Name: polysome purification from soybean symbiotic nodules
Uploaded: 2022-07-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules at JoVE.com

Denne forskningen ble finansiert av CSIC I + D 2020-stipend nr. 282, FVF 2017-stipend nr. 210 og PEDECIBA (María Martha Sainz).

1. Plantevekst og rhizobia inokulasjon
<ol><li>For å generere de nødvendige knutene, så soyabønnefrøene som er valgt i det valgte substratet i et vekstkammer under kontrollerte forhold. MERK: I denne protokollen ble frø sådd i en 0,5 L plastflaske fylt med en blanding av sand: vermikulitt (1: 1). Vekstkammeret ble satt med en dag/natt-syklustemperatur på henholdsvis 28 °C/20 °C og en lys/mørke-fotoperiode på 16 timer/8 timer. Den fotosyntetisk aktive strålingsintensiteten var 620 μmol?...

<ol>
	<li>Limpens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-+and+tissue-specific+transcriptome+analyses+of+Medicago+truncatula+root+nodules.">Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules.</a> PLoS ONE. 8 (5), 64377 (2013).</li><li>Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+nitrogen-fixing+symbiosis+with+legumes:+How+many+rhizobium+recipes.">Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes: How many rhizobium recipes.</a> Trends in Microbiology. 17 (10), 458-466 (2009).</li><li>King, H. A., Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translatome+profiling:+Methods+for+genome-scale+analysis+of+mRNA+translation.">Translatome profiling: Methods for genome-scale analysis of mRNA translation.</a> Briefings in Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2014).</li><li>Chass&#233;, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).</li><li>Y&#225;ng&#252;ez, E., Castro-Sanz, A. B., Fern&#225;ndez-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genome-wide+changes+in+the+translatome+of+Arabidopsis+seedlings+subjected+to+heat+stress.">Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress.</a> PloS ONE. 8 (8), 71425 (2013).</li><li>Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+new+world+of+the+genome+with+DNA+microarrays.">Exploring the new world of the genome with DNA microarrays.</a> Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).</li><li>Krishnamurthy, A., Ferl, R. J., Paul, A. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+RNA-Seq+and+microarray+gene+expression+data+in+two+zones+of+the+Arabidopsis+root+apex+relevant+to+spaceflight.">Comparing RNA-Seq and microarray gene expression data in two zones of the Arabidopsis root apex relevant to spaceflight.</a> Applications in Plant Sciences. 6 (11), 1197 (2018).</li><li>Shulse, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+transcriptome+profiling+of+plant+cell+types.">High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types.</a> Cell Reports. 27 (7), 2241-2247 (2019).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+A+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Kawaguchi, R., Girke, T., Bray, E. A., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+mRNA+translation+contributes+to+gene+regulation+under+non-stress+and+dehydration+stress+conditions+in+Arabidopsis+thaliana.">Differential mRNA translation contributes to gene regulation under non-stress and dehydration stress conditions in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 38 (5), 823-839 (2004).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).</li><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+regulation+of+protein+abundance+from+proteomics+and+transcriptomis+analyses.">Insights into regulation of protein abundance from proteomics and transcriptomis analyses.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2013).</li><li>Tebaldi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+uncoupling+between+transcriptome+and+translatome+variations+after+a+stimulus+in+mammalian+cells.">Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells.</a> BMC Genomics. 13 (220), 1-15 (2012).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+mRNAs+strongly+correlate+to+proteins+in+a+multivariate+manner+and+their+translation+ratios+are+phenotype+specific.">Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific.</a> Nucleic Acids Research. 41 (9), 4743-4754 (2013).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+New+views+of+translation,+from+single+codons+to+genome+scale.">Ribosome profiling: New views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).</li><li>Lukoszek, R., Feist, P., Ignatova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+adaptive+response+of+Arabidopsis+thaliana+to+prolonged+thermal+stress+by+ribosomal+profiling+and+RNA-Seq.">Insights into the adaptive response of Arabidopsis thaliana to prolonged thermal stress by ribosomal profiling and RNA-Seq.