Name: polysome purification from soybean symbiotic nodules
Uploaded: 2022-07-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי מענק CSIC I+D 2020 מס ' 282, מענק FVF 2017 מס ' 210, ו- PEDECIBA (מריה מרתה סיינז).

1. גידול צמחים וחיסון ריזוביה
<ol><li>כדי ליצור את הגושים הנדרשים, לזרוע את זרעי סויה של בחירה במצע שנבחר בתא הגידול בתנאים מבוקרים. הערה: בפרוטוקול זה, זרעים נזרעו בבקבוק פלסטיק 0.5 ליטר מלא בתערובת של חול:ורמיקוליט (1:1). תא הגידול נקבע עם טמפרטורת מחזור יום / לילה של 28 °C (75 °F) / 20 ° C, בהת...

<ol>
	<li>Limpens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-+and+tissue-specific+transcriptome+analyses+of+Medicago+truncatula+root+nodules.">Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules.</a> PLoS ONE. 8 (5), 64377 (2013).</li><li>Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+nitrogen-fixing+symbiosis+with+legumes:+How+many+rhizobium+recipes.">Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes: How many rhizobium recipes.</a> Trends in Microbiology. 17 (10), 458-466 (2009).</li><li>King, H. A., Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translatome+profiling:+Methods+for+genome-scale+analysis+of+mRNA+translation.">Translatome profiling: Methods for genome-scale analysis of mRNA translation.</a> Briefings in Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2014).</li><li>Chass&#233;, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).</li><li>Y&#225;ng&#252;ez, E., Castro-Sanz, A. B., Fern&#225;ndez-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genome-wide+changes+in+the+translatome+of+Arabidopsis+seedlings+subjected+to+heat+stress.">Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress.</a> PloS ONE. 8 (8), 71425 (2013).</li><li>Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+new+world+of+the+genome+with+DNA+microarrays.">Exploring the new world of the genome with DNA microarrays.</a> Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).</li><li>Krishnamurthy, A., Ferl, R. J., Paul, A. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+RNA-Seq+and+microarray+gene+expression+data+in+two+zones+of+the+Arabidopsis+root+apex+relevant+to+spaceflight.">Comparing RNA-Seq and microarray gene expression data in two zones of the Arabidopsis root apex relevant to spaceflight.</a> Applications in Plant Sciences. 6 (11), 1197 (2018).</li><li>Shulse, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+transcriptome+profiling+of+plant+cell+types.">High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types.</a> Cell Reports. 27 (7), 2241-2247 (2019).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+A+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Kawaguchi, R., Girke, T., Bray, E. A., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+mRNA+translation+contributes+to+gene+regulation+under+non-stress+and+dehydration+stress+conditions+in+Arabidopsis+thaliana.">Differential mRNA translation contributes to gene regulation under non-stress and dehydration stress conditions in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 38 (5), 823-839 (2004).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).</li><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+regulation+of+protein+abundance+from+proteomics+and+transcriptomis+analyses.">Insights into regulation of protein abundance from proteomics and transcriptomis analyses.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2013).</li><li>Tebaldi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+uncoupling+between+transcriptome+and+translatome+variations+after+a+stimulus+in+mammalian+cells.">Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells.</a> BMC Genomics. 13 (220), 1-15 (2012).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+mRNAs+strongly+correlate+to+proteins+in+a+multivariate+manner+and+their+translation+ratios+are+phenotype+specific.">Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific.</a> Nucleic Acids Research. 41 (9), 4743-4754 (2013).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+New+views+of+translation,+from+single+codons+to+genome+scale.">Ribosome profiling: New views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).</li><li>Lukoszek, R., Feist, P., Ignatova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+adaptive+response+of+Arabidopsis+thaliana+to+prolonged+thermal+stress+by+ribosomal+profiling+and+RNA-Seq.">Insights into the adaptive response of Arabidopsis thaliana to prolonged thermal stress by ribosomal profiling and RNA-Seq.</a> BMC Plant Biology. 16 (1), 1-13 (2016).