Name: polysome purification from soybean symbiotic nodules
Uploaded: 2022-07-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules at JoVE.com

Dit onderzoek werd gefinancierd door CSIC I+D 2020 subsidie nr. 282, FVF 2017 subsidie nr. 210 en PEDECIBA (María Martha Sainz).

1. Plantengroei en rhizobia-inenting
<ol><li>Om de benodigde knobbeltjes te genereren, zaait u de sojabonenzaden van keuze in het geselecteerde substraat in een groeikamer onder gecontroleerde omstandigheden. OPMERKING: In dit protocol werden zaden gezaaid in een plastic fles van 0,5 L gevuld met een mengsel van zand: vermiculiet (1: 1). De groeikamer werd ingesteld met een dag/nachtcyclustemperatuur van respectievelijk 28 °C /20 °C en een licht/donkerheid fotoperiode van respectievelijk 16 h/8 h....

<ol>
	<li>Limpens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-+and+tissue-specific+transcriptome+analyses+of+Medicago+truncatula+root+nodules.">Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules.</a> PLoS ONE. 8 (5), 64377 (2013).</li><li>Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+nitrogen-fixing+symbiosis+with+legumes:+How+many+rhizobium+recipes.">Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes: How many rhizobium recipes.</a> Trends in Microbiology. 17 (10), 458-466 (2009).</li><li>King, H. A., Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translatome+profiling:+Methods+for+genome-scale+analysis+of+mRNA+translation.">Translatome profiling: Methods for genome-scale analysis of mRNA translation.</a> Briefings in Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2014).</li><li>Chass&#233;, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).</li><li>Y&#225;ng&#252;ez, E., Castro-Sanz, A. B., Fern&#225;ndez-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genome-wide+changes+in+the+translatome+of+Arabidopsis+seedlings+subjected+to+heat+stress.">Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress.</a> PloS ONE. 8 (8), 71425 (2013).</li><li>Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+new+world+of+the+genome+with+DNA+microarrays.">Exploring the new world of the genome with DNA microarrays.</a> Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).</li><li>Krishnamurthy, A., Ferl, R. J., Paul, A. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+RNA-Seq+and+microarray+gene+expression+data+in+two+zones+of+the+Arabidopsis+root+apex+relevant+to+spaceflight.">Comparing RNA-Seq and microarray gene expression data in two zones of the Arabidopsis root apex relevant to spaceflight.</a> Applications in Plant Sciences. 6 (11), 1197 (2018).</li><li>Shulse, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+transcriptome+profiling+of+plant+cell+types.">High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types.</a> Cell Reports. 27 (7), 2241-2247 (2019).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+A+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Kawaguchi, R., Girke, T., Bray, E. A., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+mRNA+translation+contributes+to+gene+regulation+under+non-stress+and+dehydration+stress+conditions+in+Arabidopsis+thaliana.">Differential mRNA translation contributes to gene regulation under non-stress and dehydration stress conditions in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 38 (5), 823-839 (2004).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).</li><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+regulation+of+protein+abundance+from+proteomics+and+transcriptomis+analyses.">Insights into regulation of protein abundance from proteomics and transcriptomis analyses.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2013).</li><li>Tebaldi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+uncoupling+between+transcriptome+and+translatome+variations+after+a+stimulus+in+mammalian+cells.">Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells.</a> BMC Genomics. 13 (220), 1-15 (2012).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+mRNAs+strongly+correlate+to+proteins+in+a+multivariate+manner+and+their+translation+ratios+are+phenotype+specific.">Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific.</a> Nucleic Acids Research. 41 (9), 4743-4754 (2013).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+New+views+of+translation,+from+single+codons+to+genome+scale.">Ribosome profiling: New views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).</li><li>Lukoszek, R., Feist, P., Ignatova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+adaptive+response+of+Arabidopsis+thaliana+to+prolonged+thermal+stress+by+ribosomal+profiling+and+RNA-Seq.">Insights into the adaptive response of Arabidopsis thaliana to prolonged thermal stress by ribosomal profiling and RNA-Seq.