未熟な胸腺細胞をレトロウイルスベクターで形質導入し、これらの細胞をOP9 DL4間質細胞上で培養することは、困難な技術です。この詳細なプロトコルは、これらのシステムを最適化しながら、研究者の時間と労力を節約します。この技術は、未熟T細胞に対する遺伝子組み換えの影響を研究するための柔軟なin vitroシステムを提供し、T細胞の発生と癌の研究に役立ちます。
手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるジゼル・ロドリゲスです。まず、トランスフェクションの18〜24時間前に、2ミリリットルのレトロウイルス産生細胞またはRPC培地を含む6ウェル組織培養プレートの各ウェルに70〜90%コンフルエントでレトロウイルス産生細胞を播種します。プレートを摂氏37度と5%二酸化炭素でインキュベートします。
細胞をトランスフェクションするには、トランスフェクションの1時間前に培地を新しいRPC培地と交換します。2マイクログラムのヘルパープラスミドpCL-Ecoと2マイクログラムのトランスファープラスミドpMIGを含む4マイクログラムのDNAを250マイクロリットルの還元血清培地で希釈してリポフェクション混合物を調製し、穏やかに混合します。次に、10マイクロリットルのトランスフェクション試薬と250マイクロリットルの還元血清培地を混合し、室温で5分間インキュベートします。
5分間のインキュベーション後、希釈したDNAを希釈したトランスフェクション試薬と組み合わせます。穏やかに混合し、室温で20〜25分間インキュベートします。500マイクロリットルのDNAとトランスフェクション試薬の混合物を、レトロウイルス産生細胞を含むウェルに円を描くように滴下し、穏やかに加えます。
プレートを前後に揺らして穏やかに混合し、摂氏37度のインキュベーターでプレートを16〜24時間インキュベートします。トランスフェクションの約16時間後に、古い培地を2ミリリットルの新しいRPC培地と交換し、細胞を摂氏37度で20〜24時間インキュベートし続けます。胸腺細胞単一細胞懸濁液を調製するために、安楽死させたマウスから採取した胸腺をペトリ皿内の5ミリリットルのPBSに入れる。
滅菌ガラススライドを使用して、スライドのつや消し表面の間に胸腺を置き、スライドを静かにこすり合わせて、2つのスライドの間で胸腺を転がします。スライドガラスをすすぎ、細胞を収集し、残りの胸腺間質組織を廃棄します。5ミリリットルの胸腺懸濁液を30マイクロメートルまたは40マイクロメートルのセルストレーナーフィルターでろ過し、細胞を300 Gで10分間遠心分離します。
上清を除去した後、チューブあたり1ミリリットルのACK溶解バッファーを1分間添加して赤血球を溶解します。5ミリリットルの細胞枯渇バッファーを加えてACK溶解バッファーを不活性化し、懸濁液を300 Gで10分間遠心分離し、1〜5ミリリットルの細胞枯渇バッファーに再懸濁してカウントします。細胞をカウントし、300Gで10分間遠心分離した後、細胞を80マイクロリットルの細胞枯渇緩衝液に1回10〜7回で再懸濁する。
CD4およびCD8マイクロビーズを1回あたり10マイクロリットルずつ10個目の細胞に1回加える。よく混ぜて冷蔵庫の暗所で15分間インキュベートします。次に、2ミリリットルの空乏バッファーですすぎ、フロースルーを廃棄して空乏カラムを準備します。
インキュベートした細胞を洗浄し、7個の細胞を1回10回あたり1〜2ミリリットルの枯渇緩衝液を添加する。300gで10分間遠心分離し、上清を廃棄する。次に、再懸濁した細胞懸濁液をカラムに適用し、非標識細胞のフロースルーを回収します。
カラムを1ミリリットルのバッファーで2回洗浄し、フロースルーを収集します。枯渇前に採取した200マイクロリットルの細胞を、無染色、CD4単一染色、CD8単一染色、CD4およびCD8二重染色の4つのFACSチューブに分割して、枯渇効率コントロールを染色します。非染色および単一染色サンプルを使用して、フローサイトメトリーパラメータを設定します。
