रेट्रोवायरल वैक्टर के साथ अपरिपक्व थाइमोसाइट्स को ट्रांसड्यूस करना और ओपी 9 डीएल 4 स्ट्रोमल कोशिकाओं पर इन कोशिकाओं का संवर्धन करना एक चुनौतीपूर्ण तकनीक है। यह विस्तृत प्रोटोकॉल इन प्रणालियों को अनुकूलित करते हुए शोधकर्ताओं के समय और प्रयास को बचाएगा। यह तकनीक अपरिपक्व टी-कोशिकाओं पर आनुवंशिक संशोधनों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक लचीली इन विट्रो प्रणाली प्रदान करती है और यह टी-सेल विकास और कैंसर का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकती है।
प्रक्रिया का प्रदर्शन मेरी प्रयोगशाला से एक पोस्ट-डॉक्टरेट फेलो गिसेल रोड्रिग्स करेंगे। शुरू करने के लिए, रेट्रोवायरस निर्माता कोशिकाओं को छह-अच्छी तरह से ऊतक संवर्धन प्लेट के प्रत्येक कुएं में 70 से 90% कंफ्लुएंसी पर अभिकर्मक से 18 से 24 घंटे पहले बीज दें, जिसमें दो मिलीलीटर रेट्रोवायरस निर्माता सेल, या आरपीसी माध्यम होता है। प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेट करें।
कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए, अभिकर्मक से एक घंटे पहले माध्यम को ताजा आरपीसी माध्यम से बदलें। कम सीरम माध्यम के 250 माइक्रोलीटर में दो माइक्रोग्राम हेल्पर प्लास्मिड पीसीएल-इको और ट्रांसफर प्लास्मिड पीएमआईजी के दो माइक्रोग्राम वाले डीएनए के चार माइक्रोग्राम को पतला करके लिपोफेक्शन मिश्रण तैयार करें और धीरे-धीरे मिलाएं। इसके बाद, अभिकर्मक अभिकर्मक के 10 माइक्रोलीटर और कम सीरम माध्यम के 250 माइक्रोलीटर मिलाएं और कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
इनक्यूबेशन के पांच मिनट के बाद, पतला अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ पतला डीएनए मिलाएं। धीरे से मिलाएं और कमरे के तापमान पर 20 से 25 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। डीएनए और अभिकर्मक अभिकर्मक मिश्रण के 500 माइक्रोलीटर को धीरे से रेट्रोवायरस उत्पादक कोशिकाओं वाले कुएं में जोड़ें, उन्हें एक गोलाकार आंदोलन के साथ कोशिकाओं पर गिराकर।
प्लेट को आगे और पीछे हिलाते हुए धीरे-धीरे मिलाएं और फिर प्लेट को 16 से 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। अभिकर्मक के लगभग 16 घंटे बाद, पुराने माध्यम को दो मिलीलीटर ताजा आरपीसी माध्यम से बदलें और 20 से 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करना जारी रखें। थाइमोसाइट एकल-कोशिका निलंबन तैयार करने के लिए, पेट्री डिश में पांच मिलीलीटर पीबीएस में इच्छामृत्यु वाले चूहों से कटा हुआ थाइमस रखें।
बाँझ ग्लास स्लाइड्स का उपयोग करके, थाइमस को स्लाइड्स की ठंढी सतहों के बीच रखें और धीरे से स्लाइड्स को एक साथ रगड़ें, थाइमस को दो स्लाइडों के बीच घुमाएं। कोशिकाओं को इकट्ठा करने और अवशेष थाइमिक स्ट्रोमल ऊतक को छोड़ने के लिए ग्लास स्लाइड को कुल्ला करें। 30-या 40-माइक्रोमीटर सेल स्ट्रेनर फिल्टर के माध्यम से थाइमिक निलंबन के पांच मिलीलीटर को फ़िल्टर करें और 10 मिनट के लिए 300 जी पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
