إعادة التعليق المتعدد الصبغيات إلى أنابيب مبردة مسبقا بمقدار 1.5 ملليلتر للمضي قدما في استخراج الحمض النووي الريبي. بعد تجانس العينات مع 750 ميكرولتر من كاشف عزل الحمض النووي الريبي تحضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم ، أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم البارد ، وهز الأنابيب بقوة لمدة 15 ثانية.بعد ذلك ، احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. جهاز طرد مركزي بسرعة 12،000 مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية لفصل الطور ، ونقل 500 ميكرولتر من المرحلة المائية العليا إلى أنبوب نظيف دون إزعاج المرحلة العضوية الوردية. ثم ، أضف 375 ميكرولتر من الأيزوبروبانول البارد و 0.5 ميكرولتر من الجليكوجين الخالي من الحمض النووي الريبي.بعد ذلك ، اخلطي جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. احتضن المزيج لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، وجهاز طرد مركزي عند 12000 مرة G لمدة 15 دقيقة. ثم ، تخلص من supernatant ، واغسل راسب الحمض النووي الريبي مع ملليلتر واحد من الإيثانول البارد ، 75٪.مزيج عن طريق دوامة قصيرة. بعد ذلك ، جهاز طرد مركزي عند 7،500 غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت ، وجفف حبيبات الحمض النووي الريبي في الهواء.ثم ، قم بإذابة الكريات في 50 ميكرولتر من الماء الحر للحمض النووي الريبي ، واحتضنها عند 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. قم بتقييم تركيز الحمض النووي الريبي وسلامته باستخدام الرحلان الكهربائي الشعري عالي الحساسية ، أو الرحلان الكهربائي على هلام أغاروز خال من الحمض النووي الريبي بنسبة 2٪. بعد تقدير حجم العينة ، أضف 0.1 حجم من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولية ، وثلاثة أحجام من الإيثانول البارد ، و 0.5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي ، الجليكوجين الحر.ثم امزجها جيدا. تم إجراء الرحلان الكهربائي الشعري للعديد من أجزاء عينة الحمض النووي الريبي المرتبطة الكلية والمتعددة الصبغيات ، والتي أظهرت نطاقات الحمض النووي الريبوسومي الحادة ، دون أي مظهر ملطخ. ومع ذلك ، لا ينعكس هذا في قيم RIN ، لأنها تتراوح بين 5.9 و 7.5 ، والتي تتوافق مع العينات غير السليمة.فشل المحلل الحيوي في تحديد قمم 18S و 25S كما هو موضح في الفيروجرامات الكهربائية ، سواء بالنسبة لعينات الحمض النووي الريبي المرتبطة الكلية أو المتعددة. ولم تكن هناك أي علامة مرئية على تدهور العينة. ومع ذلك ، تم تحليل عينة لتصور نتيجة عينة متدهورة بالكامل تقريبا ، للمقارنة.الشيء الأكثر أهمية هو العمل في ظروف الحفاظ على الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي خلال البروتوكول بأكمله. بعد تسلسل الكسور الكلية والاسمية للحمض النووي الريبي يمكن استخدام الأنماط القياسية للتعبير الجيني الذي تم تحليله لتحديد الجينات التعبيرية التفاضلية على مستوى النسخ والترجمة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

اشتقاق خلايا القلب السلف من الخلايا الجذعية الجنينية

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

الكمي ثلاثي الأبعاد من شجيري العمود الفقري من الخلايا العصبية الهرمية المستمدة من صنع الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

طريقة سريعة وفعالة لتنقية خلايا الأديم المولدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

إنشاء خلايا التكاثري رباعي الصيغة الصبغية من Nontransformed الخلايا الليفية الإنسان

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

عزل فعال من الجزر وظيفية من الأطفال حديثي الولادة البنكرياس ماوس

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

نهج موحد لتنقية مولتبيسيسيز من الثدييات خلايا الجرثومية الذكور من الأنسجة الميكانيكية التفكك والتدفق الخلوي

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

التصوير التقدمي الإفراج عن القرص الجناح دروفيا

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) للتحقيق في تطوير جذر Arabidopsis thaliana على مقياس نوع الخلية الخاصة

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

جيل من الساذج Blastoderm Explants من أجنة زيبرافيش

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos

عزل الخلايا البدائية عن أجنة الدجاج اللاحم

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. ...