Name: live imaging of early cardiac progenitors in the mouse embryo
Uploaded: 2022-07-12T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Early Cardiac Progenitors in the Mouse Embryo at JoVE.com

يعترف المؤلفون بالدكتور كينزو إيفانوفيتش لعمله السابق على هذه الطريقة ومجموعة الدكتور شيجينوري نوناكا (المعاهد الوطنية للعلوم الطبيعية ، اليابان) لتوفير الخبرة الأولية في تركيب الأجنة. تم دعم هذه الدراسة من قبل Grant PGC2018-096486-B-I00 من وزارة العلوم والابتكار الإسبانية و Grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427 من برنامج EU Horizon 2020 إلى MT و Grant 1380918 من برنامج التشغيل FEDER Andalucía 2014-2020 إلى JND. تم دعم MS من خلال زمالة الدكتوراه في مؤسسة La Caixa (LCF / BQ / DE18 / 11670014) وزمالة سفر شركة علماء الأحياء (DEVTF181145). يتم دعم CNIC من قبل وزارة العلوم الإسبانية ومؤسسة ProCNIC.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على الحيوانات CNIC ، من قبل مجتمع مدريد (المرجع PROEX 220/15) وتتوافق مع توجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63EU والتوصية 2007/526 / EC بشأن حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض تجريبية وعلمية أخرى ، تم فرضها في القانون الإسباني بموجب Real Decreto 1201/20...

<ol>
	<li>Tyser, R. C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+handling+precedes+cardiac+differentiation+to+initiate+the+first+heartbeat.">Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat.</a> eLife. 5, 17113 (2016).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).</li><li>Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+lineage+development.">Myocardial lineage development.</a> Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).</li><li>Tam, P. P., Parameswaran, M., Kinder, S. J., Weinberger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allocation+of+epiblast+cells+to+the+embryonic+heart+and+other+mesodermal+lineages:+the+role+of+ingression+and+tissue+movement+during+gastrulation.">The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation.</a> Development. 124 (9), 1631-1642 (1997).</li><li>Kinder, S. J., Loebel, D. A. F., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allocation+and+early+differentiation+of+cardiovascular+progenitors+in+the+mouse+embryo.">Allocation and early differentiation of cardiovascular progenitors in the mouse embryo.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 11 (5), 177-184 (2001).</li><li>Lawson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+the+mouse+embryo.">Fate mapping the mouse embryo.</a> International Journal of Developmental Biology. 43 (7), 773-775 (1999).</li><li>Ivanovitch, K., Temi&#241;o, S., Torres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+heart+tube+development+in+mouse+reveals+alternating+phases+of+cardiac+differentiation+and+morphogenesis.">Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis.</a> eLife. 6, 30668 (2017).</li><li>Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deployment+of+cell+lineages+that+form+the+mammalian+heart.">The deployment of cell lineages that form the mammalian heart.</a> Nature Reviews Cardiology. 15 (11), 705-724 (2018).</li><li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells.">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).</li><li>Meilhac, S. M., Lescroart, F., Blanpain, C. D., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+cell+lineages+that+form+the+heart.">Cardiac cell lineages that form the heart.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (9), 013888 (2014).</li><li>Sendra, M., Dom&#237;nguez, J. N., Torres, M., Oca&#241;a, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+complexity+of+early+heart+progenitor+cells.">Dissecting the complexity of early heart progenitor cells.</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (1), 5 (2022).</li><li>McDole, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+and+reconstruction+of+post-implantation+mouse+development+at+the+single-cell+level.">In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level.