Name: polysome purification from soybean symbiotic nodules
Uploaded: 2022-07-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules at JoVE.com

Esta investigación ha sido financiada por la subvención I+D 2020 del CSIC nº 282, la subvención FVF 2017 nº 210 y PEDECIBA (María Martha Sainz).

1. Crecimiento de plantas e inoculación de rizobios
<ol><li>Para generar los nódulos requeridos, siembre las semillas de soja de elección en el sustrato seleccionado en una cámara de crecimiento bajo condiciones controladas. NOTA: En este protocolo, las semillas se sembraron en una botella de plástico de 0,5 L llena de una mezcla de arena: vermiculita (1:1). La cámara de crecimiento se estableció con una temperatura de ciclo día/noche de 28 °C / 20 °C, respectivamente, y un fotoperíodo de...

<ol>
	<li>Limpens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-+and+tissue-specific+transcriptome+analyses+of+Medicago+truncatula+root+nodules.">Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules.</a> PLoS ONE. 8 (5), 64377 (2013).</li><li>Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+nitrogen-fixing+symbiosis+with+legumes:+How+many+rhizobium+recipes.">Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes: How many rhizobium recipes.</a> Trends in Microbiology. 17 (10), 458-466 (2009).</li><li>King, H. A., Gerber, A. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genome-wide+changes+in+the+translatome+of+Arabidopsis+seedlings+subjected+to+heat+stress.">Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress.</a> PloS ONE. 8 (8), 71425 (2013).</li><li>Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+new+world+of+the+genome+with+DNA+microarrays.">Exploring the new world of the genome with DNA microarrays.</a> Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).</li><li>Krishnamurthy, A., Ferl, R. J., Paul, A. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+RNA-Seq+and+microarray+gene+expression+data+in+two+zones+of+the+Arabidopsis+root+apex+relevant+to+spaceflight.">Comparing RNA-Seq and microarray gene expression data in two zones of the Arabidopsis root apex relevant to spaceflight.</a> Applications in Plant Sciences. 6 (11), 1197 (2018).</li><li>Shulse, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+transcriptome+profiling+of+plant+cell+types.">High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types.</a> Cell Reports. 27 (7), 2241-2247 (2019).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+A+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Kawaguchi, R., Girke, T., Bray, E. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+New+views+of+translation,+from+single+codons+to+genome+scale.">Ribosome profiling: New views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).</li><li>Lukoszek, R., Feist, P., Ignatova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+adaptive+response+of+Arabidopsis+thaliana+to+prolonged+thermal+stress+by+ribosomal+profiling+and+RNA-Seq.">Insights into the adaptive response of Arabidopsis thaliana to prolonged thermal stress by ribosomal profiling and RNA-Seq.</a> BMC Plant Biology. 16 (1), 1-13 (2016).</li><li>Broughton, W. J., Dilworth, M. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+A+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (550), 1-21 (2014).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).</li><li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Galaxy+platform+for+accessible,+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses:+2018+update.">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update.</a> Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).</li><li>Hunt, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEOexplorer:+A+webserver+for+gene+expression+analysis+and+visualisation.">GEOexplorer: A webserver for gene expression analysis and visualisation.</a> Nucleic Acids Research. , (2022).</li><li>Imbeaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1-12 (2005).</li><li>Di Paolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDCD4+regulates+axonal+growth+by+translational+repression+of+neurite+growth-related+genes+and+is+modulated+during+nerve+injury+responses.">PDCD4 regulates axonal growth by translational repression of neurite growth-related genes and is modulated during nerve injury responses.</a> RNA. 26 (11), 1637-1653 (2020).</li><li>Smircich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+translation+control+as+a+key+mechanism+generating+differential+gene+expression+in+Trypanosoma+cruzi.">Ribosome profiling reveals translation control as a key mechanism generating differential gene expression in Trypanosoma cruzi.</a> BMC Genomics. 16 (1), 443 (2015).</li><li>Eastman, G., Sharlow, E. R., Lazo, J. S., Bloom, G. S., Sotelo-Silveira, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+and+translatome+regulation+of+pathogenesis+in+Alzheimer's+disease+model+mice.">Transcriptome and translatome regulation of pathogenesis in Alzheimer's disease model mice.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 86 (1), 365-386 (2022).</li><li>Zanetti, M. E., Chang, I. -. F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopurification+of+polyribosomal+complexes+of+Arabidopsis+for+global+analysis+of+gene+expression.">Immunopurification of polyribosomal complexes of Arabidopsis for global analysis of gene expression.</a> Plant physiology. 138 (2), 624-635 (2005).</li><li>Mustroph, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis.">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18843-11848 (2009).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+the+what,+when,+where+and+how+of+protein+synthesis.">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 16 (11), 651-664 (2015).</li><li>Eastman, G., Smircich, P., Sotelo-Silveira, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+ribosome+footprints+to+understand+translation+at+a+genome+wide+level.">Following ribosome footprints to understand translation at a genome wide level.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 167-176 (2018).</li><li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host.">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 618-630 (2012).</li></ol>