</a> BMC Plant Biology. 16 (1), 1-13 (2016).</li><li>Broughton, W. J., Dilworth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+leghaemoglobin+synthesis+in+snake+beans.">Control of leghaemoglobin synthesis in snake beans.</a> Biochemical Journal. 125 (4), 1075-1080 (1971).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+An+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).</li><li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondenaturing+agarose+gel+electrophoresis+of+RNA+nondenaturing+agarose+gel+electrophoresis+of+RNA.">Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), 1-3 (2012).</li><li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., K&#228;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+Summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Marcel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>. Sickle: A sliding-window, adaptive, quality-based trimming tool for FastQ files (Version 1.33) Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/najoshi/sickle">https://github.com/najoshi/sickle</a> (2011)</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+Accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14 (4), 1-13 (2013).</li><li>Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmon+provides+fast+and+bias-aware+quantification+of+transcript+expression.">Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression.</a> Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).</li><li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=featureCounts:+An+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features.">featureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+A+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (550), 1-21 (2014).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).</li><li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Galaxy+platform+for+accessible,+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses:+2018+update.">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update.</a> Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).</li><li>Hunt, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEOexplorer:+A+webserver+for+gene+expression+analysis+and+visualisation.">GEOexplorer: A webserver for gene expression analysis and visualisation.</a> Nucleic Acids Research. , (2022).</li><li>Imbeaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1-12 (2005).</li><li>Di Paolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDCD4+regulates+axonal+growth+by+translational+repression+of+neurite+growth-related+genes+and+is+modulated+during+nerve+injury+responses.">PDCD4 regulates axonal growth by translational repression of neurite growth-related genes and is modulated during nerve injury responses.</a> RNA. 26 (11), 1637-1653 (2020).</li><li>Smircich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+translation+control+as+a+key+mechanism+generating+differential+gene+expression+in+Trypanosoma+cruzi.">Ribosome profiling reveals translation control as a key mechanism generating differential gene expression in Trypanosoma cruzi.</a> BMC Genomics. 16 (1), 443 (2015).</li><li>Eastman, G., Sharlow, E. R., Lazo, J. S., Bloom, G. S., Sotelo-Silveira, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+and+translatome+regulation+of+pathogenesis+in+Alzheimer's+disease+model+mice.">Transcriptome and translatome regulation of pathogenesis in Alzheimer's disease model mice.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 86 (1), 365-386 (2022).</li><li>Zanetti, M. E., Chang, I. -. F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopurification+of+polyribosomal+complexes+of+Arabidopsis+for+global+analysis+of+gene+expression.">Immunopurification of polyribosomal complexes of Arabidopsis for global analysis of gene expression.</a> Plant physiology. 138 (2), 624-635 (2005).</li><li>Mustroph, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis.">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18843-11848 (2009).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+the+what,+when,+where+and+how+of+protein+synthesis.">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 16 (11), 651-664 (2015).</li><li>Eastman, G., Smircich, P., Sotelo-Silveira, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+ribosome+footprints+to+understand+translation+at+a+genome+wide+level.">Following ribosome footprints to understand translation at a genome wide level.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 167-176 (2018).</li><li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host.">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 618-630 (2012).</li></ol>