</li><li>Broughton, W. J., Dilworth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+leghaemoglobin+synthesis+in+snake+beans.">Control of leghaemoglobin synthesis in snake beans.</a> Biochemical Journal. 125 (4), 1075-1080 (1971).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+An+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).</li><li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondenaturing+agarose+gel+electrophoresis+of+RNA+nondenaturing+agarose+gel+electrophoresis+of+RNA.">Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), 1-3 (2012).</li><li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., K&#228;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+Summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Marcel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>. Sickle: A sliding-window, adaptive, quality-based trimming tool for FastQ files (Version 1.33) Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/najoshi/sickle">https://github.com/najoshi/sickle</a> (2011)</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+Accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14 (4), 1-13 (2013).</li><li>Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmon+provides+fast+and+bias-aware+quantification+of+transcript+expression.">Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression.</a> Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).</li><li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=featureCounts:+An+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features.">featureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+A+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (550), 1-21 (2014).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).</li><li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Galaxy+platform+for+accessible,+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses:+2018+update.">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update.</a> Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).</li><li>Hunt, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEOexplorer:+A+webserver+for+gene+expression+analysis+and+visualisation.">GEOexplorer: A webserver for gene expression analysis and visualisation.</a> Nucleic Acids Research. , (2022).</li><li>Imbeaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1-12 (2005).</li><li>Di Paolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDCD4+regulates+axonal+growth+by+translational+repression+of+neurite+growth-related+genes+and+is+modulated+during+nerve+injury+responses.">PDCD4 regulates axonal growth by translational repression of neurite growth-related genes and is modulated during nerve injury responses.</a> RNA. 26 (11), 1637-1653 (2020).</li><li>Smircich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+translation+control+as+a+key+mechanism+generating+differential+gene+expression+in+Trypanosoma+cruzi.">Ribosome profiling reveals translation control as a key mechanism generating differential gene expression in Trypanosoma cruzi.</a> BMC Genomics. 16 (1), 443 (2015).</li><li>Eastman, G., Sharlow, E. R., Lazo, J. S., Bloom, G. S., Sotelo-Silveira, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+and+translatome+regulation+of+pathogenesis+in+Alzheimer's+disease+model+mice.">Transcriptome and translatome regulation of pathogenesis in Alzheimer's disease model mice.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 86 (1), 365-386 (2022).</li><li>Zanetti, M. E., Chang, I. -. F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopurification+of+polyribosomal+complexes+of+Arabidopsis+for+global+analysis+of+gene+expression.">Immunopurification of polyribosomal complexes of Arabidopsis for global analysis of gene expression.</a> Plant physiology. 138 (2), 624-635 (2005).</li><li>Mustroph, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis.">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18843-11848 (2009).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+the+what,+when,+where+and+how+of+protein+synthesis.">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 16 (11), 651-664 (2015).</li><li>Eastman, G., Smircich, P., Sotelo-Silveira, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+ribosome+footprints+to+understand+translation+at+a+genome+wide+level.">Following ribosome footprints to understand translation at a genome wide level.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 167-176 (2018).</li><li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host.">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 618-630 (2012).</li></ol>