</a> Cell. 175 (3), 859-876 (2018).</li><li>Saykali, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mesoderm+migration+phenotypes+in+extra-embryonic+and+embryonic+regions+of+the+early+mouse+embryo.">Distinct mesoderm migration phenotypes in extra-embryonic and embryonic regions of the early mouse embryo.</a> eLife. 8, 42434 (2019).</li><li>Ichikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+whole+mouse+embryos+during+gastrulation:+Migration+analyses+of+epiblast+and+mesodermal+cells.">Live imaging of whole mouse embryos during gastrulation: Migration analyses of epiblast and mesodermal cells.</a> PLoS ONE. 8 (7), 64506 (2013).</li><li>Tyser, R. C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+characterization+of+a+gastrulating+human+embryo.">Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo.</a> Nature. 600 (7888), 285-289 (2021).</li><li>Aguilera-Castrejon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+mouse+embryogenesis+from+pre-gastrulation+to+late+organogenesis.">Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis.</a> Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).</li><li>Yue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+toto+live+imaging+of+cardiomyocyte+behaviour+during+mouse+ventricle+chamber+formation+at+single-cell+resolution.">in toto live imaging of cardiomyocyte behaviour during mouse ventricle chamber formation at single-cell resolution.</a> Nature Cell Biology. 22 (3), 332-340 (2020).</li><li>Nowotschin, S., Xenopoulos, P., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+single-cell+resolution+live+imaging+reporter+of+Notch+signaling+in+the+mouse.">A bright single-cell resolution live imaging reporter of Notch signaling in the mouse.</a> BMC Developmental Biology. 13 (1), 15 (2013).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharpened+tungsten+needles.">Sharpened tungsten needles.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2012).</li><li>Tam, P. P., Snow, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+culture+of+primitive-streak-stage+mouse+embryos.">The in vitro culture of primitive-streak-stage mouse embryos.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 59, 131-143 (1980).</li><li>Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rat+serum+for+culturing+mouse+embryos.">Preparation of rat serum for culturing mouse embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5593 (2011).</li><li>Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postimplantation+mouse+development:+Whole+embryo+culture+and+micro-+manipulation.">Postimplantation mouse development: Whole embryo culture and micro- manipulation.</a> International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).</li><li>Optimizaci&#243;n de propiedades fisicoqu&#237;micas y medios de cultivo para el cultivo del embri&#243;n de rat&#243;n ex vivo. Universidad de Ja&#233;n. Biolog&#237;a Experimental Available from: <a target="_blank" href="https://hdl.handle.net/10953.1/1400">https://hdl.handle.net/10953.1/1400</a> (2021)</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual, Fourth Edition. , 814 (2014).</li><li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (2), e160 (2006).</li><li>Nonaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+mouse+nodal+flow+by+applying+artificial+flow.">Modification of mouse nodal flow by applying artificial flow.</a> Methods in Cell Biology. 91, 287-297 (2009).</li><li>Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+postimplantation+mouse+embryos.">Time-lapse imaging of postimplantation mouse embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5595 (2011).</li><li>Crainiciuc, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+immune+landscapes+of+inflammation.">Behavioural immune landscapes of inflammation.</a> Nature. 601 (7893), 415-421 (2022).</li></ol>