</a> BMC Plant Biology. 16 (1), 1-13 (2016).</li><li>Broughton, W. J., Dilworth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+leghaemoglobin+synthesis+in+snake+beans.">Control of leghaemoglobin synthesis in snake beans.</a> Biochemical Journal. 125 (4), 1075-1080 (1971).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+An+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).</li><li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondenaturing+agarose+gel+electrophoresis+of+RNA+nondenaturing+agarose+gel+electrophoresis+of+RNA.">Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), 1-3 (2012).</li><li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., K&#228;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+Summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Marcel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>. Sickle: A sliding-window, adaptive, quality-based trimming tool for FastQ files (Version 1.33) Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/najoshi/sickle">https://github.com/najoshi/sickle</a> (2011)</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+Accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14 (4), 1-13 (2013).</li><li>Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmon+provides+fast+and+bias-aware+quantification+of+transcript+expression.">Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression.</a> Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).</li><li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=featureCounts:+An+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features.">featureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+A+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (550), 1-21 (2014).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).</li><li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Galaxy+platform+for+accessible,+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses:+2018+update.">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update.</a> Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).</li><li>Hunt, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEOexplorer:+A+webserver+for+gene+expression+analysis+and+visualisation.">GEOexplorer: A webserver for gene expression analysis and visualisation.</a> Nucleic Acids Research. , (2022).</li><li>Imbeaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1-12 (2005).</li><li>Di Paolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDCD4+regulates+axonal+growth+by+translational+repression+of+neurite+growth-related+genes+and+is+modulated+during+nerve+injury+responses.">PDCD4 regulates axonal growth by translational repression of neurite growth-related genes and is modulated during nerve injury responses.</a> RNA. 26 (11), 1637-1653 (2020).</li><li>Smircich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+translation+control+as+a+key+mechanism+generating+differential+gene+expression+in+Trypanosoma+cruzi.">Ribosome profiling reveals translation control as a key mechanism generating differential gene expression in Trypanosoma cruzi.</a> BMC Genomics. 16 (1), 443 (2015).</li><li>Eastman, G., Sharlow, E. R., Lazo, J. S., Bloom, G. S., Sotelo-Silveira, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+and+translatome+regulation+of+pathogenesis+in+Alzheimer's+disease+model+mice.">Transcriptome and translatome regulation of pathogenesis in Alzheimer's disease model mice.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 86 (1), 365-386 (2022).</li><li>Zanetti, M. E., Chang, I. -. F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopurification+of+polyribosomal+complexes+of+Arabidopsis+for+global+analysis+of+gene+expression.">Immunopurification of polyribosomal complexes of Arabidopsis for global analysis of gene expression.</a> Plant physiology. 138 (2), 624-635 (2005).</li><li>Mustroph, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis.">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18843-11848 (2009).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+the+what,+when,+where+and+how+of+protein+synthesis.">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 16 (11), 651-664 (2015).</li><li>Eastman, G., Smircich, P., Sotelo-Silveira, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+ribosome+footprints+to+understand+translation+at+a+genome+wide+level.">Following ribosome footprints to understand translation at a genome wide level.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 167-176 (2018).</li><li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host.">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 618-630 (2012).</li></ol>