חקר ויסות ביטוי גנים ברמת התרגום הוא קריטי להבנה טובה יותר של תהליכים ביולוגיים שונים, שכן נקודת הקצה של ביטוי גנים בתאים היא שפע חלבונים13,14. ניתן להעריך זאת על ידי ניתוח הטרנסלטום של הרקמה או האורגניזם המעניין שעבורו יש לטהר את השבר הפוליסומלי ואת ה- mRNAs הקש...

צמחים קטניים, כגון סויה (גליצין מקס), יכולים לבסס סימביוזה עם חיידקי אדמה ספציפיים הנקראים ריזוביה. מערכת יחסים הדדית זו מעוררת את היווצרותם של איברים חדשים, הגושים הסימביוטיים, על שורשי הצמח. הגושים הם האיברים הצמחיים המארחים את החיידקים ומורכבים מתאים מארחים שהציטופלסמה שלהם מיושבת עם צורה מיוחדת של ריזוביה הנקראת חיידקים. חיידקים אלה מזרזים את הפחתת החנקן האטמוספרי (N 2) לאמוניה, אשר מועבר לצמח בתמורה לפחמימות 1,2.
אף על פי שסימביוזה זו של קיבוע חנקן היא אחת הסימביוזה בין צמחים למיקרובים הנחקרים ביותר, היבטים רבים עדיין צריכים להיות מובנים טוב יותר, כגון כיצד צמחים הנתונים לתנאי עקה אביוטיים שונים מווסתים את האינטראקציה שלהם עם השותף הסימביוטי שלהם וכיצד זה משפיע על חילוף החומרים של הגולם. ניתן היה להבין טוב יותר תהליכים אלה על ידי ניתוח טרנסלטום הגולם (כלומר, תת-הקבוצה של רנ"א שליח [mRNAs] המתורגמת באופן פעיל). פוליריבוזומים או פוליזומים הם קומפלקסים של ריבוזומים מרובים הקשורים ל-mRNA, המשמשים בדרך כלל לחקר תרגום3. שיטת פרופיל הפוליזום מורכבת מניתוח ה-mRNA הקשורים לפוליזומים ושימשה בהצלחה לחקר המנגנונים הפוסט-טרנספורמטיביים השולטים בביטוי גנים המתרחשים בתהליכים ביולוגיים מגוונים 4,5.
מבחינה היסטורית, ניתוח ביטוי הגנום התמקד בעיקר בקביעת שפע mRNA 6,7,8,9. עם זאת, קיים חוסר מתאם בין רמות התעתיק לרמות החלבון בשל השלבים השונים של ויסות פוסט-טרנספורמטיבי של ביטוי גנים, במיוחד תרגום10,11,12. יתר על כן, לא נצפתה תלות בין השינויים ברמת התעתיק לבין אלה המתרחשים ברמה של translatome13. הניתוח הישיר של קבוצת ה-mRNA המתורגמת מאפשר מדידה מדויקת ומלאה יותר של ביטוי הגנים בתאים (שנקודת הקצה שלהם היא שפע חלבונים) מזו המתקבלת כאשר מנותחות רק רמות mRNA14,15,16.
פרוטוקול זה מתאר כיצד פוליזומים ממקור צמחי מטוהרים מגושי סויה שלמים על-ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית באמצעות כרית סוכרוז דו-שכבתית (איור 1). עם זאת, מכיוון שריבוזומים שמקורם בבקטרואיד נמצאים גם בגושים, תערובת של ריבוזומים ומיני RNA מטוהרים, למרות שהאאוקריוטים מייצגים את החלק העיקרי (90%-95%). כמו כן מתוארים הבידוד, הכימות ובקרת האיכות של הרנ"א הבאים (איור 1). פרוטוקול זה, בשילוב עם RNA-seq, אמור לספק תוצאות ניסיוניות על הוויסות התרגומי של mRNA אאוקריוטי ברקמה מורכבת כגון הגולם הסימביוטי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64269/64269fig01.jpg"> איור 1: סקירה סכמטית של המתודולוגיה המוצעת לטיהור פוליזום אאוקריוטי מגושים סימביוטיים. התוכנית נותנת סקירה של השלבים הבאים בפרוטוקול מ-(1) גידול צמחים ו-(2) קציר גולמים ועד (3) הכנת התמציות הציטוזוליות, (3) קבלת דגימות TOTAL ו-(4) דגימות PAR, ו-(5) מיצוי RNA ובקרת איכות. קיצורים: PEB = מאגר מיצוי פוליזום; RB = חיץ resuspension; סה"כ = סך רנ"א; PAR = mRNA הקשור לפוליזום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64269/64269fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plant growth and rhizobia inoculation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Daihan Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Model SHO-1D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YEM-medium</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J850 (yeast extract) 0122 (mannitol)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water deficit treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>221295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porometer</td>
			<td>Decagon Device</td>
			<td></td>
			<td>Model SC-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of cytosolic extracts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij L23</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Model 2K15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloranphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA 360</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tissue grinder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12649595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15504-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing dish&#160;</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>1911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of sucrose cushions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 40 Ti rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Optima L-100K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td>13.2 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction and quality control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>DI</td>
			<td>41191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Dorwil</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>3032-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10814-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol LS</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>102960028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>10-0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 10 &#181;L</td>
			<td>BioPointe Scientific</td>
			<td>321-4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 1000 &#181;L</td>
			<td>BioPointe Scientific</td>
			<td>361-1050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 20 &#181;L</td>
			<td>BioPointe Scientific</td>
			<td>341-4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 200 &#181;L</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>528104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>500020-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing company</td>
			<td>Macrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 250 mL flask</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>4110207</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome purification from soybean symbiotic nodules