ينتظم أسلاف القلب الأوائل في أنبوب قلب بدائي يبدأ في النبض بينما لا يزال يتشكل. يعد فهم كيفية حدوث هذه العملية أمرا أساسيا لتحديد مجموعة واسعة من عيوب القلب الخلقية لأحداث مورفوجينية محددة. لذلك ، يوفر التصوير الحي فرصة لدراسة التطور الجنيني الطبيعي والمعيب مع زيادة الدقة الزمنية. هذا مفي...

يتشكل القلب مبكرا أثناء التطور الجنيني لبدء ضخ العناصر الغذائية إلى الجنين بأكمله ، بينما يستمر في النمو1. في أجنة الفئران ، بعد يوم ونصف من بدء المعدة ، يتجمع عضو القلب البدائي في القطب الأمامي 2,3. بحلول مرحلة الخط المبكر (ES) ، يدخل السلف القلبي في epiblast عبر الخط البدائي إلى طبقة الأديم المتوسط الوليدة4،5،6 ويبدأ في الهجرة إلى القطب الأمامي ، حيث يتمايز لتشكيل أنبوب القلب البدائي. خلال هذه العملية ، يخضع أسلاف القلب الأوائل لإعادة ترتيب الخلايا ، وتحولات الشكل ، والتمايز ، بالإضافة إلى الهجرة7 (الشكل 1).
اجتذب أسلاف القلب الأوائل الباحثين لما يقرب من قرن من الزمان بسبب قدرتهم الرائعة على التمييز وبناء عضو وظيفي في وقت واحد. على مدى العقدين الماضيين ، أظهر التحليل النسيلي ونماذج الضربة القاضية الشرطية أن نمو القلب المبكر ينطوي على مصادر خلايا متميزة في عملية ديناميكية للغاية8،9،10. ومع ذلك ، فإن البنية ثلاثية الأبعاد لأنبوب القلب البدائي والطبيعة الديناميكية لتشكله تجعل من الصعب دراسته (الشكل 1) ، ونحن بعيدون عن فهم تعقيده الكامل11.
لدراسة هذه العمليات الخلوية الديناميكية ، تقدم طرق التصوير الحية الآن تفاصيل غير مسبوقة7،12،13،14. في نموذج الماوس ، كانت الأساليب الحية أساسية لاستجواب الموضوعات التنموية التي يصعب معالجتها من خلال التحليل الثابت7،13،15. في حين أن زراعة الجسم الحي على المدى الطويل وإعدادات المجهر القوية تتقدم بسرعة16,17 ، فإن القليل من الباحثين لديهم الخبرة اللازمة لتصوير الأجنة الحية بنجاح. على الرغم من أن المنشورات الورقية توفر تفاصيل فنية كافية لإعادة إنتاج تجارب التصوير الحية ، إلا أنه من الصعب فهم بعض المهارات والحيل بدون أمثلة مرئية أو مساعدة من نظير إلى نظير. لتسريع عملية التعلم هذه ونشر استخدام التصوير الحي بين المختبرات ، قمنا بتجميع بروتوكول فيديو (الشكل 2) يجمع المهارات اللازمة لإجراء التصوير الحي على أجنة الفئران المعدة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64273/64273fig01.jpg"> الشكل 1: التمايز المبكر للخلايا السلفية القلبية في جنين الفأر من بداية عملية شد المعدة إلى المرحلة التي تسبق تكوين أنبوب القلب البدائي. تدخل الخلايا السلفية القلبية الأديم المتوسط بعد وقت قصير من بدء المعدة ، وتهاجر إلى الجانب الآخر من الجنين. تتم كتابة مرحلة اليوم المورفولوجي والجنيني (E) أعلى المخططات. تصور الأسهم المتقطعة مسار هجرة أسلاف أنبوب القلب البدائي أثناء المعدة. تم تكييف هذا الرقم من11. الاختصارات: ES = الخط المبكر ؛ MS = الخط الأوسط ؛ EHF = طية الرأس المبكرة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64273/64273fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64273/64273fig02.jpg"> الشكل 2: مخطط سير العمل للتصوير الحي لأسلاف القلب المبكرة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64273/64273fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#55 Forceps</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter</td>
			<td>Mattek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm vise table&#160;</td>
			<td>Grandado</td>
			<td>SKU 8798771617573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11966025</td>
			<td>&#160;with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10438-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+)&#160;</td>
			<td>JAX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorobrite DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701&#160;</td>
			<td>DMEM for live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for wires</td>
			<td>Perlen Pressen</td>
			<td>pwb1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 Upright microscope</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Descanned Detectors equipped with the filter sets 
			cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710)</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 and P200 pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Oil</td>
			<td>Nidacon</td>
			<td>VNI0049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>(the final concentration should be 50 &#956;g/mL penicillin and 50 &#956;g/mL streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 35 mm x 10 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymethyl methacrylate&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reused from old laboratory equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD</td>
			<td>Janvier Labs</td>
			<td>9979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set of 160 mm fines</td>
			<td>RS PRO</td>
			<td>541-6933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 1.0 mm glass capillaries</td>
			<td>Anima Lab</td>
			<td>&#160;1B100F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 0.22 &#956;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15809152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten needles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogeniser (sonicator)</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td>BASO_17021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of early cardiac progenitors in the mouse embryo