Het bestuderen van genexpressieregulatie op translationeel niveau is van cruciaal belang om verschillende biologische processen beter te begrijpen, aangezien het eindpunt van celgenexpressie eiwitrijkdom is13,14. Dit kan worden beoordeeld door het translatoom te analyseren van het weefsel of organisme van belang waarvoor de polysomale fractie moet worden gezuiverd en de bijbehorende mRNA's moet worden geanalyseerd 3,4,34,35,36.<...

Vlinderbloemige planten, zoals sojabonen (Glycine max), kunnen symbiose tot stand brengen met specifieke bodembacteriën die rhizobia worden genoemd. Deze mutualistische relatie lokt de vorming uit van nieuwe organen, de symbiotische knobbeltjes, op de plantenwortels. De knobbeltjes zijn de plantenorganen die de bacteriën herbergen en bestaan uit gastheercellen waarvan het cytoplasma wordt gekoloniseerd met een gespecialiseerde vorm van rhizobia die bacteroïden wordt genoemd. Deze bacteroïden katalyseren de reductie van atmosferische stikstof (N2) tot ammoniak, die wordt overgebracht naar de plant in ruil voor koolhydraten 1,2.
Hoewel deze stikstofbindende symbiose een van de meest bestudeerde plant-microbe symbioses is, moeten veel aspecten nog beter worden begrepen, zoals hoe planten die worden blootgesteld aan verschillende abiotische stressomstandigheden hun interactie met hun symbiotische partner moduleren en hoe dit het knobbelmetabolisme beïnvloedt. Deze processen kunnen beter worden begrepen door het nodule-translatoom te analyseren (d.w.z. de subset van messenger RNA's [mRNA's] actief vertaald). Polyribosomen of polysomen zijn complexen van meerdere ribosomen geassocieerd met mRNA, vaak gebruikt om translatie te bestuderen3. De polysoomprofileringsmethode bestaat uit de analyse van de mRNA's geassocieerd met polysomen en is met succes gebruikt om de posttranscriptionele mechanismen te bestuderen die genexpressie beheersen die voorkomt in diverse biologische processen 4,5.
Historisch gezien heeft de analyse van genoomexpressie zich voornamelijk gericht op het bepalen van mRNA-abundantie 6,7,8,9. Er is echter een gebrek aan correlatie tussen transcriptie- en eiwitniveaus als gevolg van de verschillende stadia van posttranscriptionele regulatie van genexpressie, met name translatie 10,11,12. Bovendien is er geen afhankelijkheid waargenomen tussen de veranderingen op het niveau van het transcriptoom en die op het niveau van het translatoom13. De directe analyse van de set mRNA's die worden vertaald, maakt een nauwkeurigere en volledigere meting van de celgenexpressie mogelijk (waarvan het eindpunt eiwitrijkdom is) dan degene die wordt verkregen wanneer alleen mRNA-niveaus worden geanalyseerd 14,15,16.
Dit protocol beschrijft hoe plantaardige polysomen worden gezuiverd uit intacte sojaknollen door differentiële centrifugatie door een tweelaags sucrosekussen (figuur 1). Omdat van bacteroïden afgeleide ribosomen echter ook in de knobbeltjes aanwezig zijn, wordt een mix van ribosomen en RNA-soorten gezuiverd, ook al vertegenwoordigen de eukaryote de belangrijkste fractie (90% -95%). De daaropvolgende RNA-isolatie, kwantificering en kwaliteitscontrole worden ook beschreven (figuur 1). Dit protocol, in combinatie met RNA-seq, moet experimentele resultaten opleveren over de translationele regulatie van eukaryote mRNA's in een complex weefsel zoals de symbiotische knobbel.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64269/64269fig01.jpg"> Figuur 1: Schematisch overzicht van de voorgestelde methodologie voor eukaryote polysoomzuivering uit symbiotische knobbeltjes. Het schema geeft een overzicht van de stappen die in het protocol worden gevolgd van (1) plantengroei en (2) nodule-oogst tot (3) bereiding van de cytosolische extracten, (3) het verkrijgen van TOTAL-monsters en (4) PAR-monsters, en (5) RNA-extractie en kwaliteitscontrole. Afkortingen: PEB = polysoom extractiebuffer; RB = resuspensiebuffer; TOTAAL = totaal RNA; PAR = polysoom-geassocieerd mRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64269/64269fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plant growth and rhizobia inoculation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Daihan Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Model SHO-1D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YEM-medium</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J850 (yeast extract) 0122 (mannitol)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water deficit treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>221295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porometer</td>
			<td>Decagon Device</td>
			<td></td>
			<td>Model SC-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of cytosolic extracts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij L23</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Model 2K15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloranphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA 360</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tissue grinder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12649595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15504-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing dish&#160;</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>1911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of sucrose cushions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 40 Ti rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Optima L-100K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td>13.2 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction and quality control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>DI</td>
			<td>41191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Dorwil</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>3032-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10814-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol LS</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>102960028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>10-0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 10 &#181;L</td>
			<td>BioPointe Scientific</td>
			<td>321-4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 1000 &#181;L</td>
			<td>BioPointe Scientific</td>
			<td>361-1050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 20 &#181;L</td>
			<td>BioPointe Scientific</td>
			<td>341-4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 200 &#181;L</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>528104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>500020-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing company</td>
			<td>Macrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 250 mL flask</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>4110207</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome purification from soybean symbiotic nodules