सतह पर तैरने वाले को हटाने के बाद, एक मिनट के लिए प्रति ट्यूब एक मिलीलीटर एसीके लाइसिस बफर जोड़कर लाल रक्त कोशिकाओं को लाइस करें। एसीके लाइसिस बफर को निष्क्रिय करने के लिए सेल की कमी बफर के पांच मिलीलीटर जोड़ें, 10 मिनट के लिए 300 जी पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें, और गिनती के लिए एक से पांच मिलीलीटर सेल रिक्तीकरण बफर में पुन: निलंबित करें। कोशिकाओं की गिनती करने और 10 मिनट के लिए 300 जी पर सेंट्रीफ्यूजिंग करने के बाद, कोशिकाओं को सेल की कमी बफर के 80 माइक्रोलीटर में 10 से सातवें तक एक बार फिर से निलंबित किया जाता है।
सातवीं कोशिकाओं में प्रति एक बार 10 बार सीडी 4 और सीडी 8 माइक्रोबीड्स के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें। अच्छी तरह मिलाएं और रेफ्रिजरेटर में अंधेरे में 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इसके बाद, दो मिलीलीटर रिक्तीकरण बफर के साथ कुल्ला करके और प्रवाह-माध्यम को त्यागकर एक रिक्तीकरण स्तंभ तैयार करें।
सात कोशिकाओं में से एक गुना 10 बार एक से दो मिलीलीटर रिक्तीकरण बफर जोड़कर इनक्यूबेटेड कोशिकाओं को धोएं। सेंट्रीफ्यूज 10 मिनट के लिए 300 जी पर और सुपरनैटेंट को छोड़ दें। फिर, स्तंभ पर पुन: निलंबित सेल निलंबन लागू करें और बिना लेबल वाली कोशिकाओं के प्रवाह-माध्यम को एकत्र करें।
एक मिलीलीटर बफर के साथ कॉलम को दो बार धोएं और प्रवाह-माध्यम से इकट्ठा करें। कमी से पहले एकत्र की गई कोशिकाओं के 200 माइक्रोलीटर को चार एफएसीएस ट्यूबों में विभाजित करके कमी दक्षता नियंत्रण को दाग दें, बिना दाग वाले, सीडी 4 एकल-दाग वाले, सीडी 8 एकल-दाग वाले, और सीडी 4 और सीडी 8 डबल-दाग वाले। प्रवाह साइटोमेट्री पैरामीटर सेट करने के लिए बिना दाग वाले और एकल-दाग वाले नमूने का उपयोग करें।
सीडी 4 और सीडी 8 के लिए दाग लगाने के लिए कमी के बाद एकत्र की गई कोशिकाओं के 1,000 माइक्रोलीटर का उपयोग करें और कमी से पहले एकत्र किए गए डबल-दाग वाले नमूने के साथ तुलना करें। थाइमोसाइट्स को कल्चर करने के लिए, साइटोकिन्स युक्त ओपी 9 माध्यम में 80 से 90% कंफ्लुएंट ओपी 9 डीएल 4 कोशिकाओं के टी 25 फ्लास्क में दो से पांच बार 10 से पांच से एक बार 10 से एक बार 10 से 10 वें स्थान पर रखें। ओपी 9 डीएल 4 कोशिकाओं पर 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
रेट्रोवायरस की कटाई के लिए, छह-वेल प्लेट को झुकाकर सही कोशिकाओं से रेट्रोवायरस युक्त सुपरनैटेंट इकट्ठा करें और फिर प्लेट के तल पर तीन से पांच मिलीलीटर सिरिंज को रखें, जबकि प्लंजर को सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करने के लिए खींचें। रेट्रोवायरस सुपरनैटेंट को 0.45-माइक्रोमीटर सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें और 50-मिलीलीटर ट्यूब में फिल्ट्रेट एकत्र करें। माध्यम को दो मिलीलीटर ताजा आरपीसी माध्यम के साथ बदलें और दूसरे पारगमन के लिए 20 से 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करना जारी रखें।
फ्लास्क सतह से थाइमोसाइट्स और ओपी 9 डीएल 4 कोशिकाओं को हटाने के लिए आक्रामक पाइपिंग द्वारा ओपी 9 डीएल 4 संस्कृति से थाइमोसाइट्स एकत्र करें। अधिकांश ओपी 9 डीएल 4 कोशिकाओं को हटाने के लिए 40-माइक्रोमीटर सेल स्ट्रेनर के माध्यम से सेल निलंबन को फ़िल्टर करें और 50-मिलीलीटर ट्यूब में फिल्ट्रेट एकत्र करें। थाइमोसाइट्स और छानने वाले को पांच मिनट के लिए 300 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
