Name: polysome purification from soybean symbiotic nodules
Uploaded: 2022-07-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules at JoVE.com

Questa ricerca è stata finanziata dalla sovvenzione CSIC I + D 2020 n. 282, dalla sovvenzione FVF 2017 n. 210 e PEDECIBA (María Martha Sainz).

1. Crescita delle piante e inoculazione dei rizobi
<ol><li>Per generare i noduli necessari, seminare i semi di soia scelti nel substrato selezionato in una camera di crescita in condizioni controllate. NOTA: In questo protocollo, i semi sono stati seminati in una bottiglia di plastica da 0,5 L riempita con una miscela di sabbia: vermiculite (1: 1). La camera di crescita è stata impostata con una temperatura del ciclo giorno/notte di 28 °C / 20 °C, rispettivamente, e un fotoperiodo luce/oscurità ...

<ol>
	<li>Limpens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-+and+tissue-specific+transcriptome+analyses+of+Medicago+truncatula+root+nodules.">Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules.</a> PLoS ONE. 8 (5), 64377 (2013).</li><li>Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+nitrogen-fixing+symbiosis+with+legumes:+How+many+rhizobium+recipes.">Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes: How many rhizobium recipes.</a> Trends in Microbiology. 17 (10), 458-466 (2009).</li><li>King, H. A., Gerber, A. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genome-wide+changes+in+the+translatome+of+Arabidopsis+seedlings+subjected+to+heat+stress.">Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress.</a> PloS ONE. 8 (8), 71425 (2013).</li><li>Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+new+world+of+the+genome+with+DNA+microarrays.">Exploring the new world of the genome with DNA microarrays.</a> Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).</li><li>Krishnamurthy, A., Ferl, R. J., Paul, A. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+RNA-Seq+and+microarray+gene+expression+data+in+two+zones+of+the+Arabidopsis+root+apex+relevant+to+spaceflight.">Comparing RNA-Seq and microarray gene expression data in two zones of the Arabidopsis root apex relevant to spaceflight.</a> Applications in Plant Sciences. 6 (11), 1197 (2018).</li><li>Shulse, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+transcriptome+profiling+of+plant+cell+types.">High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types.</a> Cell Reports. 27 (7), 2241-2247 (2019).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+A+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Kawaguchi, R., Girke, T., Bray, E. 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M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Marcel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>. Sickle: A sliding-window, adaptive, quality-based trimming tool for FastQ files (Version 1.33) Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/najoshi/sickle">https://github.com/najoshi/sickle</a> (2011)</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. 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S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+the+what,+when,+where+and+how+of+protein+synthesis.">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 16 (11), 651-664 (2015).</li><li>Eastman, G., Smircich, P., Sotelo-Silveira, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+ribosome+footprints+to+understand+translation+at+a+genome+wide+level.">Following ribosome footprints to understand translation at a genome wide level.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 167-176 (2018).</li><li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host.">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 618-630 (2012).</li></ol>

Studiare la regolazione dell'espressione genica a livello traslazionale è fondamentale per comprendere meglio i diversi processi biologici poiché l'endpoint dell'espressione genica cellulare è l'abbondanza proteica13,14. Questo può essere valutato analizzando il translatoma del tessuto o dell'organismo di interesse per il quale la frazione polisomiale deve essere purificata e i suoi mRNA associati analizzati 3,4,34,35,36.<su...