枯渇後に収集された1, 000マイクロリットルの細胞を使用して、CD4およびCD8を染色し、枯渇前に収集された二重染色サンプルと比較します。胸腺細胞を培養するには、サイトカインを含むOP9培地中の80〜90%コンフルエントなOP9 DL4細胞のT25フラスコに、10〜5〜5〜10〜6倍の10〜6倍の胸腺細胞を入れます。培養液を摂氏37度、二酸化炭素5%でOP9 DL4細胞上で24時間インキュベートします。
レトロウイルスを採取するには、6ウェルプレートを傾け、プランジャーを引っ張って上清を吸引しながらプレートの底に3〜5ミリリットルのシリンジを配置して、トランスセクト細胞からレトロウイルスを含む上清を収集します。レトロウイルス上清を0.45マイクロメートルのシリンジフィルターでろ過し、ろ液を50ミリリットルのチューブに集めます。培地を2ミリリットルの新しいRPC培地と交換し、2回目の形質導入のために細胞を摂氏37度で20〜24時間インキュベートし続けます。
積極的なピペッティングによってOP9 DL4培養物から胸腺細胞を収集し、フラスコ表面から胸腺細胞およびOP9 DL4細胞を除去した。細胞懸濁液を40マイクロメートルのセルストレーナーでろ過して、ほとんどのOP9 DL4細胞を除去し、ろ液を50ミリリットルのチューブに集めます。胸腺細胞と濾液を300 Gで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
胸腺細胞をサイトカインを含む0.5〜1ミリリットルのOP9培地に再懸濁する。ウイルスを含む1〜2ミリリットルのRPCメディアを追加します。次に、臭化ヘキサメトリンを全細胞懸濁液1ミリリットルあたり8マイクログラムで添加する。
細胞を850Gで室温で1時間遠心分離することにより、内容物をスピンパッチします。フラスコあたりサイトカインを含む6ミリリットルのOP9培地に細胞を再懸濁し、懸濁液をOP9 DL4細胞単層に戻します。摂氏37度で一晩インキュベートします。
レトロウイルス含有細胞上清の新しいウェルを用いてレトロウイルス採取のステップを繰り返す。形質導入した胸腺細胞をOP9 DL4培養で2〜5日間維持するか、必要に応じて凍結します。免疫磁気細胞分離後のCD4およびCD8の磁気非標識細胞画分を標識し、これを2次元バイバリアントドットプロットで分析することにより、枯渇効率をフローサイトメトリーで評価しました。
CD4およびCD8のダブルネガティブ細胞の良好な収率は、ここに表されているように、95%以上である。蛍光遺伝子などのスクリーニング可能なマーカーを発現するベクターを用いる場合、蛍光顕微鏡法により、切断および形質導入を大まかかつ経験的に評価することができる。形質導入効率は、OP9 DL4単層から胸腺細胞を採取することによって分析した。
フローサイトメトリーによる蛍光遺伝子の発現を見る。GFPをレポーター遺伝子とする空のレトロウイルスベクターを用いた形質導入の効率は、形質導入の4日後にOP9 DL4細胞上で84.2%T細胞分化が観察された。OP9 DL4細胞上での共培養によって誘導される細胞分化および導入遺伝子発現のフローサイトメトリー解析(細胞をCD4、CD8、CD44、およびCD25で標識)。
空のレトロウイルスベクターpMIGによる二重陰性胸腺細胞の形質導入は、形質導入されていない胸腺細胞とほぼ同じ割合のシングルポジティブ、ダブルポジティブ、ダブルネガティブ、およびそのサブステージダブルネガティブ1〜4を示し、T細胞の発達が形質導入プロセスの影響を受けなかったことを示しています。このプロトコルを複製しようとする際の最も困難な作業は、異なる細胞タイプが調整された方法で同時に管理されていることを確認することです。未熟な胸腺細胞で癌遺伝子を過剰発現させると、正常なT細胞の発達に影響を与えることがあるため、フローサイトメトリーによるその後のイムノフェノタイピングは、どちらの方向に進むべきかを学ぶのに役立つ方法です。
胎児層細胞上で分化した形質導入T細胞の発癌性の可能性は、免疫不全マウスへの注射によってさらに調べることができます。
