يسمح هذا النهج بالتحقيق في الهوية الخلوية والتكامل والوظائف للخلايا العصبية الداخلية المزروعة على مدى فترة زمنية طويلة في تطوير أدمغة صحية ومريضة. يصف البروتوكول جيلا سريعا وعالي الكفاءة من الخلايا العصبية البينية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية مثل السلائف التي تعيش وتنضج في الحصين للفئران الساذجة والمعدلة وراثيا. يساعدنا هذا النهج في تقييم الإمكانات العلاجية لاستخدام العلاج بالخلايا في اضطرابات النمو حيث تتعرض الخلايا العصبية البينية للخطر.
للبدء ، قم بإزالة وسط زراعة الخلايا من السلائف العصبية المشتقة من الإنسان واشطفها بعناية باستخدام DPBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم. أضف 400 ميكرولتر من محلول انفصال الخلية إلى كل بئر من لوحة الآبار الستة. احتضن لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق عند 37 درجة مئوية في الحاضنة حتى تبدأ حدود الخلايا في الظهور لامعة.
بعد ذلك ، أضف 600 ميكرولتر من وسط N2 الطازج إلى كل بئر من لوحة الآبار الستة لإيقاف محلول انفصال الخلية وفصل الخلايا ميكانيكيا باستخدام ماصة للحصول على تعليق أحادي الخلية. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب بلاستيكي وأجهزة طرد مركزي عند 180 جم لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية باستخدام نظام تفريغ وأعد تعليق الحبيبات في وسط الزرع.
عد إجمالي الخلايا في التعليق باستخدام غرفة العد وعداد العد ، واضبط الحجم على تركيز نهائي قدره 100،000 خلية لكل ميكرولتر. احتفظ بتعليق الخلية في أنبوب مغلق على الثلج حتى الزرع لمدة أقصاها أربع ساعات. مباشرة بعد التخدير ، ضع الجرو على منديل مبلل على سطح الثلج الرطب لمدة ثلاث دقائق حتى تصبح الأطراف العلوية بيضاء.
أعد تعليق الخلايا بعناية باستخدام الماصة وقم بتحميل المحقنة بتعليق الخلية. ضع الجرو بوضعه على الإطار المجسم واستخدام قضبان الأذن في الاتجاه المعاكس. بعد ذلك ، قم بتنظيف سطح الجلد باستخدام نسيج رخو منقوع في الإيثانول.
حدد لامدا واضبط الإحداثيات على الصفر على وحدة التحكم في العرض الرقمي للأداة المجسمة. بعد نقل حقنة هاملتون إلى الإحداثيات المطلوبة ، استخدم إبرة الأنسولين المنحنية بزاوية 90 درجة لاختراق الجمجمة ، مما يؤدي إلى حدوث ثقب صغير. بعد ذلك ، أحضر حقنة هاملتون لأسفل حتى تعبر الإبرة الجمجمة وصفر الإحداثي الظهري البطني.
اخفض الإبرة حتى يتم تحقيق الإحداثيات الظهرية البطنية المطلوبة. اسحب الإبرة ببطء بمجرد حقن الخلايا الجذعية. قم بإنهاء الإجراء عن طريق تسخين الجرو باليدين حتى يبدأ في التحرك قبل إعادته إلى الأم.
لم يتم العثور على أي رد فعل مناعي أو التهاب موضعي ضد الخلايا المزروعة سواء في يوم ما بعد الولادة بعد 14 أو شهرين بعد الزرع ، كما تم تقييمه من خلال عدم وجود الخلايا الدبقية الصغيرة التفاعلية التي تم تحديدها باستخدام Iba1 و CD68 و galectin-3. يتم تحديد مدى التسمم النجمي من خلال البروتين الحمضي الليفي الدبقي والسيتوكينات الالتهابية ، مثل الإنترلوكين -1 ، وغياب الخلايا الليمفاوية السامة للخلايا. في الفئران الضربة القاضية Cntnap2 ، نجت الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية لمدة تصل إلى تسعة أشهر بعد الزرع وتم توطينها في موقع الحقن.
على الرغم من أنها كانت منتشرة أيضا عبر الحصين المماثل وحتى الحصين المقابل ، كما لوحظ في الفئران البرية. يتطلب البروتوكول ممارسة لضمان الحد الأدنى من تعطيل وضغط الدماغ ، وكذلك الحفاظ على توازن جيد بين سرعة الإجراء ودقة الإحداثيات. يتوافق هذا البروتوكول مع مجموعة من التقنيات ، مثل دراسات الاتصال أو القراءات الوظيفية مثل الفيزيولوجيا الكهربية أو الدراسات السلوكية ، اعتمادا على بحثك ، مسألة الاهتمام.