Het doel van dit protocol is om een strategie te bieden voor het bestuderen van het eukaryote translatoom van de symbiotische knobbel van sojabonen (Glycine max). Dit artikel beschrijft methoden die zijn geoptimaliseerd om van planten afgeleide polyribosomen en de bijbehorende mRNA's te isoleren die moeten worden geanalyseerd met behulp van RNA-sequencing. Ten eerste worden cytoplasmatische lysaten verkregen door homogenisatie in polysomische en RNA-conserverende omstandigheden van hele, bevroren sojabonenknobbels. Vervolgens worden lysaten gewist door centrifugatie met lage snelheid en wordt 15% van het supernatant gebruikt voor totale RNA (TOTAL) isolatie. Het resterende geklaarde lysaat wordt gebruikt om polysomen te isoleren door ultracentrifugatie door een tweelaags sucrosekussen (12% en 33,5%). Polysoom-geassocieerd mRNA (PAR) wordt gezuiverd uit polysomale pellets na resuspensie. Zowel TOTAL als PAR worden geëvalueerd door zeer gevoelige capillaire elektroforese om te voldoen aan de kwaliteitsnormen van sequencingbibliotheken voor RNA-seq. Als voorbeeld van een downstream-toepassing kunnen na sequencing standaardpijplijnen voor genexpressieanalyse worden gebruikt om differentieel tot expressie gebrachte genen op transcriptoom- en translatoomniveau te verkrijgen. Samenvattend maakt deze methode, in combinatie met RNA-seq, de studie mogelijk van de translationele regulatie van eukaryote mRNA's in een complex weefsel zoals de symbiotische knobbel.

De kwantiteits- en kwaliteitsbeoordeling van de TOTAL- en PAR-fracties die volgens de bovengenoemde procedure zijn gezuiverd, is van cruciaal belang om het succes ervan te bepalen, aangezien voor de meeste downstream-toepassingen, zoals RNA-sequencing, hoogwaardige monsters van fundamenteel belang zijn voor bibliotheekvoorbereiding en -sequencing. Bovendien maakt de integriteit van de RNA-moleculen het mogelijk om een momentopname van het genexpressieprofiel vast te leggen op het moment van monsterverzameling<sup class="...

Watch this Scientific Journal Video about Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules at JoVE.com

Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules

Dit protocol beschrijft een methode voor eukaryote polysoomzuivering van intacte sojabonenknobbels. Na sequencing kunnen standaardpijplijnen voor genexpressieanalyse worden gebruikt om differentieel tot expressie gebrachte genen op transcriptoom- en translatoomniveau te identificeren.

Polysoom zuivering van sojabonen symbiotische knobbeltjes

The aim of this protocol is to provide a strategy for studying the eukaryotic translatome of the soybean (Glycine max) symbiotic nodule. This paper ...

