Name: polysome purification from soybean symbiotic nodules
Uploaded: 2022-07-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules at JoVE.com

Diese Forschung wurde durch CSIC I+D 2020 Grant Nr. 282, FVF 2017 Grant Nr. 210 und PEDECIBA (María Martha Sainz) finanziert.

1. Pflanzenwachstum und Rhizobienimpfung
<ol><li>Um die benötigten Knötchen zu erzeugen, säen Sie die Sojabohnensamen Ihrer Wahl in das ausgewählte Substrat in einer Wachstumskammer unter kontrollierten Bedingungen. HINWEIS: In diesem Protokoll wurden Samen in einer 0,5-l-Plastikflasche ausgesät, die mit einer Mischung aus Sand:Vermiculit (1:1) gefüllt war. Die Wachstumskammer wurde mit einer Tag/Nacht-Zyklustemperatur von 28 °C bzw. 20 °C bzw. einer Hell/Dunkel-Photoperiode von 16 h/8 h ein...

<ol>
	<li>Limpens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-+and+tissue-specific+transcriptome+analyses+of+Medicago+truncatula+root+nodules.">Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules.</a> PLoS ONE. 8 (5), 64377 (2013).</li><li>Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+nitrogen-fixing+symbiosis+with+legumes:+How+many+rhizobium+recipes.">Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes: How many rhizobium recipes.</a> Trends in Microbiology. 17 (10), 458-466 (2009).</li><li>King, H. A., Gerber, A. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+RNA-Seq+and+microarray+gene+expression+data+in+two+zones+of+the+Arabidopsis+root+apex+relevant+to+spaceflight.">Comparing RNA-Seq and microarray gene expression data in two zones of the Arabidopsis root apex relevant to spaceflight.</a> Applications in Plant Sciences. 6 (11), 1197 (2018).</li><li>Shulse, C. 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R., Lazo, J. S., Bloom, G. S., Sotelo-Silveira, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+and+translatome+regulation+of+pathogenesis+in+Alzheimer's+disease+model+mice.">Transcriptome and translatome regulation of pathogenesis in Alzheimer's disease model mice.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 86 (1), 365-386 (2022).</li><li>Zanetti, M. E., Chang, I. -. F., Gong, F., Galbraith, D. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+ribosome+footprints+to+understand+translation+at+a+genome+wide+level.">Following ribosome footprints to understand translation at a genome wide level.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 167-176 (2018).</li><li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host.">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 618-630 (2012).</li></ol>

Die Untersuchung der Genexpressionsregulation auf translationaler Ebene ist entscheidend, um verschiedene biologische Prozesse besser zu verstehen, da der Endpunkt der Zellgenexpression die Proteinhäufigkeit13,14 ist. Dies kann beurteilt werden, indem das Translatom des interessierenden Gewebes oder Organismus analysiert wird, für das die polysomale Fraktion gereinigt und die zugehörigen mRNAs analysiert werden sollen 3,4,34,35,36....