Å studere regulering av genuttrykk på translasjonsnivå er avgjørende for å bedre forstå forskjellige biologiske prosesser siden endepunktet for cellegenuttrykk er proteinoverflod13,14. Dette kan vurderes ved å analysere translatomet av vevet eller organismen av interesse som den polysomale fraksjonen skal renses for og tilhørende mRNA analyseres 3,4,34,35,36.<sup...

Leguminøse planter, som soyabønne (Glycine max), kan etablere symbiose med spesifikke jordbakterier kalt rhizobia. Dette mutualistiske forholdet fremkaller dannelsen av nye organer, de symbiotiske knutene, på planterøttene. Knutene er planteorganene som er vert for bakteriene og består av vertsceller hvis cytoplasma er kolonisert med en spesialisert form for rhizobia kalt bakterier. Disse bakterieoidene katalyserer reduksjonen av atmosfærisk nitrogen (N 2) til ammoniakk, som overføres til planten i retur for karbohydrater 1,2.
Selv om denne nitrogenfikserende symbiosen er en av de mest studerte plantemikrobesymbiosene, gjenstår mange aspekter å bli bedre forstått, for eksempel hvordan planter utsatt for forskjellige abiotiske stressforhold modulerer samspillet med deres symbiotiske partner og hvordan dette påvirker knutemetabolismen. Disse prosessene kan forstås bedre ved å analysere knutetranslatomet (dvs. delmengden av messenger-RNA [mRNA] aktivt oversatt). Polyribosomer eller polysomer er komplekser av flere ribosomer assosiert med mRNA, som vanligvis brukes til å studere oversettelse3. Polysomprofileringsmetoden består av analysen av mRNA assosiert med polysomer og har blitt brukt til å studere posttranskripsjonsmekanismer som styrer genuttrykk som forekommer i ulike biologiske prosesser 4,5.
Historisk sett har genomuttrykksanalyse primært fokusert på å bestemme mRNA-overflod 6,7,8,9. Imidlertid er det mangel på korrelasjon mellom transkripsjon og proteinnivåer på grunn av de forskjellige stadiene av posttranskripsjonell regulering av genuttrykk, spesielt oversettelse10,11,12. Videre er det ikke observert avhengighet mellom endringene på transkriptomnivået og de som forekommer på translatomnivået13. Den direkte analysen av settet av mRNA som oversettes, tillater en mer nøyaktig og fullstendig måling av cellegenuttrykket (hvis endepunkt er proteinoverflod) enn det som oppnås når bare mRNA-nivåer analyseres14,15,16.
Denne protokollen beskriver hvordan planteavledede polysomer renses fra intakte soyabønneknuter ved differensiell sentrifugering gjennom en tolags sukrosepute (figur 1). Men siden bakterieformede ribosomer også er tilstede i knutene, blir en blanding av ribosomer og RNA-arter renset, selv om de eukaryote representerer hovedfraksjonen (90% -95%). Den påfølgende RNA-isolasjonen, kvantifiseringen og kvalitetskontrollen er også beskrevet (figur 1). Denne protokollen, i kombinasjon med RNA-seq, skal gi eksperimentelle resultater på translasjonsregulering av eukaryote mRNA i et komplekst vev som den symbiotiske knuten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64269/64269fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk oversikt over foreslått metodikk for eukaryotisk polysomrensing fra symbiotiske knuter. Ordningen gir en oversikt over trinnene som følges i protokollen fra (1) plantevekst og (2) knutehøsting til (3) fremstilling av cytosoliske ekstrakter, (3) innhenting av TOTAL-prøver og (4) PAR-prøver, og (5) RNA-ekstraksjon og kvalitetskontroll. Forkortelser: PEB = polysomekstraksjonsbuffer; RB = resuspension buffer; TOTALT = totalt RNA; PAR = polysomassosiert mRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64269/64269fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plant growth and rhizobia inoculation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Daihan Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Model SHO-1D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YEM-medium</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J850 (yeast extract) 0122 (mannitol)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water deficit treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>221295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porometer</td>
			<td>Decagon Device</td>
			<td></td>
			<td>Model SC-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of cytosolic extracts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij L23</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Model 2K15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloranphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA 360</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tissue grinder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12649595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15504-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing dish&#160;</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>1911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of sucrose cushions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 40 Ti rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Optima L-100K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td>13.2 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction and quality control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>DI</td>
			<td>41191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Dorwil</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>3032-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10814-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol LS</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>102960028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>10-0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 10 &#181;L</td>
			<td>BioPointe Scientific</td>
			<td>321-4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 1000 &#181;L</td>
			<td>BioPointe Scientific</td>
			<td>361-1050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 20 &#181;L</td>
			<td>BioPointe Scientific</td>
			<td>341-4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 200 &#181;L</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>528104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>500020-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing company</td>
			<td>Macrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 250 mL flask</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>4110207</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome purification from soybean symbiotic nodules