El estudio de la regulación de la expresión génica a nivel traslacional es fundamental para comprender mejor los diferentes procesos biológicos, ya que el punto final de la expresión génica celular es la abundancia de proteínas13,14. Esto se puede evaluar analizando el translatomo del tejido u organismo de interés para el cual se debe purificar la fracción polisomal y analizar sus ARNm asociados 3,4,34,35,36.<sup class=...

Las plantas leguminosas, como la soja (Glycine max), pueden establecer simbiosis con bacterias específicas del suelo llamadas rizobios. Esta relación mutualista provoca la formación de nuevos órganos, los nódulos simbióticos, en las raíces de las plantas. Los nódulos son los órganos de la planta que albergan las bacterias y consisten en células huésped cuyo citoplasma está colonizado con una forma especializada de rizobios llamados bacteroides. Estos bacteroides catalizan la reducción del nitrógeno atmosférico (N2) en amoníaco, que se transfiere a la planta a cambio de carbohidratos 1,2.
Aunque esta simbiosis fijadora de nitrógeno es una de las simbiosis planta-microbio mejor estudiadas, quedan muchos aspectos por comprender mejor, como cómo las plantas sometidas a diferentes condiciones de estrés abiótico modulan su interacción con su pareja simbiótica y cómo esto afecta el metabolismo de los nódulos. Estos procesos podrían entenderse mejor analizando el translatomo de nódulos (es decir, el subconjunto de ARN mensajeros [ARNm] traducidos activamente). Los polirribosomas o polisomas son complejos de múltiples ribosomas asociados con el ARNm, comúnmente utilizados para estudiar la traducción3. El método de perfilado de polisomas consiste en el análisis de los ARNm asociados a polisomas y ha sido utilizado con éxito para estudiar los mecanismos posttranscripcionales que controlan la expresión génica que ocurre en diversos procesos biológicos 4,5.
Históricamente, el análisis de expresión del genoma se ha centrado principalmente en determinar la abundancia de ARNm 6,7,8,9. Sin embargo, existe una falta de correlación entre la transcripción y los niveles de proteínas debido a las diferentes etapas de la regulación posttranscripcional de la expresión génica, particularmente la traducción10,11,12. Además, no se ha observado dependencia entre los cambios a nivel del transcriptoma y los que ocurren a nivel del translatomo13. El análisis directo del conjunto de ARNm que se están traduciendo permite una medición más precisa y completa de la expresión génica celular (cuyo punto final es la abundancia de proteínas) que la obtenida cuando sólo se analizan los niveles de ARNm14,15,16.
Este protocolo describe cómo los polisomas derivados de plantas se purifican a partir de nódulos de soja intactos mediante centrifugación diferencial a través de un cojín de sacarosa de dos capas (Figura 1). Sin embargo, dado que los ribosomas derivados de bacteroides también están presentes en los nódulos, se purifica una mezcla de ribosomas y especies de ARN, aunque los eucariotas representan la fracción principal (90%-95%). También se describe el posterior aislamiento, cuantificación y control de calidad del ARN (Figura 1). Este protocolo, en combinación con RNA-seq, debería proporcionar resultados experimentales sobre la regulación traslacional de los ARNm eucariotas en un tejido complejo como el nódulo simbiótico.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64269/64269fig01.jpg"> Figura 1: Resumen esquemático de la metodología propuesta para la purificación de polisomas eucariotas a partir de nódulos simbióticos. El esquema ofrece una visión general de los pasos seguidos en el protocolo desde (1) crecimiento de plantas y (2) recolección de nódulos hasta (3) preparación de los extractos citosólicos, (3) obtención de muestras TOTAL y (4) muestras PAR, y (5) extracción de ARN y control de calidad. Abreviaturas: PEB = tampón de extracción de polisomas; RB = tampón de resuspensión; TOTAL = ARN total; PAR = ARNm asociado a polisomas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64269/64269fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plant growth and rhizobia inoculation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Daihan Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Model SHO-1D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YEM-medium</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J850 (yeast extract) 0122 (mannitol)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water deficit treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>221295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porometer</td>
			<td>Decagon Device</td>
			<td></td>
			<td>Model SC-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of cytosolic extracts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij L23</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Model 2K15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloranphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA 360</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tissue grinder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12649595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15504-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing dish&#160;</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>1911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of sucrose cushions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 40 Ti rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Optima L-100K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td>13.2 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction and quality control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>DI</td>
			<td>41191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Dorwil</td>
			<td>UN1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>3032-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10814-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol LS</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>102960028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>10-0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 10 &#181;L</td>
			<td>BioPointe Scientific</td>
			<td>321-4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 1000 &#181;L</td>
			<td>BioPointe Scientific</td>
			<td>361-1050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 20 &#181;L</td>
			<td>BioPointe Scientific</td>
			<td>341-4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips 200 &#181;L</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>528104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>500020-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing company</td>
			<td>Macrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 250 mL flask</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>4110207</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome purification from soybean symbiotic nodules