Leguminosen wie Sojabohnen (Glycine max) können eine Symbiose mit bestimmten Bodenbakterien namens Rhizobien eingehen. Diese mutualistische Beziehung führt zur Bildung neuer Organe, der symbiotischen Knötchen, an den Pflanzenwurzeln. Die Knötchen sind die Pflanzenorgane, die die Bakterien beherbergen, und bestehen aus Wirtszellen, deren Zytoplasma mit einer spezialisierten Form von Rhizobien besiedelt ist, die Bakterioide genannt wird. Diese Bakterien katalysieren die Reduktion von Luftstickstoff (N2) zu Ammoniak, das im Gegenzug für Kohlenhydrate 1,2 auf die Pflanze übertragen wird.
Obwohl diese stickstofffixierende Symbiose eine der am besten untersuchten Pflanzen-Mikroben-Symbiosen ist, müssen noch viele Aspekte besser verstanden werden, wie zum Beispiel, wie Pflanzen, die verschiedenen abiotischen Stressbedingungen ausgesetzt sind, ihre Interaktion mit ihrem symbiotischen Partner modulieren und wie sich dies auf den Knötchenstoffwechsel auswirkt. Diese Prozesse könnten besser verstanden werden, indem das Knötchentranslatom (d.h. die Untergruppe der Boten-RNAs [mRNAs] aktiv translatiert) analysiert wird. Polyribosomen oder Polysomen sind Komplexe mehrerer Ribosomen, die mit mRNA assoziiert sind und häufig zur Untersuchung der Translationverwendet werden 3. Die Polysomen-Profiling-Methode besteht aus der Analyse der mRNAs, die mit Polysomen assoziiert sind, und wurde erfolgreich eingesetzt, um die posttranskriptionellen Mechanismen zu untersuchen, die die Genexpression steuern, die in verschiedenen biologischen Prozessen auftritt 4,5.
In der Vergangenheit konzentrierte sich die Genomexpressionsanalyse hauptsächlich auf die Bestimmung der mRNA-Häufigkeit 6,7,8,9. Es besteht jedoch ein Mangel an Korrelation zwischen Transkript- und Proteinspiegeln aufgrund der verschiedenen Stadien der posttranskriptionellen Regulation der Genexpression, insbesondere der Translation10,11,12. Darüber hinaus wurde keine Abhängigkeit zwischen den Veränderungen auf der Ebene des Transkriptoms und denen, die auf der Ebene des Translatoms13 auftreten, beobachtet. Die direkte Analyse des Satzes von mRNAs, die übersetzt werden, ermöglicht eine genauere und vollständigere Messung der Zellgenexpression (deren Endpunkt die Proteinhäufigkeit ist) als die, die erhalten wird, wenn nur mRNA-Spiegel analysiert werden14,15,16.
Dieses Protokoll beschreibt, wie pflanzliche Polysomen aus intakten Sojaknollen durch differentielle Zentrifugation durch ein zweischichtiges Saccharosekissen gereinigt werden (Abbildung 1). Da jedoch auch Bacteroid-abgeleitete Ribosomen in den Knötchen vorhanden sind, wird eine Mischung aus Ribosomen und RNA-Spezies gereinigt, obwohl die eukaryotischen die Hauptfraktion darstellen (90%-95%). Die anschließende RNA-Isolierung, Quantifizierung und Qualitätskontrolle wird ebenfalls beschrieben (Abbildung 1). Dieses Protokoll soll in Kombination mit RNA-seq experimentelle Ergebnisse zur translationalen Regulation eukaryotischer mRNAs in einem komplexen Gewebe wie dem symbiotischen Knötchen liefern.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64269/64269fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Übersicht über die vorgeschlagene Methodik zur eukaryotischen Polysomenreinigung aus symbiotischen Knötchen. Das Schema gibt einen Überblick über die Schritte, die im Protokoll von (1) Pflanzenwachstum und (2) Knötchenernte bis (3) Herstellung der zytosolischen Extrakte, (3) Gewinnung von GESAMTPROBEN und (4) PAR-Proben und (5) RNA-Extraktion und Qualitätskontrolle befolgt werden. Abkürzungen: PEB = Polysomenextraktionspuffer; RB = Resuspensionspuffer; TOTAL = Gesamt-RNA; PAR = Polysom-assoziierte mRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64269/64269fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plant growth and rhizobia inoculation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Daihan Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Model SHO-1D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YEM-medium</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J850 (yeast extract) 0122 (mannitol)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water deficit treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>221295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porometer</td>
			<td>Decagon Device</td>
			<td></td>
			<td>Model SC-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of cytosolic extracts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij L23</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Model 2K15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloranphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA 360</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tissue grinder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12649595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15504-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing dish&#160;</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>1911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of sucrose cushions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 40 Ti rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Optima L-100K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td>13.2 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction and quality control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>DI</td>
			<td>41191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Dorwil</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>3032-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10814-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol LS</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>102960028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>10-0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 10 &#181;L</td>
			<td>BioPointe Scientific</td>
			<td>321-4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 1000 &#181;L</td>
			<td>BioPointe Scientific</td>
			<td>361-1050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 20 &#181;L</td>
			<td>BioPointe Scientific</td>
			<td>341-4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 200 &#181;L</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>528104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>500020-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing company</td>
			<td>Macrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 250 mL flask</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>4110207</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome purification from soybean symbiotic nodules