साइटोकिन्स के साथ ओपी 9 माध्यम के 0.5 से एक मिलीलीटर में थाइमोसाइट्स को पुन: निलंबित करें। वायरस युक्त आरपीसी माध्यम के एक से दो मिलीलीटर जोड़ें। फिर, कुल सेल निलंबन के आठ माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर पर हेक्सामेथ्रिन ब्रोमाइड जोड़ें।
कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए 850 ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करके सामग्री को स्पिनोकुलेट करें। प्रति फ्लास्क साइटोकिन्स के साथ ओपी 9 माध्यम के छह मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और ओपी 9 डीएल 4 सेल मोनोलेयर पर निलंबन वापस जोड़ें। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
रेट्रोवायरस युक्त सेल सुपरनैटेंट के एक नए कुएं का उपयोग करके रेट्रोवायरस कटाई के चरणों को दोहराएं। ओपी 9 डीएल 4 संस्कृति पर ट्रांसड्यूस्ड थाइमोसाइट्स को दो से पांच दिनों तक बनाए रखें या आवश्यकतानुसार फ्रीज करें। इम्यूनोमैग्नेटिक सेल पृथक्करण के बाद सीडी 4 और सीडी 8 के लिए चुंबकीय रूप से बिना लेबल वाले सेल अंश को लेबल करके और दो-आयामी द्विभिन्नरूपी डॉट प्लॉट पर इसका विश्लेषण करके कमी दक्षता का मूल्यांकन साइटोमेट्रिक रूप से किया गया था।
सीडी 4 और सीडी 8 के लिए डबल-नकारात्मक कोशिकाओं की एक अच्छी उपज 95% या उससे अधिक है, जैसा कि यहां दर्शाया गया है। प्रतिदीप्ति जीन जैसे स्क्रीन करने योग्य मार्करों को व्यक्त करने वाले वैक्टर का उपयोग करते समय, ट्रांससेक्शन और ट्रांसडक्शन को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा मोटे तौर पर और अनुभवजन्य रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है। ओपी 9 डीएल 4 मोनोलेयर से थाइमोसाइट्स की कटाई करके पारगमन दक्षता का विश्लेषण किया गया था।
और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा प्रतिदीप्ति जीन की अभिव्यक्ति को देखना। रिपोर्टर जीन के रूप में जीएफपी के साथ एक खाली रेट्रोवायरल वेक्टर का उपयोग करके पारगमन की दक्षता ट्रांसडक्शन के चार दिन बाद ओपी 9 डीएल 4 कोशिकाओं पर 84.2% टी-सेल भेदभाव देखी गई थी। ओपी 9 डीएल 4 कोशिकाओं और ट्रांसजीन अभिव्यक्ति पर सह-संस्कृति द्वारा प्रेरित सेल भेदभाव का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण, जहां कोशिकाओं को सीडी 4, सीडी 8, सीडी 44 और सीडी 25 के लिए लेबल किया गया था।
खाली रेट्रोवायरल वेक्टर पीएमआईजी के साथ डबल-नकारात्मक थाइमोसाइट्स के पारगमन ने एकल सकारात्मक, डबल पॉजिटिव, डबल नकारात्मक के लगभग समान अनुपात प्रस्तुत किए, और इसके उप-चरण ों को अपरिवर्तित थाइमोसाइट्स के रूप में डबल नकारात्मक एक से चार तक प्रस्तुत किया, यह दर्शाता है कि टी-सेल विकास पारगमन प्रक्रिया से प्रभावित नहीं था। इस प्रोटोकॉल को दोहराने का प्रयास करते समय सबसे कठिन कार्य यह सुनिश्चित करना है कि विभिन्न सेल प्रकारों को एक साथ समन्वित तरीके से प्रबंधित किया जाता है। अपरिपक्व थाइमोसाइट्स में ऑन्कोजीन को अतिरंजित करना कभी-कभी सामान्य टी-सेल विकास को प्रभावित कर सकता है, इसलिए फ्लो साइटोमेट्री द्वारा बाद में इम्यूनोफेनोटाइपिंग यह जानने का एक उपयोगी तरीका है कि किस दिशा में जाना है।
भ्रूण परत कोशिकाओं पर विभेदित ट्रांसड्यूस्ड टी-कोशिकाओं की ऑन्कोजेनिक क्षमता को प्रतिरक्षा-समझौता चूहों में इंजेक्शन द्वारा आगे की जांच की जा सकती है।