מטרת פרוטוקול זה היא לספק אסטרטגיה לחקר הטרנסלטום האאוקריוטי של הגולם הסימביוטי של פולי הסויה (גליצין מקס). מאמר זה מתאר שיטות הממוטבות לבידוד פוליריבוזומים שמקורם בצמחים ואת ה-mRNA הקשורים אליהם לניתוח באמצעות ריצוף RNA. ראשית, ליזאטים ציטופלסמיים מתקבלים באמצעות הומוגניזציה בתנאים משמרים פוליזום ורנ"א מגושים שלמים וקפואים של פולי סויה. לאחר מכן, הליזטים מנוקים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה, ו-15% מהסופר-נאטנט משמש לבידוד RNA כולל (TOTAL). הליזאט המנוקה הנותר משמש לבידוד פוליזומים על ידי אולטרה-צנטריפוגציה באמצעות כרית סוכרוז דו-שכבתית (12% ו-33.5%). mRNA הקשור לפוליזום (PAR) מטוהר מכדורים פוליסומליים לאחר חידוש. הן TOTAL והן PAR מוערכים על ידי אלקטרופורזה נימית רגישה ביותר כדי לעמוד בתקני האיכות של ספריות ריצוף עבור RNA-seq. כדוגמה ליישום במורד הזרם, לאחר ריצוף, ניתן להשתמש בצינורות סטנדרטיים לניתוח ביטוי גנים כדי לקבל גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי ברמות השעתוק והטרנסלטום. לסיכום, שיטה זו, בשילוב עם RNA-seq, מאפשרת לחקור את הוויסות התרגומי של mRNA אאוקריוטי ברקמה מורכבת כגון הגולם הסימביוטי.

הערכת הכמות והאיכות של שברים TOTAL ו- PAR המטוהרים באמצעות ההליך הנ"ל היא המפתח לקביעת הצלחתו, שכן עבור רוב היישומים במורד הזרם, כגון ריצוף RNA, דגימות באיכות גבוהה הן בסיסיות להכנת ספרייה וריצוף. יתר על כן, שלמות מולקולות הרנ"א מאפשרת לכידת תמונת מצב של פרופיל ביטוי הגנים ברגע איסוף הדגימה<sup class="...

Watch this Scientific Journal Video about Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules at JoVE.com

Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules

פרוטוקול זה מתאר שיטה לטיהור פוליזום אאוקריוטי מגושי סויה שלמים. לאחר הריצוף, ניתן להשתמש בצינורות סטנדרטיים לניתוח ביטוי גנים כדי לזהות גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי ברמות השעתוק והטרנסלטום.

טיהור פוליזום מגושים סימביוטיים של פולי סויה

The aim of this protocol is to provide a strategy for studying the eukaryotic translatome of the soybean (Glycine max) symbiotic nodule. This paper ...

