Transducering af umodne thymocytter med retrovirale vektorer og dyrkning af disse celler på OP9 DL4 stromale celler er en udfordrende teknik. Denne detaljerede protokol sparer forskere tid og kræfter, mens de optimerer disse systemer. Denne teknik giver et fleksibelt in vitro-system til at studere virkningerne af genetiske modifikationer på umodne T-celler, og det kan være nyttigt til at studere T-celleudvikling og kræft.
Gisele Rodrigues, en postdoc fra mit laboratorium, vil demonstrere proceduren. Til at begynde med frø retrovirusproducentcellerne 18 til 24 timer før transfektion ved 70 til 90% sammenløb i hver brønd i en seks-brønds vævskulturplade indeholdende to milliliter retrovirusproducentcelle eller RPC-medium. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.
For at transfektere cellerne skal du udskifte mediet med frisk RPC-medium en time før transfektion. Forbered lipofektionsblandinger ved at fortynde fire mikrogram DNA indeholdende to mikrogram hjælperplasmid pCL-Eco og to mikrogram overførselsplasmid pMIG i 250 mikroliter reduceret serummedium og bland forsigtigt. Bland derefter 10 mikroliter transfektionsreagens og 250 mikroliter reduceret serummedium og inkuber i fem minutter ved stuetemperatur.
Efter fem minutters inkubation kombineres det fortyndede DNA med det fortyndede transfektionsreagens. Bland forsigtigt og inkuber i 20 til 25 minutter ved stuetemperatur. Tilsæt 500 mikroliter af DNA- og transfektionsreagensblandingen forsigtigt til brønden, der indeholder retrovirusproducentcellerne, ved at droppe dem på cellerne med en cirkulær bevægelse.
Bland forsigtigt ved at vippe pladen frem og tilbage og inkuber derefter pladen i en 37 grader Celsius inkubator i 16 til 24 timer. Ca. 16 timer efter transfektion udskiftes det gamle medium med to ml frisk RPC-medium og fortsæt med at inkubere cellerne ved 37 grader Celsius i 20 til 24 timer. For at forberede thymocyt-enkeltcellesuspensionen anbringes en høstet thymus fra euthaniserede mus i fem ml PBS i en petriskål.
Brug sterile glasskinner til at placere thymus mellem diasens frostede overflader og gnide forsigtigt diasene sammen og rulle thymus mellem de to dias. Skyl glasobjektglassene for at samle cellerne og kassér det resterende thymiske stromale væv. Filtrer fem ml af den thymiske suspension gennem et 30- eller 40 mikrometer cellefilterfilter og centrifuger cellerne ved 300 G i 10 minutter.
Efter fjernelse af supernatanten lyseres de røde blodlegemer ved tilsætning af en milliliter ACK-lysisbuffer pr. rør i et minut. Tilsæt fem ml celleudtømningsbuffer for at deaktivere ACK-lysisbufferen, centrifuger suspensionen ved 300 G i 10 minutter og resuspender i en til fem ml celleudtømningsbuffer til tælling. Efter at have talt cellerne og centrifugeret ved 300 G i 10 minutter, resuspenderes cellerne på et tidspunkt 10 til den syvende i 80 mikroliter celleudtømningsbuffer.
Tilsæt 10 mikroliter hver af CD4 og CD8 mikroperler pr. En gange 10 til de syvende celler. Bland godt og inkuber i 15 minutter i mørke i køleskabet. Forbered derefter en udtømningskolonne ved at skylle den med to ml udtømningsbuffer og kassere gennemstrømningen.
Vask de inkuberede celler ved at tilsætte en til to ml udtømningsbuffer pr. En gange 10 de syv celler. Der centrifugeres ved 300 G i 10 minutter, og supernatanten kasseres. Anvend derefter den suspenderede cellesuspension på kolonnen, og saml gennemstrømningen af celler uden etiketter.
Vask søjlen to gange med en milliliter buffer og opsaml gennemstrømningen. Plet udtømningseffektivitetskontrollerne ved at opdele de 200 mikroliter celler, der er opsamlet før udtømning, i fire FACS-rør, ubejdset, CD4 enkeltfarvet, CD8 enkeltfarvet og CD4 og CD8 dobbeltfarvet. Brug de ubejdsede og enkeltfarvede prøver til at indstille flowcytometriparametrene.