Målet med denne protokollen er å gi en strategi for å studere eukaryotisk translatom av soyabønner (Glycine max) symbiotisk knute. Dette papiret beskriver metoder optimalisert for å isolere planteavledede polyribosomer og deres tilhørende mRNA som skal analyseres ved hjelp av RNA-sekvensering. Først oppnås cytoplasmatiske lysater gjennom homogenisering i polysom- og RNA-bevarende forhold fra hele, frosne soyabønneknuter. Deretter fjernes lysater ved lavhastighets sentrifugering, og 15% av supernatanten brukes til total RNA (TOTAL) isolasjon. Det gjenværende klarerte lysatet brukes til å isolere polysomer ved ultrasentrifugering gjennom en tolags sukrosepute (12% og 33,5%). Polysomassosiert mRNA (PAR) renses fra polysomale pellets etter resuspendering. Både TOTAL og PAR evalueres ved høysensitiv kapillærelektroforese for å oppfylle kvalitetsstandardene for sekvenseringsbiblioteker for RNA-seq. Som et eksempel på en nedstrøms applikasjon, etter sekvensering, kan standard rørledninger for genuttrykksanalyse brukes til å oppnå differensielt uttrykte gener på transkriptom- og translatomnivå. Oppsummert tillater denne metoden, i kombinasjon med RNA-seq, studiet av translasjonsreguleringen av eukaryote mRNA i et komplekst vev som den symbiotiske knuten.

Kvantitets- og kvalitetsvurderingen av TOTAL- og PAR-fraksjonene renset med ovennevnte prosedyre er nøkkelen til å bestemme suksessen, siden for de fleste nedstrømsapplikasjoner, for eksempel RNA-sekvensering, er prøver av høy kvalitet grunnleggende for bibliotekforberedelse og sekvensering. Videre tillater integriteten til RNA-molekylene fangst av et øyeblikksbilde av genuttrykksprofilen i øyeblikket av prøveinnsamling18. I denne sammenheng oppnås et RNA-integritetsnummer (RIN) ved utfø...

Watch this Scientific Journal Video about Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules at JoVE.com

Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules

Denne protokollen beskriver en metode for eukaryotisk polysomrensing fra intakte soyabønneknuter. Etter sekvensering kan standard rørledninger for genuttrykksanalyse brukes til å identifisere differensielt uttrykte gener på transkriptom- og translatomnivå.

Polysom rensing fra soyabønner Symbiotic Nodules

The aim of this protocol is to provide a strategy for studying the eukaryotic translatome of the soybean (Glycine max) symbiotic nodule. This paper ...

