Co-cultuur en transductie van murine thymocyten op delta-achtige 4-tot expressie brengende stromale cellen om oncogenen in T-cel leukemie te bestuderen

Het transduceren van onrijpe thymocyten met retrovirale vectoren en het kweken van deze cellen op OP9 DL4 stromale cellen is een uitdagende techniek. Dit gedetailleerde protocol bespaart onderzoekers tijd en moeite bij het optimaliseren van deze systemen. Deze techniek biedt een flexibel in vitro systeem voor het bestuderen van de effecten van genetische modificaties op onrijpe T-cellen en kan nuttig zijn voor het bestuderen van T-celontwikkeling en kanker.

Gisele Rodrigues, een postdoc uit mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Om te beginnen, zaai de retrovirusproducerende cellen 18 tot 24 uur vóór transfectie bij 70 tot 90% confluentie in elke put van een weefselkweekplaat met zes putten die twee milliliter retrovirusproducentcel of RPC-medium bevat. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Om de cellen te transfecteren, vervangt u het medium een uur voor transfectie door vers RPC-medium. Bereid lipofectiemengsels door vier microgram DNA met twee microgram helperplasmide pCL-Eco en twee microgram transferplasmide pMIG in 250 microliter gereduceerd serummedium te verdunnen en voorzichtig te mengen. Meng vervolgens 10 microliter transfectiereagens en 250 microliter gereduceerd serummedium en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Combineer na vijf minuten incubatie het verdunde DNA met het verdunde transfectiereagens. Meng voorzichtig en incubeer gedurende 20 tot 25 minuten bij kamertemperatuur. Voeg de 500 microliter van het DNA- en transfectiereagensmengsel voorzichtig toe aan de put met de retrovirusproducerende cellen door ze met een cirkelvormige beweging op de cellen te laten vallen.

Meng voorzichtig door de plaat heen en weer te wiegen en incubeer de plaat vervolgens gedurende 16 tot 24 uur in een incubator van 37 graden Celsius. Vervang ongeveer 16 uur na transfectie het oude medium door twee milliliter vers RPC-medium en blijf de cellen gedurende 20 tot 24 uur incuberen bij 37 graden Celsius. Om de thymocyte eencellige suspensie te bereiden, plaatst u een geoogste thymus van geëuthanaseerde muizen in vijf milliliter PBS in een petrischaal.

Plaats met behulp van steriele glasglaasjes de thymus tussen de matte oppervlakken van de dia's en wreef de dia's voorzichtig tegen elkaar, waarbij de thymus tussen de twee dia's rolde. Spoel de glasglaasjes af om de cellen te verzamelen en gooi het resterende thymische stromale weefsel weg. Filtreer vijf milliliter van de thymususpensie door een 30- of 40-micrometer celzeeffilter en centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten op 300 G.

Na het verwijderen van het supernatant, lyseer de rode bloedcellen door gedurende één minuut één milliliter van een ACK-lysisbuffer per buis toe te voegen. Voeg vijf milliliter celdepletiebuffer toe om de ACK-lysisbuffer te deactiveren, centrifugeer de suspensie gedurende 10 minuten op 300 G en resuspensie in één tot vijf milliliter celdepletiebuffer voor telling. Na het tellen van de cellen en centrifugeren bij 300 G gedurende 10 minuten, resuspensie de cellen op één keer 10 tot de zevende in 80 microliter celdepletiebuffer.

Voeg 10 microliter elk van CD4 en CD8 microbeads per keer 10 toe aan de zevende cel. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten in het donker in de koelkast. Bereid vervolgens een uitputtingskolom voor door deze af te spoelen met twee milliliter uitputtingsbuffer en de doorstroming weg te gooien.

Was de geïncubeerde cellen door één tot twee milliliter depletiebuffer toe te voegen per één maal 10 van de zeven cellen. Centrifugeer gedurende 10 minuten op 300 G en gooi het supernatant weg. Breng vervolgens de geresuspendeerde celsuspensie aan op de kolom en verzamel de doorstroom van niet-gelabelde cellen.

Was de kolom twee keer met een milliliter buffer en vang de doorstroom op. Bevlek de uitputtingsefficiëntiecontroles door de 200 microliter cellen die vóór de uitputting zijn verzameld, te splitsen in vier FACS-buizen, ongekleurd, CD4 enkelgekleurd, CD8 enkelgekleurd en CD4 en CD8 dubbel gekleurd. Gebruik de niet-gekleurde en enkelgekleurde monsters om de flowcytometrieparameters in te stellen.