تتضمن الخطوات الأولى لنمو القلب تغييرات جذرية في سلوك الخلية والتمايز. بينما يسمح تحليل الأجنة الثابتة بدراسة مراحل نمو محددة بالتفصيل في لقطة ثابتة ، فإن التصوير الحي يلتقط الأحداث المورفولوجية الديناميكية ، مثل هجرة الخلايا وتغيرات الشكل والتمايز ، عن طريق تصوير الجنين أثناء تطوره. هذا يكمل التحليل الثابت ويوسع فهم كيفية تطور الأعضاء أثناء التطور الجنيني. على الرغم من مزاياه ، نادرا ما يستخدم التصوير المباشر في نماذج الماوس بسبب تحدياته التقنية. تكون أجنة الفئران المبكرة حساسة عند استزراعها خارج الجسم الحي وتتطلب معالجة فعالة. لتسهيل الاستخدام الأوسع للتصوير الحي في أبحاث نمو الفئران ، تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا للفحص المجهري الحي ثنائي الفوتون الذي يسمح باكتساب أجنة الفئران على المدى الطويل. بالإضافة إلى البروتوكول ، يتم تقديم نصائح حول التعامل مع الأجنة وتحسين الثقافة. سيساعد هذا في فهم الأحداث الرئيسية في تكوين أعضاء الفئران المبكرة ، مما يعزز فهم بيولوجيا السلف القلبي الوعائي.

استخدمنا البروتوكول لتصور تنشيط إشارات NOTCH في أسلاف القلب المبكرة على وشك التمايز إلى الخلايا البطانية أثناء تشكل أنبوب القلب البدائي. لذلك ، عبرنا الفئران من النوع البري C57BL / 6-N مع الفئران Tg (CBF: H2BVenus ، +)18 للحصول على أجنة تبلغ عن نشاط NOTCH من خلال بروتين الفلورسنت الأصفر فينوس. ف?...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Early Cardiac Progenitors in the Mouse Embryo at JoVE.com

Live Imaging of Early Cardiac Progenitors in the Mouse Embryo

نقدم بروتوكولا مفصلا لزراعة أجنة الفئران والتصوير الذي يتيح تصوير وقت 3D + للخلايا السلفية القلبية. تتناول مجموعة أدوات الفيديو هذه المهارات الأساسية المطلوبة للتصوير المباشر الناجح الذي يصعب اكتسابه من المنشورات النصية فقط.

التصوير الحي لأسلاف القلب المبكرة في جنين الفأر

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail ...