Denne protokollen er viktig fordi den er, så vidt vi vet, den første som beskriver et nytt sentrifugebasert metall for kinetisk polysomrensing fra soyabønne symbiotiske knuter. Den store fordelen med denne teknikken er at i kombinasjon med RNA-Seq, tillater studiet av forholdet og organisert i et komplekst vev som den symbiotiske knuten. Til å begynne med veier du omtrent 0,2 gram intakte knuter i en veieskål, og overfører dem til et forkjølt to milliliter rør.Tilsett deretter 1, 2 ml polysomekstraksjonsbuffer, la prøven tine i to minutter, og homogeniser med en vevkvern til fullstendig forstyrrelse og homogenisering av knutene. Deretter inkuberer du prøvene på is med mild omrøring i 10 minutter eller til alle prøvene er behandlet og sentrifugerer ved 16.000 ganger G i 15 minutter ved fire grader Celsius for å pelletere ruskene. Deretter gjenoppretter du supernatanten, og gjentar sentrifugetrinnet.Etter nøye gjenvinning av det avklarte cytosoliske ekstraktet, overfør en 200 mikroliter aliquot til et rent 1,5 milliliter mikrosentrifugerør for total isolasjon. Hell deretter 4,5 milliliter av 33,5% sukroselaget i sentrifugerørene, og tilsett 4,5 milliliter av 12%-laget forsiktig og sakte med en P-1000 mikropipette. Deretter legger du rørene på is til tilsetning av det avklarte cytosoliske ekstraktet.Legg en milliliter av det avklarte cytosoliske ekstraktet på toppen av sukroseputen ved forsiktig pipettering på rørets sidevegg. Overfør deretter ultrasentrifugerørene til forkjølte bøtter, og sentrifuger ved 217 874 G i to timer ved fire grader Celsius. Etter å ha kastet det gjenværende cytosoliske ekstraktet og sukroseputen, suspenderer du den polysomale pelleten på nytt med 200 mikroliter forkjølt re-suspensjonsbuffer.Deretter inkuberer du i 30 minutter på is, og overfører deretter den polysomale re-suspensjonen til 1,5 milliliter forkjølte rør for å fortsette med RNA-ekstraksjonen. Etter homogenisering av prøvene med 750 mikroliter av RNA-isolasjonsreagenset inkuberes i fem minutter ved romtemperatur. Tilsett deretter 200 mikroliter kald kloroform, og rist rørene kraftig i 15 sekunder.Deretter ruges ved romtemperatur i 10 minutter. Sentrifuge ved 12.000 ganger G i 15 minutter ved fire grader Celsius for faseseparasjon, og overfør 500 mikroliter av den øvre vandige fasen til et rent rør uten å forstyrre den rosa organiske fasen. Deretter tilsettes 375 mikroliter kald isopropanol og 0,5 mikroliter RNA-fri glykogen.Etterpå blandes grundig ved pipettering opp og ned. Inkuber blandingen i 10 minutter ved fire grader Celsius, og sentrifuger ved 12.000 ganger G i 15 minutter. Kast deretter supernatanten, og vask RNA-bunnfallet med en milliliter kald, 75% etanol.Bland ved kort vortexing. Deretter sentrifuger ved 7.500 G i fem minutter ved fire grader Celsius. Kast supernatanten, og lufttørk RNA-pelleten.Oppløs deretter pelleten i 50 mikroliter RNA-fritt vann, og inkuber ved 65 grader Celsius i fem minutter. Vurder RNA-konsentrasjonen og integriteten med svært sensitiv kapillærelektroforese og, eller elektroforese på en 2% RNA-fri agarosegel. Etter estimering av prøvevolumet, tilsett 0,1 volumer av tre molar natriumacetat, tre volumer kald etanol og 0,5 mikroliter RNA, fri glykogen.Bland dem deretter grundig. Kapillærelektroforese ble utført for flere totale og polysomale assosierte RNA-prøvefraksjoner, som viste skarpe ribosomale RNA-bånd, uten smurt utseende. Dette gjenspeiles imidlertid ikke i RIN-verdiene, da de varierer mellom 5,9 og 7,5, noe som tilsvarer ikke-intakte prøver.Bioanalysatoren klarte ikke å identifisere 18S- og 25S-toppene som sett i elektroferogrammene, både for totale og polysomassosierte RNA-prøver. Det var ingen visuelle tegn på prøveforringelse. Imidlertid ble en prøve analysert for å visualisere resultatet av nesten helt degradert prøve, for sammenligning.Det viktigste er å jobbe i polysom- og RNA-bevarende forhold under hele protokollen. Etter sekvensering kan de totale og par RNA-fraksjonene standardmønstre for det analyserte genuttrykket brukes til å identifisere differensialekspressgener på transkripsjons- og oversettelsesnivå.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Avledning av Cardiac stamceller fra embryonale stamceller

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Tredimensjonal Kvantifisering av dendrittutløperne fra Pyramideformet Nevroner Avledet fra menneskeskapte Pluripotent stamceller

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

En rask og effektiv metode for rensing av endoderm celler generert fra humane embryonale stamceller

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Etablering av Proliferativ Tetraploid Celler fra transformerte humane fibroblaster

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Effektiv Isolering av funksjonelle holmer fra Neonatal Mouse Pancreas

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

En standardisert tilnærming til multispecies Rensing av mammaliske mannlige kimceller ved hjelp av mekanisk vævsdissosiasjon og flytcytometri

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Imaging DPP Release fra en Drosophila vinge Disc

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Oversette ribosom affinitet rensing (TRAP) for å undersøke Arabidopsis thaliana Root Development på en celle type-spesifikk skala

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Generasjon naiv Blastoderm Explants fra Zebrafish Embryos

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos

Isolering av Preadipocytes fra Broiler Chick Embryos

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. ...