El objetivo de este protocolo es proporcionar una estrategia para estudiar el translatomo eucariota del nódulo simbiótico de soja (Glycine max). Este documento describe métodos optimizados para aislar polirribosomas derivados de plantas y sus ARNm asociados para ser analizados mediante secuenciación de ARN. En primer lugar, los lisados citoplasmáticos se obtienen mediante homogeneización en condiciones de preservación de polisomas y ARN a partir de nódulos de soja enteros congelados. Luego, los lisados se eliminan por centrifugación a baja velocidad, y el 15% del sobrenadante se usa para el aislamiento de ARN total (TOTAL). El lisado eliminado restante se utiliza para aislar polisomas por ultracentrifugación a través de un cojín de sacarosa de dos capas (12% y 33,5%). El ARNm asociado a polisomas (PAR) se purifica a partir de gránulos polisomales después de la resuspensión. Tanto TOTAL como PAR se evalúan mediante electroforesis capilar altamente sensible para cumplir con los estándares de calidad de las bibliotecas de secuenciación para RNA-seq. Como ejemplo de una aplicación posterior, después de la secuenciación, se pueden utilizar tuberías estándar para el análisis de la expresión génica para obtener genes expresados diferencialmente a nivel de transcriptoma y translatomo. En resumen, este método, en combinación con RNA-seq, permite estudiar la regulación traslacional de los ARNm eucariotas en un tejido complejo como es el nódulo simbiótico.

La evaluación de la cantidad y calidad de las fracciones TOTAL y PAR purificadas con el procedimiento mencionado anteriormente es clave para determinar su éxito, ya que para la mayoría de las aplicaciones posteriores, como la secuenciación de ARN, las muestras de alta calidad son fundamentales para la preparación y secuenciación de bibliotecas. Además, la integridad de las moléculas de ARN permite la captura de una instantánea del perfil de expresión génica en el momento de la recolección de la muestra<sup cl...

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Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules

Este protocolo describe un método para la purificación de polisomas eucariotas a partir de nódulos de soja intactos. Después de la secuenciación, se pueden utilizar tuberías estándar para el análisis de la expresión génica para identificar genes expresados diferencialmente a nivel de transcriptoma y translatomo.

Purificación de polisomas a partir de nódulos simbióticos de soja

The aim of this protocol is to provide a strategy for studying the eukaryotic translatome of the soybean (Glycine max) symbiotic nodule. This paper ...