يسمح هذا البروتوكول بتصوير أجنة الفئران أثناء تطورها. وهذا يتيح دراسة تكوين القلب المبكر بالتفصيل. مثل التقاط صور ثابتة للأجنة المزيفة ، يتيح التصوير الحي الوصول الكامل لدراسة العملية الديناميكية في تطور الجنين.من الصعب فهم المهارات المطلوبة لتصوير الحياة من النشر النصي فقط. مشاهدة شخص آخر يفعل ذلك أمر ضروري للتعلم. للبدء ، اقطع قطع سلك التنغستن بطول سنتيمتر واحد وشحذها إلى قطر 0.02 إلى 0.05 ملم عن طريق غمر طرف السلك في محلول نترات الصوديوم المشبع.لتحضير الشعيرات الدموية الزجاجية المرفقة، ضع نقطة منتصف الشعيرات الدموية الزجاجية القياسية التي يبلغ طولها ملليمترا واحدا فوق ولاعة بنسن لمدة ثلاث إلى ست ثوان، مع السحب ببطء من كلا الطرفين حتى تصبح الشعيرات الدموية رقيقة ومرنة. بعد ذلك ، اكسر الشعيرات الدموية إلى نصفين وقم بتسخينها لفترة وجيزة لإنتاج 90 درجة ثني سنتيمترين من الطرف. رأيت قطعة من بولي ميثيل ميثاكريلات يبلغ طولها حوالي سبعة ملليمترات وعرضها أربعة ملليمترات وسمكها ملليمترين.امسك قطعة الميثاكريلات باستخدام رذيلة مقاعد البدلاء ، ثم احفر ثقوبا مخصصة بشكل عرضي عبر القطعة بأكملها. قم بتدوير المثقاب ببطء أثناء الضغط المنخفض ولكن المستمر. استخدم ملفا جيدا لتنعيم حافة الحامل وضبط حجمه.بالإضافة إلى ذلك ، قم بإنشاء منحدر خفيف على حواف الحامل لتسهيل وضع الجنين. ضع الحامل النهائي في طبق به ماء مقطر لشطفه. تحت المجهر الاستريو ، تحقق من الحامل لمعرفة ما إذا كانت الثقوب تحتوي على غبار حفر.في حالة وجود غبار ، استخدم إبر التنغستن لإزالته. لتعقيم الحامل ، ضعه في أنبوب مخروطي مملوء بالماء المقطر وصوتنيكات لمدة 20 دقيقة مع خرج طاقة لا يقل عن 20 واط. استخراج الرحم من يوم الجنين الرحيم 6.75 إلى 7.5 الفأر الحامل ووضعه على ورقة جافة ونظيفة.ثم ، قم بقطع الرحم ، وإدخال طرف المقص الناعم من الجانب mesometrial ، وتحريك الشفرة على طول لفضح decidui ، ونقلها إلى وسط التشريح. تشريح الأجنة ، والحفاظ على مخروط المشيمة الخارجية سليمة. ثم ، انزع غشاء الرايختر ، واترك جزءا منه في المنطقة الجنينية الإضافية.للحفاظ على درجة حرارة التشريح المتوسطة ، استبدلها كل 10 دقائق. علاوة على ذلك ، قم بتشريح decidui في مجموعات من ثلاثة إلى أربعة مع الاحتفاظ بالباقي في وسط تشريح يوضع في حمام 37 درجة مئوية. ضع على الفور الأجنة تشريح في وسط الثقافة.حدد الأجنة ذات الميزات الفلورية المطلوبة باستخدام مجهر ستيريو مضان وضعها في الأنبوب الذي يحتوي على وسط المزرعة في حاضنة زراعة الخلايا للتعافي لمدة ساعتين قبل التصوير. بعد تشغيل جميع مكونات المجهر ، بما في ذلك الكمبيوتر والبرامج والليزر ، قم بتشغيل وحدة التحكم في ثاني أكسيد الكربون واضبطها على 7٪ ضع قطرة من شحم السيليكون عالي الفراغ على طبق 35 ملم مع غطاء زجاجي منزلق القاع. ضع الحامل أعلى القطرة واضغط برفق لتثبيته.لتركيب الجنين ، انقل جنينين إلى ثلاثة أجنة من الحاضنة إلى الطبق مع حامل. باستخدام زوج من الملقط وإبرة التنغستن مدببة ، ضع الأجنة في الثقوب. استخدم الإبرة لربط الجنين بواسطة مخروط المشيمة الخارجية وإدخاله في فتحة مطابقة للحجم.انقل بعناية الطبق الذي يحتوي على الأجنة والحامل إلى لوحة المجهر. خفض الهدف حتى يتم تشكيل الغضروف المفصلي السائل في واجهة الهدف المتوسطة. بعد وضع الجنين في بؤرة التركيز ، قم بتركيب غرفة الحضانة وختمها حول الهدف باستخدام شريط لاصق.باستخدام التقاط مباشر في برنامج التحكم المجهري ، اضبط إخراج الليزر ومستويات الكسب. ثم قم بتغطية الوسط بزيت البارافين عن طريق تقطيره ببطء على الهدف. إعداد تسجيل الفاصل الزمني.اضبط فاصلا زمنيا من خمس إلى 10 دقائق مع مسافة Z من ثلاثة إلى خمسة ميكرون بين الأكوام. اترك مساحة فارغة أعلى Z-Stack لتوقع نمو الجنين. ما لا يقل عن 50 ميكرون ، إضافة 30 ميكرون لكل ساعة لن يتم الإشراف على الاستحواذ.قم بتمكين خيار الحفظ التلقائي للسماح بالإشراف على الاستحواذ من جهاز كمبيوتر للسماح بتعديل حجم Z-Stack إذا لزم الأمر ، لتناسب مجال الاهتمام ضمن التركيز. يظهر نمو قلب الجنين الحي لكامل الجسم عن طريق التصوير متعدد الفوتونات. في اليوم الجنيني 7.5 ، يوجد مضان وريدي في جميع أنحاء الأديم الظاهر العصبي ، مع وجود عدد قليل من النوى الإيجابية في الأديم المتوسط الجنيني الإضافي.بعد أربع ساعات ، تنشط الأسلاف البطانية الوريدية وتتجمع لتشكيل أنبوب الشغاف والشريان الأورطي الأساسي ، والتي تصبح هياكل مغلقة بعد سبع ساعات. كن حذرا أثناء إزالة غشاء الرايختر. يمكن أن يكون عالقا حقا في الجنين ، خاصة في مراحل الخجل.أثناء الإزالة ، حاول قرصة الغشاء بواسطة المنطقة الجنينية الإضافية.