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Strategie zur Untersuchung des eukaryotischen Translatoms des Sojabohnen (Glycine max) symbiotischen Knötchens bereitzustellen. Dieser Artikel beschreibt Methoden, die optimiert wurden, um pflanzliche Polyribosomen und die zugehörigen mRNAs zu isolieren, die mittels RNA-Sequenzierung analysiert werden sollen. Zunächst werden zytoplasmatische Lysate durch Homogenisierung unter Polysomen- und RNA-erhaltenden Bedingungen aus ganzen, gefrorenen Sojabohnenknollen gewonnen. Dann werden Lysate durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit entfernt, und 15% des Überstands werden für die Isolierung der Gesamt-RNA (TOTAL) verwendet. Das verbleibende gereinigte Lysat wird verwendet, um Polysomen durch Ultrazentrifugation durch ein zweilagiges Saccharosekissen (12% und 33,5%) zu isolieren. Polysom-assoziierte mRNA (PAR) wird nach der Resuspension aus polysomalen Pellets gereinigt. Sowohl TOTAL als auch PAR werden durch hochempfindliche Kapillarelektrophorese bewertet, um die Qualitätsstandards von Sequenzierungsbibliotheken für RNA-seq zu erfüllen. Als Beispiel für eine nachgeschaltete Anwendung können nach der Sequenzierung Standardpipelines für die Genexpressionsanalyse verwendet werden, um differentiell exprimierte Gene auf Transkriptom- und Translatomebene zu erhalten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode in Kombination mit RNA-seq die Untersuchung der translationalen Regulation eukaryotischer mRNAs in einem komplexen Gewebe wie dem symbiotischen Knötchen ermöglicht.

Die Quantitäts- und Qualitätsbewertung der mit dem oben genannten Verfahren gereinigten TOTAL- und PAR-Fraktionen ist entscheidend für den Erfolg, da für die meisten nachgelagerten Anwendungen, wie z. B. die RNA-Sequenzierung, qualitativ hochwertige Proben für die Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung von grundlegender Bedeutung sind. Darüber hinaus ermöglicht die Integrität der RNA-Moleküle die Erfassung einer Momentaufnahme des Genexpressionsprofils zum Zeitpunkt der Probenentnahme18</su...

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Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur eukaryotischen Polysomenreinigung aus intakten Sojaknollen. Nach der Sequenzierung können Standardpipelines für die Genexpressionsanalyse verwendet werden, um differentiell exprimierte Gene auf Transkriptom- und Translatomebene zu identifizieren.