Este protocolo es significativo porque, hasta donde sabemos, es el primero en describir un nuevo metal basado en centrífugas para la purificación cinética de polisomas a partir de nódulos simbióticos de soja. La gran ventaja de esta técnica es que en combinación con RNA-Seq, permite el estudio de la relación y organizada en un tejido complejo como es el nódulo simbiótico. Para empezar, pese aproximadamente 0,2 gramos de nódulos intactos en un plato de pesaje y transfiéralos a un tubo de dos mililitros preenfriado.Luego agregue 1.2 mililitros de tampón de extracción de polisomas, deje que la muestra se descongele durante dos minutos y homogeneice con un molinillo de tejido hasta la interrupción completa y la homogeneización de los nódulos. A continuación, incubar las muestras en hielo con una agitación suave durante 10 minutos o hasta que todas las muestras hayan sido procesadas y centrifugar a 16, 000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados para granular los desechos. Luego, recupere el sobrenadante y repita el paso de la centrífuga.Después de recuperar cuidadosamente el extracto citosólico clarificado, transfiera una alícuota de 200 microlitros a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mililitros para un aislamiento total. Luego, vierta 4.5 mililitros de la capa de sacarosa al 33.5% en los tubos de centrífuga y agregue 4.5 mililitros de la capa al 12% con cuidado y lentamente con una micropipeta P-1000. A continuación, coloque los tubos en hielo hasta la adición del extracto citosólico clarificado.Cargue un mililitro del extracto citosólico clarificado en la parte superior del cojín de sacarosa pipeteando cuidadosamente en la pared lateral del tubo. Luego, transfiera los tubos de ultracentrífuga a cubos preenfriados y centrifugar a 217, 874 G durante dos horas a cuatro grados centígrados. Después de desechar el extracto citosólico restante y el cojín de sacarosa, vuelva a suspender el pellet polisomal con 200 microlitros de tampón de resuspensión preenfriado.A continuación, incubar durante 30 minutos en hielo y luego transferir la resuspensión polisomal a tubos preenfriados de 1,5 mililitros para proceder con la extracción de ARN. Después de homogeneizar las muestras con 750 microlitros del reactivo de aislamiento de ARN incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, agregue 200 microlitros de cloroformo frío y agite los tubos vigorosamente durante 15 segundos.A continuación, incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Centrifugar a 12, 000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados para la separación de fases, y transferir 500 microlitros de la fase acuosa superior a un tubo limpio sin alterar la fase orgánica rosada. Luego, agregue 375 microlitros de isopropanol frío y 0.5 microlitros de glucógeno libre de ARN.Después, mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incubar la mezcla durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, y centrifugar a 12, 000 veces G durante 15 minutos. Luego, deseche el sobrenadante y lave el precipitado de ARN con un mililitro de etanol frío, al 75%.Mezclar por vórtice breve. A continuación, centrifugar a 7, 500 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y seque al aire el pellet de ARN.Luego, disuelva el pellet en 50 microlitros de agua libre de ARN e incube a 65 grados centígrados durante cinco minutos. Evaluar la concentración e integridad de ARN con electroforesis capilar altamente sensible y, o electroforesis en un gel de agarosa libre de ARN al 2%. Después de estimar el volumen de la muestra, agregue 0.1 volúmenes de tres molares de acetato de sodio, tres volúmenes de etanol frío y 0.5 microlitros de ARN, glucógeno libre.Luego, mézclalos bien. Se realizó electroforesis capilar para varias fracciones de muestra de ARN asociadas totales y polisomales, que demostraron bandas de ARN ribosómicas afiladas, sin ningún aspecto manchado. Sin embargo, esto no se refleja en los valores de RIN, ya que oscilan entre 5,9 y 7,5, lo que corresponde a muestras no intactas.El bioanalizador no pudo identificar los picos 18S y 25S como se ve en los electroferogramas, tanto para muestras de ARN totales como polisomas asociadas. No había signos visuales de degradación de la muestra. Sin embargo, se analizó una muestra para visualizar el resultado de una muestra casi completamente degradada, para su comparación.Lo más importante es trabajar en condiciones de preservación de polisomas y ARN durante todo el protocolo. Después de secuenciar las fracciones de ARN total y par, se pueden utilizar patrones estándar para la expresión génica analizada para identificar genes de expresión diferencial a nivel de transcripción y traducción.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Derivación de células cardiacas progenitoras a partir de células madre embrionarias

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

La cuantificación tridimensional de espinas dendríticas de piramidal neuronas derivadas de células madre humanas pluripotentes inducidas

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

Un método rápido y eficiente para la purificación de células del endodermo generada a partir de células madre embrionarias humanas

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Establecimiento de células tetraploides proliferativa de fibroblastos humanos no transformadas

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

El aislamiento efectivo de los islotes funcionales de páncreas de ratón neonatales

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Un enfoque estandarizado para la purificación multiespecífica de células germinales masculinas de mamíferos por disociación mecánica de tejidos y citometría de flujo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Imaging Dpp Liberación de un disco de ala Drosophila

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

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Traducción de la purificación de afinidad de ribosoma (TRAP) para investigar el desarrollo de la raíz de Arabidopsis thaliana a una escala específica de tipo de célula

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Generación de explantes de Blastoderm naïve a partir de embriones de pez cebra

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos

Aislamiento de preadipocitos de embriones de pollos de engorde

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. ...