פרוטוקול זה משמעותי משום שהוא, למיטב ידיעתנו, הראשון שמתאר מתכת חדשה המבוססת על צנטריפוגות לטיהור פוליזום קינטי מגושים סימביוטיים של פולי סויה. היתרון הגדול של טכניקה זו הוא כי בשילוב עם RNA-Seq, מאפשר את המחקר של הקשר מאורגן ברקמה מורכבת כגון גולם סימביוטי. כדי להתחיל, לשקול כ 0.2 גרם של גושים שלמים בכלי שקילה, ולהעביר אותם צינור מקורר מראש שני מיליליטר.לאחר מכן מוסיפים 1.2 מיליליטר של מאגר מיצוי פוליזום, נותנים לדגימה להפשיר במשך שתי דקות, והומוגניות עם מטחנת רקמות עד לשיבוש מוחלט והומוגניות של הגושים. לאחר מכן, לדגור את הדגימות על קרח עם תסיסה עדינה במשך 10 דקות או עד שכל הדגימות עובדו צנטריפוגה ב 16, 000 פעמים G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לזרוק את הפסולת. לאחר מכן, לשחזר את supernatant, ולחזור על שלב צנטריפוגה.לאחר שחזור זהיר של תמצית הציטוזולית המזוהרת, העבר 200 מיקרוליטר אליקוט לצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי של 1.5 מיליליטר לבידוד מוחלט. לאחר מכן, יוצקים 4.5 מיליליטר של שכבת 33.5% סוכרוז לתוך צינורות צנטריפוגה, ולהוסיף 4.5 מיליליטר של שכבת 12% בזהירות ובאיטיות עם P-1000 micropipette. לאחר מכן, לשים את הצינורות על הקרח עד תוספת של תמצית cytosolic הבהיר.העמיסו מיליליטר אחד של תמצית ציטוזולית מזוקקת על גבי כרית הסוכרוז על ידי ניפוח בזהירות על הדופן הצדדית של הצינור. לאחר מכן, העבירו את צינורות האולטרה-צנטריפוגה לדליים מקוררים מראש, ואת הצנטריפוגה ב-217, 874 G למשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת התמצית הציטוזולית הנותרת וכרית סוכרוז, השהה מחדש את הכדור הפוליסומלי עם 200 מיקרוליטר של חיץ השעיה מחדש מקורר מראש.לאחר מכן, לדגור במשך 30 דקות על קרח, ולאחר מכן להעביר את ההשעיה מחדש polysomal ל 1.5 מיליליטר צינורות מקורר מראש להמשיך עם מיצוי RNA. לאחר הומוגניזציה של הדגימות עם 750 מיקרוליטרים של ריאגנט בידוד RNA דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוסיף 200 microliters של כלורופורם קר, ולנער את הצינורות במרץ במשך 15 שניות.לאחר מכן, לדגור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס להפרדת פאזה, ולהעביר 500 microliters של הפאזה המימית העליונה לצינור נקי מבלי להפריע את השלב האורגני ורוד. לאחר מכן, הוסף 375 מיקרוליטר של איזופרופנול קר ו -0.5 מיקרוליטר של גליקוגן חופשי RNAs.לאחר מכן, ערבבו היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה. לדגום את התערובת במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים G במשך 15 דקות. לאחר מכן, להשליך את supernatant, ולשטוף את משקע RNA עם מיליליטר אחד של קור, 75% אתנול.מערבבים על ידי מערבולת קצרה. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 7, 500 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. יש להשליך את הסופר-נטנט, ולייבש באוויר את גלולת ה-RNA.לאחר מכן, ממיסים את הכדור ב-50 מיקרוליטרים של מים חופשיים מ-RNAs, ודוגרים בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הערך את ריכוז ה-RNA ואת שלמותו באמצעות אלקטרופורזה נימית רגישה ביותר, או אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז נטול RNAs של 2%. לאחר הערכת נפח הדגימה, הוסף 0.1 כרכים של שלושה נתרן אצטט טוחן, שלושה נפחים של אתנול קר, ו 0.5 מיקרוליטר של RNAs, גליקוגן חופשי.לאחר מכן, מערבבים אותם היטב. אלקטרופורזה נימית בוצעה עבור מספר שברי דגימת RNA כוללים ופוליסומליים, אשר הדגימו רצועות RNA ריבוזומליות חדות, ללא כל מראה מרוח. עם זאת, זה לא בא לידי ביטוי בערכי RIN, כפי שהם נעים בין 5.9 ל 7.5, אשר מתאים דגימות שאינן שלמות.הביואנליזה לא הצליחה לזהות את פסגות ה-18S וה-25S כפי שהן נראות באלקטרופרוגרמות, הן עבור דגימות RNA כוללות והן עבור דגימות RNA הקשורות לפוליזום. לא היה שום סימן חזותי של השפלה במדגם. עם זאת, מדגם נותח כדי לדמיין את התוצאה של מדגם מושפל כמעט לחלוטין, לשם השוואה.הדבר החשוב ביותר הוא לעבוד בתנאים משמרים פוליזום ורנ"א במהלך כל הפרוטוקול. לאחר ריצוף שברי ה-RNA הכוללים והנקובים ניתן להשתמש בתבניות סטנדרטיות לביטוי הגנים שנותחו כדי לזהות גנים מבטאים דיפרנציאליים ברמת השעתוק והתרגום.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

גזירה של תאי לב ותאים מתאי גזע עובריים

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

שיטה מהירה ויעילה עבור טיהור של תאים האנדודרם המופקים מתאי גזע עובריים אנושיים

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

הקמת תאי tetraploid Proliferative מ Nontransformed אדם פיברובלסטים

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

בידוד יעיל של איי פונקציונלית מן היילודים עכבר לבלב

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

גישה סטנדרטית עבור multispecies טיהור תאים יונקים זכר יונקים על ידי דיסוציאציה רקמות מכנית זרימת cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

שחרור הדמיה מתוך דיסק כנף של דרוזופילה

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

מתרגם הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) כדי לחקור את התפתחות השורש של הספר הבסיסי בקנה מידה ספציפי לסוג תא

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

דור של מסלקי בלסטודרם נאיביים מעוברי דגי זברה

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos

בידוד של פרדיפוציטים מעוברי אפרוחי ברוילר

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. ...