Brug de 1.000 mikroliter celler, der er opsamlet efter udtømning for at plette for CD4 og CD8 og sammenligne med den dobbeltfarvede prøve indsamlet før udtømning. For at dyrke thymocytterne placeres to til fem gange 10 til den femte til en gange 10 til den sjette thymocytter efter udtømning i en T25-kolbe med 80 til 90% sammenflydende OP9 DL4-celler i OP9-medium indeholdende cytokiner. Inkuber kulturen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 24 timer på OP9 DL4-celler.
For at høste retrovirussen opsamles supernatanten indeholdende retrovirus fra de transekterede celler ved at vippe pladen med seks huller og derefter placere en sprøjte på tre til fem ml i bunden af pladen, mens stemplet trækkes i for at aspirere supernatanten. Retrovirussupernatanten filtreres gennem et 0,45 mikrometer sprøjtefilter, og filtratet opsamles i et 50 ml glas. Udskift mediet med to ml frisk RPC-medium og fortsæt med at inkubere cellerne ved 37 grader Celsius i 20 til 24 timer til den anden transduktion.
opsaml thymocytterne fra OP9 DL4-kulturen ved aggressiv pipettering for at fjerne thymocytterne og OP9 DL4-cellerne fra kolbeoverfladen. Filtrer cellesuspensionen gennem en 40 mikrometer cellesil for at fjerne de fleste OP9 DL4-celler og opsaml filtratet i et 50 ml rør. Thymocytterne og filtratet centrifugeres ved 300 G i fem minutter, og supernatanten kasseres.
Resuspender thymocytterne i 0,5 til en milliliter OP9-medium med cytokiner. Tilsæt en til to ml RPC-medium indeholdende virussen. Derefter tilsættes hexametrinbromid ved otte mikrogram pr. milliliter total cellesuspension.
Spinoculere indholdet ved centrifugering af cellerne ved 850 G i en time ved stuetemperatur. Resuspender cellerne i seks ml OP9-medium med cytokiner pr. kolbe, og tilsæt suspensionen tilbage på OP9 DL4-cellemonolaget. Inkuber ved 37 grader Celsius natten over.
Retrovirushøsten gentages ved hjælp af et nyt hul med den retrovirusholdige cellesupernatant. Oprethold de transducerede thymocytter på OP9 DL4-kultur i to til fem dage eller frys efter behov. Udtømningseffektiviteten blev vurderet flowcytometrisk ved at mærke den magnetisk umærkede cellefraktion for CD4 og CD8 efter immunomagnetisk celleseparation og analysere dette på et todimensionelt bivariant prikplot.
Et godt udbytte af dobbeltnegative celler til CD4 og CD8 er 95% eller derover, som repræsenteret her. Ved anvendelse af vektorer, der udtrykker screenbare markører, såsom et fluorescensgen, kan transsektion og transduktion groft og empirisk vurderes ved fluorescensmikroskopi. Transduktionseffektiviteten blev analyseret ved at høste thymocytterne fra OP9 DL4 monolaget.
og ser på ekspressionen af et fluorescensgen ved flowcytometri. Effektiviteten af transduktion ved hjælp af en tom retroviral vektor med GFP som reportergen var 84,2% T-celledifferentiering på OP9 DL4-celler blev observeret fire dage efter transduktion. Flowcytometrianalyse af celledifferentiering induceret af co-kulturen på OP9 DL4-celler og transgenekspressionen, hvor cellerne blev mærket for CD4, CD8, CD44 og CD 25.
Transduktionen af dobbeltnegative thymocytter med den tomme retrovirale vektor pMIG præsenterede omtrent de samme proportioner af enkeltpositive, dobbelte positive, dobbelte negativer og dens understadier dobbelt negative en til fire som de utransducerede thymocytter, hvilket indikerer, at T-celleudvikling ikke blev påvirket af transduktionsprocessen. Den sværeste opgave, når du forsøger at replikere denne protokol, er at sikre, at de forskellige celletyper styres samtidigt på en koordineret måde. Overekspression af onkogener i umodne thymocytter lejlighedsvis kan påvirke normal T-celleudvikling, så den efterfølgende immunofænotypning ved flowcytometri er en nyttig måde at lære, hvilken retning man skal tage.
Det onkogene potentiale af transducerede T-celler differentieret på fosterlagsceller kan undersøges yderligere ved injektion i immunkompromitterede mus.