live-imaging-of-early-cardiac-progenitors-in-the-mouse-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

يعيش التصوير لل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; العذراء العين

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by pre-globular, globular, heart, torpedo and cotyledon stages. This progressive development is under the tight regulation of a complex molecular network. Harvesting sufficient early embryos at a similar stage of development is essential for investigating the cellular and molecular regulation of early embryogenesis. This is not straightforward since early embryogenesis undergoes rapid morphogenesis in a short while e.g. 8 days for Medicago truncatula to reach the early cotyledon stage. Here, we address the issue by two approaches. The first one establishes a linkage between embryo development and pod morphology in helping indicate the stage of the zygotic embryo. This is particularly based on the number of pod spirals and development of the spines. An alternative way to complement the in vivo studies is via culturing leaf explants to produce somatic embryos. The medium includes an unusual hormone combination - an auxin (1-naphthaleneacetic acid), a cytokinin (6-benzylaminopurine), abscisic acid and gibberellic acid. The different stages can be discerned growing out of the callus without dissection.

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

بروتوكولات الحصول اقحي والجسدية الأجنة لدراسة تنظيم تطور الجنين في وقت مبكر من البقول نموذج<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

توصيف التوتة تسوية الأسلاف في جنين الفأر عن طريق<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; فحوصات

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

مراقبة قسم الميتوزى وديناميكية في الأجنة الزرد لايف

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where they act as front line sentinels of infection and tissue damage. While other immune cells are continuously renewed from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) located in the bone marrow, a lineage of macrophages, known as resident macrophages, have been shown to be self-maintained in tissues without input from bone marrow HSPCs. This lineage is exemplified by microglia in the brain, Kupffer cells in the liver and Langerhans cells in the epidermis among others. The intestinal and colon lamina propria are the only adult tissues devoid of HSPC-independent resident macrophages. Recent investigations have identified that resident macrophages originate from the extra-embryonic yolk sac hematopoiesis from progenitor(s) distinct from fetal hematopoietic stem cells (HSC). Among yolk sac definitive hematopoiesis, erythromyeloid progenitors (EMP) give rise both to erythroid and myeloid cells, in particular resident macrophages. EMP are only generated within the yolk sac between E8.5 and E10.5 days of development and they migrate to the fetal liver as early as circulation is connected, where they expand and differentiate until at least E16.5. Their progeny includes erythrocytes, macrophages, neutrophils and mast cells but only EMP-derived macrophages persist until adulthood in tissues. The transient nature of EMP emergence and the temporal overlap with HSC generation renders the analysis of these progenitors difficult. We have established a tamoxifen-inducible fate mapping protocol based on expression of the macrophage cytokine receptor Csf1r promoter to characterize EMP and EMP-derived cells in vivo by flow cytometry.

While infiltrating macrophages are continuously recruited to adult tissues from circulating precursors, resident macrophages seed their tissue during development, where they are maintained without further input from progenitors. The progenitors for resident macrophages were recently identified. Here, we present methods for the genetic fate mapping of the resident macrophage progenitors.

تحديد أسلاف ريدثروميلويد وذريتهم في الجنين الماوس عن طريق التدفق الخلوي

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

في فيفو التصوير التعبير المعدلة وراثيا الجينات في الفرد الشبكية الأسلاف في الجنين اسماك الزرد همي لدراسة الخلية التأثيرات Nonautonomous

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

الهندسة الحيوية من أنسنة نخاع العظام ميكرونفيرونمنتس في الماوس والتصور من خلال التصوير لايف

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

في المختبر زراعة ovule للتصوير خلايا حية من الاستقطاب الزيجوت والزخرفة الجنين في التمويل نبات

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...