Dit protocol is belangrijk omdat het, voor zover wij weten, het eerste is dat een nieuw op centrifuge gebaseerd metaal beschrijft voor kinetische polysoomzuivering van sojasymbiotische knobbeltjes. Het grote voordeel van deze techniek is dat in combinatie met RNA-Seq, de studie van de relatie mogelijk is en georganiseerd in een complex weefsel zoals de symbiotische knobbel. Weeg om te beginnen ongeveer 0,2 gram intacte knobbeltjes in een weegschaal en breng ze over in een voorgekoelde buis van twee milliliter.Voeg vervolgens 1,2 milliliter polysoomextractiebuffer toe, laat het monster twee minuten ontdooien en homogeniseer met een weefselslijper tot volledige verstoring en homogenisatie van de knobbeltjes. Incubeer vervolgens de monsters op ijs met zachte agitatie gedurende 10 minuten of totdat alle monsters zijn verwerkt en centrifugeer op 16.000 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius om het puin te pelleteren. Herstel vervolgens het supernatant en herhaal de centrifugestap.Na zorgvuldig herstel van het geklaarde cytosolische extract, breng een aliquot van 200 microliter over naar een schone microcentrifugebuis van 1,5 milliliter voor totale isolatie. Giet vervolgens 4,5 milliliter van de 33,5% sucroselaag in de centrifugebuizen en voeg voorzichtig en langzaam 4,5 milliliter van de 12% laag toe met een P-1000 micropipette. Zet vervolgens de buisjes op ijs tot de toevoeging van het geklaarde cytosolische extract.Laad een milliliter van het geklaarde cytosolische extract op het sucrosekussen door voorzichtig op de zijwand van de buis te pipetteren. Breng vervolgens de ultracentrifugebuizen over naar voorgekoelde emmers en centrifugeer bij 217, 874 G gedurende twee uur bij vier graden Celsius. Nadat u het resterende cytosolische extract en sucrosekussen hebt weggegooid, suspensie u de polysomale pellet opnieuw met 200 microliter voorgekoelde hersuspensiebuffer.Incubeer vervolgens gedurende 30 minuten op ijs en breng vervolgens de polysomale re-suspensie over naar 1,5 milliliter voorgekoelde buizen om door te gaan met de RNA-extractie. Na het homogeniseren van de monsters met 750 microliter van het RNA-isolatiereagens gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur incuberen. Voeg vervolgens 200 microliter koud chloroform toe en schud de buizen krachtig gedurende 15 seconden.Incubeer vervolgens bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Centrifugeer op 12.000 maal G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius voor fasescheiding en breng 500 microliter van de bovenste waterige fase over naar een schone buis zonder de roze organische fase te verstoren. Voeg vervolgens 375 microliter koud isopropanol en 0,5 microliter RNA-vrij glycogeen toe.Meng daarna grondig door op en neer te pipetteren. Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en centrifugeer gedurende 15 minuten op 12.000 maal G. Gooi vervolgens het supernatant weg en was het RNA-neerslag met één milliliter koud, 75% ethanol.Meng door korte vortexing. Centrifugeer vervolgens op 7.500 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg en droog de RNA-pellet aan de lucht.Los vervolgens de pellet op in 50 microliter RNA's vrij water en incubeer gedurende vijf minuten bij 65 graden Celsius. Beoordeel de RNA-concentratie en integriteit met zeer gevoelige capillaire elektroforese en of elektroforese op een 2% RNA-vrije agarose-gel. Voeg na het schatten van het monstervolume 0,1 volumes van drie molaire natriumacetaat, drie volumes koude ethanol en 0,5 microliter RNA's, vrij glycogeen, toe.Meng ze vervolgens grondig. Capillaire elektroforese werd uitgevoerd voor verschillende totale en polysomale geassocieerde RNA-monsterfracties, die scherpe ribosomale RNA-banden vertoonden, zonder enig besmeurd uiterlijk. Dit komt echter niet tot uiting in de RIN-waarden, aangezien deze variëren tussen 5,9 en 7,5, wat overeenkomt met niet-intacte monsters.De bioanalyzer slaagde er niet in om de 18S- en 25S-pieken te identificeren zoals te zien in de elektroferogrammen, zowel voor totale als polysoom geassocieerde RNA-monsters. Er was geen visueel teken van monsterdegradatie. Een monster werd echter geanalyseerd om het resultaat van bijna volledig gedegradeerd monster te visualiseren, ter vergelijking.Het belangrijkste is om te werken in polysomische en RNA-behoudsomstandigheden gedurende het hele protocol. Na sequencing van de totale en par RNA-fracties kunnen standaardpatronen voor de geanalyseerde genexpressie worden gebruikt om differentiële expressiegenen op transcriptie- en translatieniveau te identificeren.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Afleiding van Cardiac stamcellen uit embryonale stamcellen

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Driedimensionale Kwantificering van Dendritische stekels van Piramidale Neuronen afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

Een snelle en efficiënte methode voor het zuiveren van Endoderm Cellen Generated van menselijke embryonale stamcellen

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Oprichting van Proliferatieve Tetraploïde Cellen uit niet-getransformeerde humane fibroblasten

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Effectieve Isolatie van Functionele eilandjes van neonatale muis alvleesklier

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Een gestandaardiseerde benadering voor multispecies Zuivering van zoogdierkiemcellen door middel van mechanische weefseldissociatie en flowcytometrie

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Imaging DPP-release van een Drosophila -vleugel schijf

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Het vertalen van Ribosome Affinity Purification (TRAP) om Arabidopsis thaliana Root Development te onderzoeken op een cell type-specifieke schaal

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Generatie van naïeve Blastoderm Explants uit Zebravis Embryo's

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos

Isolatie van preadipocyten uit vleeskuikenembryo's

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. ...