Le leguminose, come la soia (Glycine max), possono stabilire simbiosi con specifici batteri del suolo chiamati rizobia. Questa relazione mutualistica provoca la formazione di nuovi organi, i noduli simbiotici, sulle radici delle piante. I noduli sono gli organi vegetali che ospitano i batteri e sono costituiti da cellule ospiti il cui citoplasma è colonizzato con una forma specializzata di rizobia chiamata batterioidi. Questi batterioidi catalizzano la riduzione dell'azoto atmosferico (N 2) in ammoniaca, che viene trasferita alla pianta in cambio di carboidrati 1,2.
Sebbene questa simbiosi azotofissatrice sia una delle simbiosi pianta-microbo più studiate, molti aspetti rimangono da comprendere meglio, come il modo in cui le piante sottoposte a diverse condizioni di stress abiotico modulano la loro interazione con il loro partner simbiotico e come questo influisce sul metabolismo dei noduli. Questi processi potrebbero essere meglio compresi analizzando il translatoma dei noduli (cioè, il sottoinsieme di RNA messaggeri [mRNA] attivamente tradotti). I poliribosomi o polisomi sono complessi di ribosomi multipli associati all'mRNA, comunemente usati per studiare la traduzione3. Il metodo di profilazione dei polisomi consiste nell'analisi degli mRNA associati ai polisomi ed è stato utilizzato con successo per studiare i meccanismi posttrascrizionali che controllano l'espressione genica che avviene in diversi processi biologici 4,5.
Storicamente, l'analisi dell'espressione del genoma si è concentrata principalmente sulla determinazione dell'abbondanza di mRNA 6,7,8,9. Tuttavia, vi è una mancanza di correlazione tra i livelli di trascrizione e proteina a causa delle diverse fasi di regolazione posttrascrizionale dell'espressione genica, in particolare la traduzione10,11,12. Inoltre, non è stata osservata alcuna dipendenza tra i cambiamenti a livello del trascrittoma e quelli che si verificano a livello del translatoma13. L'analisi diretta dell'insieme di mRNA che vengono tradotti consente una misura più accurata e completa dell'espressione genica cellulare (il cui endpoint è l'abbondanza proteica) rispetto a quella ottenuta quando vengono analizzati solo i livelli di mRNA14,15,16.
Questo protocollo descrive come i polisomi di origine vegetale vengono purificati dai noduli di soia intatti mediante centrifugazione differenziale attraverso un cuscino di saccarosio a due strati (Figura 1). Tuttavia, poiché nei noduli sono presenti anche ribosomi di derivazione batterioide, viene purificato un mix di ribosomi e specie di RNA, anche se quelli eucariotici rappresentano la frazione principale (90%-95%). Vengono inoltre descritti il successivo isolamento, quantificazione e controllo di qualità dell'RNA (Figura 1). Questo protocollo, in combinazione con RNA-seq, dovrebbe fornire risultati sperimentali sulla regolazione traslazionale degli mRNA eucariotici in un tessuto complesso come il nodulo simbiotico.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64269/64269fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica schematica della metodologia proposta per la purificazione dei polisomi eucariotici da noduli simbiotici. Lo schema fornisce una panoramica delle fasi seguite nel protocollo da (1) crescita delle piante e (2) raccolta di noduli a (3) preparazione degli estratti citosolici, (3) ottenimento di campioni TOTAL e (4) campioni PAR e (5) estrazione dell'RNA e controllo di qualità. Abbreviazioni: PEB = tampone di estrazione dei polisomi; RB = buffer di risospensione; TOTALE = RNA totale; PAR = mRNA associato ai polisomi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64269/64269fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plant growth and rhizobia inoculation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Daihan Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Model SHO-1D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YEM-medium</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J850 (yeast extract) 0122 (mannitol)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water deficit treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>221295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porometer</td>
			<td>Decagon Device</td>
			<td></td>
			<td>Model SC-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of cytosolic extracts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij L23</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Model 2K15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloranphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA 360</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tissue grinder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12649595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15504-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing dish&#160;</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>1911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of sucrose cushions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 40 Ti rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Optima L-100K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td>13.2 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction and quality control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>DI</td>
			<td>41191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Dorwil</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>3032-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10814-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol LS</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>102960028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>10-0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 10 &#181;L</td>
			<td>BioPointe Scientific</td>
			<td>321-4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 1000 &#181;L</td>
			<td>BioPointe Scientific</td>
			<td>361-1050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 20 &#181;L</td>
			<td>BioPointe Scientific</td>
			<td>341-4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 200 &#181;L</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>528104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>500020-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing company</td>
			<td>Macrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 250 mL flask</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>4110207</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome purification from soybean symbiotic nodules

Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire una strategia per lo studio del translatoma eucariotico del nodulo simbiotico di soia (Glycine max). Questo articolo descrive metodi ottimizzati per isolare i poliribosomi di origine vegetale e i loro mRNA associati da analizzare utilizzando il sequenziamento dell'RNA. In primo luogo, i lisati citoplasmatici sono ottenuti attraverso l'omogeneizzazione in condizioni di conservazione di polisomi e RNA da noduli di soia interi e congelati. Quindi, i lisati vengono eliminati mediante centrifugazione a bassa velocità e il 15% del surnatante viene utilizzato per l'isolamento totale dell'RNA (TOTAL). Il restante lisato eliminato viene utilizzato per isolare i polisomi mediante ultracentrifugazione attraverso un cuscino di saccarosio a due strati (12% e 33,5%). L'mRNA associato ai polisomi (PAR) viene purificato dai pellet polisomiali dopo la risospensione. Sia TOTAL che PAR sono valutati mediante elettroforesi capillare altamente sensibile per soddisfare gli standard di qualità delle librerie di sequenziamento per RNA-seq. Come esempio di applicazione a valle, dopo il sequenziamento, è possibile utilizzare pipeline standard per l'analisi dell'espressione genica per ottenere geni differenzialmente espressi a livello di trascrittoma e translatoma. In sintesi, questo metodo, in combinazione con RNA-seq, permette lo studio della regolazione traslazionale degli mRNA eucariotici in un tessuto complesso come il nodulo simbiotico.

La valutazione quantitativa e qualitativa delle frazioni TOTAL e PAR purificate con la procedura sopra menzionata è fondamentale per determinarne il successo, poiché per la maggior parte delle applicazioni a valle, come il sequenziamento dell'RNA, campioni di alta qualità sono fondamentali per la preparazione e il sequenziamento della libreria. Inoltre, l'integrità delle molecole di RNA consente la cattura di un'istantanea del profilo di espressione genica al momento della raccolta del campione18</s...

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Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules

Questo protocollo descrive un metodo per la purificazione dei polisomi eucariotici da noduli di soia intatti. Dopo il sequenziamento, le pipeline standard per l'analisi dell'espressione genica possono essere utilizzate per identificare geni differenzialmente espressi a livello di trascrittoma e translatoma.

