Dieser Ansatz ermöglicht es, die zelluläre Identität, Integration und Funktionalität transplantierter Interneuronen über einen längeren Zeitraum bei der Entwicklung gesunder und kranker Gehirne zu untersuchen. Das Protokoll beschreibt eine schnelle und hocheffiziente Erzeugung von GABAergen Interneuronen wie Vorläufern aus menschlichen Stammzellen, die überleben und in den Hippocampus naiver und transgener Mäuse reifen. Dieser Ansatz hilft uns, das therapeutische Potenzial der Zelltherapie bei Entwicklungsstörungen zu bewerten, bei denen Interneurone beeinträchtigt sind.
Entfernen Sie zunächst das Zellkulturmedium von den humanen Interneuron-Vorläufern und spülen Sie vorsichtig mit DPBS ohne Kalzium und Magnesium. Fügen Sie 400 Mikroliter der Zellablösungslösung in jede Vertiefung der Sechs-Well-Platte hinzu. Inkubieren Sie zwei bis drei Minuten bei 37 Grad Celsius im Inkubator, bis der Rand der Zellen glänzend aussieht.
Dann fügen Sie 600 Mikroliter frisches N2-Medium zu jeder Vertiefung der Sechs-Well-Platte hinzu, um die Zellablösungslösung zu stoppen, und lösen Sie die Zellen mechanisch mit einer Pipette, um eine einzellige Suspension zu erhalten. Die Zellsuspension in ein Kunststoffröhrchen geben und bei 180 G vier Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand mit einem Vakuumsystem und resuspendieren Sie das Pellet im Transplantationsmedium.
Zählen Sie die gesamten Zellen in der Suspension mit einer Zählkammer und einem Zählzähler und stellen Sie das Volumen auf eine Endkonzentration von 100.000 Zellen pro Mikroliter ein. Bewahren Sie die Zellsuspension bis zur Transplantation maximal vier Stunden in einem geschlossenen Röhrchen auf Eis auf. Unmittelbar nach der Narkose legen Sie den Welpen drei Minuten lang auf ein feuchtes Gewebe auf der Oberfläche von nassem Eis, bis die oberen Gliedmaßen weißlich werden.
Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig mit der Pipette und laden Sie die Spritze mit der Zellsuspension. Positionieren Sie den Welpen, indem Sie ihn auf den stereotaktischen Rahmen legen und die Ohrbügel in die entgegengesetzte Richtung verwenden. Als nächstes reinigen Sie die Hautoberfläche mit einem mit Ethanol getränkten Weichgewebe.
Identifizieren Sie Lambda und setzen Sie die Koordinaten auf der digitalen Anzeigekonsole des stereotaktischen Instruments auf Null. Nachdem Sie die Hamilton-Spritze zu den gewünschten Koordinaten gebracht haben, verwenden Sie eine um 90 Grad gebogene Insulinnadel, um in den Schädel einzudringen und ein winziges Loch zu erzeugen. Bringen Sie dann die Hamilton-Spritze herunter, bis die Nadel den Schädel kreuzt, und stellen Sie die dorsoventrale Koordinate auf Null.
Senken Sie die Nadel, bis die gewünschten dorsoventralen Koordinaten erreicht sind. Ziehen Sie die Nadel langsam zurück, sobald die Stammzellen injiziert wurden. Beenden Sie den Vorgang, indem Sie den Welpen mit den Händen aufwärmen, bis er sich zu bewegen beginnt, bevor er ihn der Mutter zurückgibt.
Weder am postnatalen Tag 14 noch zwei Monate nach der Transplantation wurde eine Immunreaktion oder lokale Entzündung gegen die transplantierten Zellen festgestellt, was durch das Fehlen reaktiver Mikroglia beurteilt wurde, die mit Iba1, CD68 und Galectin-3 identifiziert wurden. Das Ausmaß der Astrogliose wird durch das saure Gliafibrillenprotein und entzündliche Zytokine wie Interleukin-1 und das Fehlen zytotoxischer Lymphozyten bestimmt. In den Cntnap2-Knockout-Mäusen überlebten die von menschlichen Stammzellen abgeleiteten interneuronenähnlichen Zellen bis zu neun Monate nach der Transplantation und wurden an der Injektionsstelle lokalisiert.
Sie waren jedoch auch über den ipsilateralen und sogar den kontralateralen Hippocampus verteilt, wie bei den Wildtyp-Mäusen beobachtet. Das Protokoll erfordert Übung, um die minimale Störung und Kompression des Gehirns zu gewährleisten und ein gutes Gleichgewicht zwischen der Geschwindigkeit des Verfahrens und der Präzision der Koordinaten zu halten. Dieses Protokoll ist kompatibel mit einer Reihe von Techniken, wie z. B. Konnektivitätsstudien oder funktionellen Auslesungen wie Elektrophysiologie oder Verhaltensstudien, abhängig von Ihrer Forschung, Frage von Interesse.