Gebruik de 1.000 microliter cellen verzameld na uitputting om te kleuren voor CD4 en CD8 en vergelijk met het dubbel gekleurde monster verzameld vóór uitputting. Om de thymocyten te kweken, plaatst u twee tot vijf keer 10 tot de vijfde tot één keer 10 tot de zesde thymocyten na depletie in een T25-kolf van 80 tot 90% confluente OP9 DL4-cellen in OP9-medium met cytokines. Incubeer de cultuur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur op OP9 DL4-cellen.

Om het retrovirus te oogsten, verzamelt u het supernatant met de retrovirussen uit de doorgesneden cellen door de plaat met zes putten te kantelen en vervolgens een spuit van drie tot vijf milliliter aan de onderkant van de plaat te plaatsen terwijl u aan de zuiger trekt om het supernatant op te zuigen. Filter het retrovirussupernatant door een spuitfilter van 0,45 micrometer en verzamel het filtraat in een buis van 50 milliliter. Vervang het medium door twee milliliter vers RPC-medium en blijf de cellen gedurende 20 tot 24 uur incuberen bij 37 graden Celsius voor de tweede transductie.

verzamel de thymocyten uit de OP9 DL4-cultuur door agressief pipetteren om de thymocyten en OP9 DL4-cellen van het kolfoppervlak te verwijderen. Filter de celsuspensie door een celzeef van 40 micrometer om de meeste OP9 DL4-cellen te verwijderen en het filtraat in een buis van 50 milliliter te verzamelen. Centrifugeer de thymocyten en het filtraat gedurende vijf minuten bij 300 G en gooi het supernatant weg.

Resuspendie van de thymocyten in 0,5 tot één milliliter OP9-medium met cytokines. Voeg één tot twee milliliter RPC-medium toe dat het virus bevat. Voeg vervolgens hexamethrinebromide toe met acht microgram per milliliter totale celsuspensie.

Spinoculeer de inhoud door de cellen gedurende één uur bij kamertemperatuur op 850 G te centrifugeren. Resuspendeer de cellen in zes milliliter OP9-medium met cytokines per kolf en voeg de suspensie weer toe aan de OP9 DL4-celmonolaag. Incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius.

Herhaal de stappen van retrovirusoogst met behulp van een nieuwe put van het retrovirusbevattende celsupernatant. Houd de getransduceerde thymocyten op OP9 DL4-cultuur gedurende twee tot vijf dagen of vries indien nodig in. De depletie-efficiëntie werd cytometrisch beoordeeld door de magnetisch-ongelabelde celfractie voor CD4 en CD8 na immunomagnetische celscheiding te labelen en deze te analyseren op een tweedimensionale bivariante dot plot.

Een goede opbrengst van dubbel-negatieve cellen voor CD4 en CD8 is 95% of hoger, zoals hier weergegeven. Bij het gebruik van vectoren die screenbare markers zoals een fluorescentiegen tot expressie brengen, kunnen de transsectie en transductie ruw en empirisch worden beoordeeld door fluorescentiemicroscopie. De transductie-efficiëntie werd geanalyseerd door de thymocyten uit de OP9 DL4-monolaag te oogsten.

en kijken naar de expressie van een fluorescentiegen door flowcytometrie. De efficiëntie van transductie met behulp van een lege retrovirale vector met GFP als het reportergen was 84,2% T-celdifferentiatie op OP9 DL4-cellen werd vier dagen na transductie waargenomen. Flowcytometrie-analyse van celdifferentiatie geïnduceerd door de co-cultuur op OP9 DL4-cellen en de transgenexpressie, waarbij de cellen werden gelabeld voor CD4, CD8, CD44 en CD 25.

De transductie van dubbelnegatieve thymocyten met de lege retrovirale vector pMIG vertoonde ongeveer dezelfde verhoudingen van enkele positieven, dubbele positieven, dubbele negatieven en de substadia dubbel negatief één tot vier als de niet-getransduceerde thymocyten, wat aangeeft dat de ontwikkeling van T-cellen niet werd beïnvloed door het transductieproces. De moeilijkste taak bij het repliceren van dit protocol is ervoor te zorgen dat de verschillende celtypen tegelijkertijd op een gecoördineerde manier worden beheerd. Overexpressie van oncogenen in onrijpe thymocyten kan af en toe de normale ontwikkeling van T-cellen beïnvloeden, dus de daaropvolgende immunofenotypering door flowcytometrie is een nuttige manier om te leren welke richting te nemen.

Het oncogene potentieel van getransduceerde T-cellen gedifferentieerd op foetale laagcellen kan verder worden onderzocht door injectie in immuungecompromitteerde muizen.