Purificazione dei polisomi dai noduli simbiotici di soia

The aim of this protocol is to provide a strategy for studying the eukaryotic translatome of the soybean (Glycine max) symbiotic nodule. This paper ...

Questo protocollo è significativo perché è, per quanto ne sappiamo, il primo a descrivere un nuovo metallo a base di centrifuga per la purificazione cinetica dei polisomi dai noduli simbiotici della soia. Il grande vantaggio di questa tecnica è che in combinazione con RNA-Seq, permette lo studio della relazione e organizzato in un tessuto complesso come il nodulo simbiotico. Per iniziare, pesare circa 0,2 grammi di noduli intatti in un piatto di pesata e trasferirli in un tubo da due millilitri pre-raffreddato.Quindi aggiungere 1,2 millilitri di tampone di estrazione dei polisomi, lasciare scongelare il campione per due minuti e omogeneizzare con una smerigliatrice tissutale fino alla completa rottura e omogeneizzazione dei noduli. Quindi, incubare i campioni su ghiaccio con delicata agitazione per 10 minuti o fino a quando tutti i campioni sono stati elaborati e centrifugare a 16.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius per pellettare i detriti. Quindi, recuperare il surnatante e ripetere il passaggio della centrifuga.Dopo aver accuratamente recuperato l'estratto citosolico chiarificato, trasferire un'aliquota da 200 microlitri in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri per un isolamento totale. Quindi, versare 4,5 millilitri dello strato di saccarosio al 33,5% nelle provette della centrifuga e aggiungere 4,5 millilitri dello strato del 12% con attenzione e lentamente con una micropipetta P-1000. Quindi, mettere i tubi sul ghiaccio fino all'aggiunta dell'estratto citosolico chiarificato.Caricare un millilitro dell'estratto citosolico chiarificato sulla parte superiore del cuscino di saccarosio mediante pipettaggio accurato sulla parete laterale del tubo. Quindi, trasferire i tubi ultra centrifuga in secchi pre-raffreddati e centrifugare a 217, 874 G per due ore a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato l'estratto citosolico rimanente e il cuscino di saccarosio, risospendere il pellet polisomiale con 200 microlitri di tampone di risospensione preraffreddato.Quindi, incubare per 30 minuti su ghiaccio, quindi trasferire la risospensione polisomiale in tubi pre-raffreddati da 1,5 millilitri per procedere con l'estrazione dell'RNA. Dopo aver omogeneizzato i campioni con 750 microlitri del reagente di isolamento dell'RNA incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 200 microlitri di cloroformio freddo e agitare vigorosamente i tubi per 15 secondi.Quindi, incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Centrifugare a 12.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius per la separazione di fase e trasferire 500 microlitri della fase acquosa superiore in un tubo pulito senza disturbare la fase organica rosa. Quindi, aggiungere 375 microlitri di isopropanolo freddo e 0,5 microlitri di glicogeno libero RNA.Successivamente, mescolare accuratamente pipettando su e giù. Incubare la miscela per 10 minuti a quattro gradi Celsius e centrifugare a 12.000 volte G per 15 minuti. Quindi, scartare il surnatante e lavare il precipitato di RNA con un millilitro di etanolo freddo al 75%.Mescolare per breve vortice. Quindi, centrifugare a 7.500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e asciugare all'aria il pellet di RNA.Quindi, sciogliere il pellet in 50 microlitri di acqua libera da RNA e incubare a 65 gradi Celsius per cinque minuti. Valutare la concentrazione e l'integrità dell'RNA con elettroforesi capillare altamente sensibile e/o elettroforesi su un gel di agarosio libero al 2%. Dopo aver stimato il volume del campione, aggiungere 0,1 volumi di tre molari di acetato di sodio, tre volumi di etanolo freddo e 0,5 microlitri di RNA, glicogeno libero.Quindi, mescolarli accuratamente. L'elettroforesi capillare è stata eseguita per diverse frazioni di campione di RNA associate totali e polisomiali, che hanno dimostrato bande di RNA ribosomiale affilate, senza alcun aspetto spalmato. Tuttavia, ciò non si riflette nei valori RIN, poiché variano tra 5,9 e 7,5, che corrisponde a campioni non intatti.Il bioanalizzatore non è riuscito a identificare i picchi 18S e 25S come si vede negli elettroferogrammi, sia per campioni di RNA totali che associati ai polisomi. Non c'era alcun segno visivo di degradazione del campione. Tuttavia, un campione è stato analizzato per visualizzare il risultato di un campione quasi interamente degradato, per il confronto.La cosa più importante è lavorare in condizioni di conservazione dei polisomi e dell'RNA durante l'intero protocollo. Dopo aver sequenziato le frazioni totali e par RNA, i modelli standard per l'espressione genica analizzata possono essere utilizzati per identificare geni differenziali espressi a livello di trascrizione e traduzione.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Derivazione di cellule cardiache progenitrici di cellule staminali embrionali

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

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Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte

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A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

Un metodo rapido ed efficace per la purificazione delle cellule endoderma generato da cellule staminali embrionali umane

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