Polysomenreinigung aus Sojabohnen-Symbiose-Knötchen

The aim of this protocol is to provide a strategy for studying the eukaryotic translatome of the soybean (Glycine max) symbiotic nodule. This paper ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es unseres Wissens das erste ist, das ein neues zentrifugenbasiertes Metall für die kinetische Polysomenreinigung aus symbiotischen Sojabohnenknollen beschreibt. Der große Vorteil dieser Technik ist, dass in Kombination mit RNA-Seq die Untersuchung der Beziehung ermöglicht und in einem komplexen Gewebe wie dem symbiotischen Knoten organisiert ist. Wiegen Sie zunächst etwa 0,2 Gramm intakte Knötchen in einer Waagschale und geben Sie sie in ein vorgekühltes Zwei-Milliliter-Rohr.Dann fügen Sie 1,2 Milliliter Polysomenextraktionspuffer hinzu, lassen Sie die Probe zwei Minuten auftauen und homogenisieren Sie mit einem Gewebemahlwerk bis zur vollständigen Auflösung und Homogenisierung der Knötchen. Als nächstes inkubieren Sie die Proben auf Eis mit leichtem Rühren für 10 Minuten oder bis alle Proben verarbeitet wurden, und zentrifugieren Sie bei 16.000 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, um die Trümmer zu pelletieren. Stellen Sie dann den Überstand wieder her und wiederholen Sie den Zentrifugenschritt.Nach sorgfältiger Rückgewinnung des geklärten zytosolischen Extrakts wird ein 200-Mikroliter-Aliquot zur vollständigen Isolierung in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Dann gießen Sie 4,5 Milliliter der 33,5% igen Saccharoseschicht in die Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 4,5 Milliliter der 12%-Schicht vorsichtig und langsam mit einer P-1000-Mikropipette hinzu. Als nächstes legen Sie die Röhrchen auf Eis, bis der geklärte zytosolische Extrakt hinzugefügt wird.Laden Sie einen Milliliter des geklärten zytosolischen Extrakts auf das Saccharosekissen, indem Sie vorsichtig auf die Seitenwand des Röhrchens pipettieren. Dann die Ultrazentrifugenröhrchen in vorgekühlte Eimer geben und bei 217, 874 g zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach Verwerfen des verbleibenden zytosolischen Extrakts und des Saccharosepolsters wird das polysomale Pellet mit 200 Mikrolitern vorgekühltem Resuspensionspuffer wieder suspendiert.Als nächstes 30 Minuten auf Eis inkubieren und dann die polysomale Resuspension in 1,5 Milliliter vorgekühlte Röhrchen überführen, um mit der RNA-Extraktion fortzufahren. Nach der Homogenisierung der Proben mit 750 Mikrolitern des RNA-Isolierreagenz für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann fügen Sie 200 Mikroliter kaltes Chloroform hinzu und schütteln Sie die Röhrchen 15 Sekunden lang kräftig.Als nächstes 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren Sie bei 12.000 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius zur Phasentrennung und überführen Sie 500 Mikroliter der oberen wässrigen Phase in ein sauberes Röhrchen, ohne die rosa organische Phase zu stören. Dann fügen Sie 375 Mikroliter kaltes Isopropanol und 0,5 Mikroliter RNAs freies Glykogen hinzu.Danach gründlich mischen, indem Sie auf und ab pipettieren. Inkubieren Sie die Mischung für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und zentrifugieren Sie sie bei 12.000 mal G für 15 Minuten. Dann verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie den RNA-Niederschlag mit einem Milliliter kaltem 75% Ethanol.Durch kurzes Wirbeln mischen. Als nächstes zentrifugieren Sie bei 7, 500 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das RNA-Pellet an der Luft.Dann lösen Sie das Pellet in 50 Mikroliter RNA-freiem Wasser auf und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei 65 Grad Celsius. Die RNA-Konzentration und -Integrität wird mit hochempfindlicher Kapillarelektrophorese und/oder Elektrophorese auf einem 2%RNAs-freien Agarosegel beurteilt. Nach der Schätzung des Probenvolumens fügen Sie 0,1 Volumina von drei molaren Natriumacetat, drei Volumina kaltes Ethanol und 0,5 Mikroliter RNAs, freies Glykogen hinzu.Dann mischen Sie sie gründlich. Die Kapillarelektrophorese wurde für mehrere totale und polysomal assoziierte RNA-Probenfraktionen durchgeführt, die scharfe ribosomale RNA-Banden ohne verschmiertes Aussehen zeigten. Dies spiegelt sich jedoch nicht in den RIN-Werten wider, da sie zwischen 5,9 und 7,5 liegen, was nicht intakten Stichproben entspricht.Der Bioanalysator konnte die 18S- und 25S-Peaks, wie sie in den Elektropherogrammen zu sehen sind, nicht identifizieren, sowohl für Gesamt- als auch für Polysom-assoziierte RNA-Proben. Es gab keine visuellen Anzeichen für eine Verschlechterung der Probe. Es wurde jedoch eine Probe analysiert, um das Ergebnis einer fast vollständig degradierten Probe zum Vergleich zu visualisieren.Das Wichtigste ist, während des gesamten Protokolls unter Polysomen- und RNA-erhaltenden Bedingungen zu arbeiten. Nach der Sequenzierung der Gesamt- und Par-RNA-Fraktionen können Standardmuster für die analysierte Genexpression verwendet werden, um differentielle Exprimierungsgene auf Transkriptions- und Translationsebene zu identifizieren.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Ableitung von Herzvorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

Eine schnelle und effiziente Methode zur Reinigung von Entodermzellen generiert aus humanen embryonalen Stammzellen

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Gründung der proliferativen Tetraploid Zellen aus nicht-transformierten menschlichen Fibroblasten

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Effektive Isolation von funktionellen Inselchen von Neonatal Maus Pancreas

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Ein standardisierter Ansatz für Multispezies Reinigung von männlichen männlichen Keimzellen durch mechanische Gewebedissoziation und Durchflusszytometrie

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Imaging Dpp Release von einer Drosophila Wing Disc

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Übersetzen von Ribosome Affinity Purification (TRAP) zur Untersuchung der Arabidopsis thaliana Wurzelentwicklung in einer zelltypspezifischen Skala

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Erzeugung naiver Blastoderm-Expflanzen aus Zebrafisch-Embryonen

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos

Isolierung von Präadipozyten aus Masthähnchen-Kieferembryonen

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. ...