미성숙 흉선세포를 레트로바이러스 벡터로 형질도입하고 이러한 세포를 OP9 DL4 기질 세포에서 배양하는 것은 어려운 기술입니다. 이 상세한 프로토콜은 이러한 시스템을 최적화하는 동시에 연구원의 시간과 노력을 절약합니다. 이 기술은 미성숙 T 세포에 대한 유전자 변형의 영향을 연구하기 위한 유연한 시험관 내 시스템을 제공하며 T 세포 발달 및 암 연구에 유용할 수 있습니다.
이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 박사후 연구원 인 Gisele Rodrigues가 될 것입니다. 시작하기 위해, 형질감염 18 내지 24시간 전에 2밀리리터의 레트로바이러스 생산자 세포 또는 RPC 배지를 함유하는 6-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 70 내지 90% 밀도로 레트로바이러스 생산자 세포를 시딩한다. 플레이트를 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 배양합니다.
세포를 형질감염시키려면 형질감염 1시간 전에 배지를 새로운 RPC 배지로 교체하십시오. 250 마이크로리터의 환원된 혈청 배지에 2 마이크로그램의 헬퍼 플라스미드 pCL-Eco와 2 마이크로그램의 전달 플라스미드 pMIG를 함유하는 4 마이크로그램의 DNA를 희석하여 지방 감염 혼합물을 준비하고 부드럽게 혼합합니다. 다음으로, 10 마이크로리터의 형질주입 시약 및 250 마이크로리터의 환원된 혈청 배지를 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다.
5분 배양 후, 희석된 DNA를 희석된 형질주입 시약과 조합한다. 부드럽게 혼합하고 실온에서 20-25 분 동안 배양하십시오. 500 마이크로리터의 DNA 및 형질주입 시약 혼합물을 레트로바이러스 생산자 세포를 함유하는 웰에 부드럽게 첨가하여 이들을 원형 운동으로 세포 상에 떨어뜨렸다.
플레이트를 앞뒤로 흔들어 부드럽게 섞은 다음 섭씨 37도 인큐베이터에서 16-24시간 동안 플레이트를 배양합니다. 형질감염 후 약 16시간 후, 기존 배지를 2밀리리터의 새로운 RPC 배지로 교체하고 섭씨 37도에서 20 내지 24시간 동안 세포를 계속 배양한다. 흉선 세포 단세포 현탁액을 준비하기 위해, 안락사 된 마우스에서 수확 한 흉선을 5 밀리리터의 PBS에 페트리 접시에 넣는다.
멸균 유리 슬라이드를 사용하여 흉선을 슬라이드의 젖빛 표면 사이에 놓고 슬라이드를 부드럽게 문질러 두 슬라이드 사이에서 흉선을 굴립니다. 유리 슬라이드를 헹구어 세포를 모으고 남은 흉선 기질 조직을 버립니다. 흉선 현탁액 5 밀리리터를 30 또는 40 마이크로 미터 세포 여과기 필터를 통해 여과하고 세포를 300G에서 10 분 동안 원심 분리합니다.
상층액을 제거한 후, 1분 동안 튜브 당 1밀리리터의 ACK 용해 완충액을 첨가하여 적혈구를 용해시킨다. 5밀리리터의 세포 고갈 완충액을 첨가하여 ACK 용해 완충액을 비활성화하고, 현탁액을 300G에서 10분 동안 원심분리하고, 계수를 위해 1 내지 5밀리리터의 세포 고갈 완충액에 재현탁시킨다. 세포를 계수하고, 300 G에서 10분 동안 원심분리한 후, 세포를 80 마이크로리터의 세포 고갈 완충액에 1회 1회 내지 7회에 재현탁시킨다.
CD4 및 CD8 마이크로비드를 각각 10 마이크로리터씩 10 곱하기 제7 세포에 첨가한다. 잘 섞고 냉장고의 어둠 속에서 15 분 동안 배양하십시오. 다음으로, 2밀리리터의 공핍 완충액으로 공핍 컬럼을 헹구고 플로우 스루를 폐기하여 공핍 컬럼을 준비합니다.
인큐베이션된 세포를 7개의 세포에 1회 10배로 1 내지 2 밀리리터의 공핍 완충액을 첨가하여 세척한다. 300G에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 그런 다음 재현탁된 세포 현탁액을 컬럼에 적용하고 표지되지 않은 세포의 흐름을 수집합니다.
1 밀리리터의 완충액으로 컬럼을 두 번 세척하고 플로우 스루를 수집하십시오. 고갈 전에 수집된 200마이크로리터의 세포를 염색되지 않은 CD4 단일 염색, CD8 단일 염색, CD4 및 CD8 이중 염색된 4개의 FACS 튜브로 분할하여 고갈 효율 제어를 염색합니다. 염색되지 않은 시료와 단일 염색된 시료를 사용하여 유세포 분석 파라미터를 설정합니다.
고갈 후 수집 된 1, 000 마이크로 리터의 세포를 사용하여 CD4 및 CD8을 염색하고 고갈 전에 수집 된 이중 염색 샘플과 비교하십시오. 흉선세포를 배양하기 위해, 고갈 후 흉선세포를 2 내지 5배 내지 5배 내지 5배 내지 1회 내지 6차 사이토카인을 함유하는 OP9 배지에 80 내지 90% 융합성 OP9 DL4 세포의 T25 플라스크에 넣는다. OP9 DL4 세포 상에서 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 배양물을 배양한다.
레트로바이러스를 채취하려면 6웰 플레이트를 기울인 다음 플런저를 당겨 상청액을 흡인하면서 플레이트 바닥에 3-5밀리리터 주사기를 위치시켜 트랜스펙트된 세포에서 레트로바이러스를 포함하는 상청액을 수집합니다. 0.45마이크로미터 주사기 필터를 통해 레트로바이러스 상청액을 여과하고 여과액을 50밀리리터 튜브에 수집합니다. 배지를 2밀리리터의 새로운 RPC 배지로 교체하고 두 번째 형질도입을 위해 섭씨 37도에서 20 내지 24시간 동안 세포를 계속 배양한다.
공격적인 피펫팅에 의해 OP9 DL4 배양물로부터 흉선세포를 수집하여 플라스크 표면으로부터 흉선세포 및 OP9 DL4 세포를 제거한다. 40마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과하여 대부분의 OP9 DL4 세포를 제거하고 50밀리리터 튜브에 여과액을 수집합니다. 흉선 세포와 여과액을 300G에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
사이토카인으로 0.5 내지 1밀리리터의 OP9 배지에 흉선 세포를 재현탁시킨다. 바이러스가 포함된 RPC 배지를 1-2밀리리터 추가합니다. 그런 다음 헥사메트린 브로마이드를 총 세포 현탁액의 밀리리터당 8마이크로그램으로 추가합니다.
세포를 실온에서 1시간 동안 850G에서 원심분리하여 내용물을 Spinoculate합니다. 플라스크 당 사이토카인으로 6 밀리리터의 OP9 배지에서 세포를 재현탁하고 현탁액을 OP9 DL4 세포 단층 상에 다시 첨가한다. 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다.
레트로바이러스 함유 세포 상청액의 새로운 웰을 사용하여 레트로바이러스 수확 단계를 반복한다. 형질도입된 흉선세포를 OP9 DL4 배양물에 2 내지 5일 동안 유지하거나 필요에 따라 동결시킨다. 고갈 효율은 면역자기 세포 분리 후 CD4 및 CD8에 대한 자기적으로 표지되지 않은 세포 분획을 표지하고 이를 2차원 이변량 도트 플롯에서 분석하여 유세포 분석법으로 평가되었습니다.
CD4 및 CD8에 대한 이중 음성 세포의 양호한 수율은 여기에 표시된 바와 같이 95% 이상입니다. 형광 유전자와 같은 스크리닝 가능한 마커를 발현하는 벡터를 사용하는 경우, 횡단면 및 형질도입은 형광 현미경으로 대략적이고 경험적으로 평가할 수 있습니다. 형질도입 효율은 OP9 DL4 단층으로부터 흉선세포를 수확하여 분석하였다.
형광 유전자의 발현을 유세포 분석에 의해 관찰한다. GFP를 리포터 유전자로 하는 빈 레트로바이러스 벡터를 사용한 형질도입 효율은 형질도입 4일 후 OP9 DL4 세포에서 84.2%T-세포 분화가 관찰되었습니다. OP9 DL4 세포에 대한 공동 배양에 의해 유도된 세포 분화의 유세포 분석 및 이식유전자 발현, 여기서 세포를 CD4, CD8, CD44, 및 CD25에 대해 표지하였다.
빈 레트로바이러스 벡터 pMIG를 사용한 이중 음성 흉선 세포의 형질도입은 형질도입되지 않은 흉선 세포와 거의 동일한 비율의 단일 양성, 이중 양성, 이중 음성 및 그 하위 단계 이중 음성 1 내지 4를 나타내었으며, 이는 T 세포 발달이 형질도입 과정에 의해 영향을 받지 않았음을 나타냅니다. 이 프로토콜을 복제하려고 할 때 가장 어려운 작업은 서로 다른 셀 유형이 조정된 방식으로 동시에 관리되는지 확인하는 것입니다. 미성숙 흉선 세포에서 종양 유전자를 과발현하는 것은 때때로 정상적인 T 세포 발달에 영향을 미칠 수 있으므로 유세포 분석에 의한 후속 면역 표현형은 어떤 방향으로 가야 하는지 배우는 데 도움이 되는 방법입니다.
태아층 세포에서 분화된 형질도입된 T 세포의 발암성 가능성은 면역 저하 마우스에 주사하여 추가로 조사할 수 있습니다.
