Name: analyzing starvation-induced autophagy in the drosophila melanogaster larval fat body
Uploaded: 2022-08-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body at JoVE.com

אנו אסירי תודה ל-THFC ול-BDSC על אספקת זני הזבובים. ד"ר טונג צ'או נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32030027, 91754103, 92157201) וקרנות מחקר בסיסיות עבור האוניברסיטאות המרכזיות. אנו מודים למתקן הליבה של המכון למדעי החיים (LSI) על מתן השירותים.

1. מעבר דרוזופילה והטלת ביצים
<ol><li>הכניסו 3 זכרים (גנוטיפ hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) ו-15 נקבות (גנוטיפ y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP ) זבובים בוגרים (ראו טבלת חומרים) לבקבוקון תרבית ( עם קמח תירס /מולסה/אגר סטנדרטי ב-25°C) להזדווגות. הערה: יש להגדיר בקבוקוני תרבית מרובים של...

<ol>
	<li>Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+Molecular+machinery+for+self-eating.">Autophagy: Molecular machinery for self-eating.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).</li><li>Jin, S., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+autophagy+in+cancer:+Management+of+metabolic+stress.">Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress.</a> Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).</li><li>Mizushima, N., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+human+diseases.">Autophagy in human diseases.</a> New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).</li><li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion.">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).</li><li>Yang, Z., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eaten+alive:+A+history+of+macroautophagy.">Eaten alive: A history of macroautophagy.</a> Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).</li><li>Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagosome:+Origins+unknown,+biogenesis+complex.">The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).</li><li>Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosomes,+phagosomes,+autolysosomes,+phagolysosomes,+autophagolysosomes...Wait,I'mconfused.">Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes...Wait,I'mconfused.</a> Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).</li><li>Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+autophagy+proteins-Diversification+in+eukaryotes+and+potential+ancestors+in+prokaryotes.">The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes.</a> Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).</li><li>Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+and+regulation+of+starvation-induced+autophagy+in+the+Drosophila+fat+body.">Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body.</a> Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+import+regulates+cytosolic+protein+homeostasis+and+neuronal+integrity.">Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity.</a> Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).</li><li>Ichimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ubiquitin-like+system+mediates+protein+lipidation.">A ubiquitin-like system mediates protein lipidation.</a> Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).</li><li>Rusten, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+autophagy+in+the+Drosophila+fat+body+is+induced+by+ecdysone+through+regulation+of+the+PI3K+pathway.">Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway.</a> Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).</li><li>Nishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Atg5/Atg7-independent+alternative+macroautophagy.">Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy.</a> Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).</li><li>Ravikumar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mammalian+autophagy+in+physiology+and+pathophysiology.">Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).</li><li>Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg8+controls+phagophore+expansion+during+autophagosome+formation.">Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).</li><li>Shintani, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+proteins+facilitate+the+formation+of+transport+vesicles+in+the+cytoplasm+to+vacuole+targeting+pathway.">Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).</li><li>Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+regulation+by+nutrient+signaling.">Autophagy regulation by nutrient signaling.</a> Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).</li><li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+and+why+to+study+autophagy+in+Drosophila:+It's+more+than+just+a+garbage+chute.">How and why to study autophagy in Drosophila: It's more than just a garbage chute.</a> Methods. 75, 151-161 (2015).</li><li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome.">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59 (3), 499-509 (1989).</li><li>Senecoff, J. F., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directionality+in+FLP+protein-promoted+site-specific+recombination+is+mediated+by+DNA-DNA+pairing.">Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).</li><li>Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+in+Drosophila.">Mosaic analysis in Drosophila.</a> Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).</li><li>Zappia, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F/Dp+inactivation+in+fat+body+cells+triggers+systemic+metabolic+changes.">E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes.</a> eLife. 10, 67753 (2021).</li><li>Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Drosophila. , (1965).</li><li>Rizki, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+fat+body+surfaces.">Drosophila larval fat body surfaces.</a> Wilhelm Roux's Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).</li><li>Szeto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALIS+are+stress-induced+protein+storage+compartments+for+substrates+of+the+proteasome+and+autophagy.">ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy.</a> Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).</li><li>Renna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+inducers+of+autophagy+that+enhance+the+clearance+of+mutant+proteins+in+neurodegenerative+diseases.">Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).</li><li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+RNA+interference+screen+identifies+genes+that+regulate+autophagy+at+different+stages.">A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages.</a> Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).</li><li>Tian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+for+analysis+of+autophagy+induction.">An antibody for analysis of autophagy induction.</a> Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).</li><li>Nezis, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+autophagy+in+Drosophila.">Selective autophagy in Drosophila.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 146767 (2012).</li><li>Chu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+materials+for+monitoring+mitochondrial+biology.">Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology.</a> Materials. 14 (15), 4180 (2021).</li></ol>

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השיטות (1) ליצור זבובים הנושאים שיבוטים מוטנטיים בגופי שומן הזחל, (2) לגרום לאוטופגיה באמצעות רעב חומצות אמינו, ו-(3) לנתח את גופי השומן של הזחל. על מנת לייצר שיבוטים בהצלחה בגופי שומן הזחל, יש לבצע את השלבים הקריטיים הבאים בחריצות. (1) תזמון מדויק של שוק החום הוא קריטי מ?...

אוטופגיה היא תהליך "אכילה עצמית" המושרה על ידי לחצים שונים, כולל רעב חומצות אמינו1. מקרואוטופגיה (להלן אוטופגיה) היא הסוג הנחקר ביותר של אוטופגיה וממלאת תפקיד שאין לו תחליף בשמירה על הומאוסטזיס תאי2. תקלה של אוטופגיה קשורה למספר מחלות אנושיות3. בנוסף, חלק מהגנים הקשורים לאוטופגיה הם מטרות פוטנציאליות לטיפול במחלות שונות4. 
אוטופגיה מוסדרת בצורה מתוחכמת ביותר5. בעת הרעב, קרומי הבידוד מבודדים חומרים ציטופלזמיים ליצירת אוטופגוזומים בעלי קרום כפול6. לאחר מכן אוטופגוזומים מתמזגים עם אנדוזומים וליזוזומים ליצירת אמפיזומים ואוטוליזוזומים. בעזרת אנזימים הידרוליטיים ליזוזומליים, התוכן הציטופלזמי שנבלע מתפרק, והחומרים המזינים ממוחזרים7. 
אוטופגיה היא תהליך שימור אבולוציוני8. Drosophila melanogaster הוא מודל נהדר לחקר תהליך autophagy in vivo. רעב חומצות אמינו גורם בקלות לאוטופגיה ברקמת גוף שומן הזבובים, אנלוגיה של כבד אנושי ורקמת שומן9. פגמים באוטופגיה משבשים את דפוסי הפונקטה המובהקים של מספר חלבונים הקשורים לאוטופגיה, כגון Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 ו-p62, בין היתר10. לכן, ניתוח הדפוסים של סמני אוטופגיה אלה יסייע להבחין בהתרחשות של פגמים אוטופגיים ואת שלב אוטופגיה פגום. לדוגמה, החלבון דמוי האוביקוויטין Atg8 הוא סמן האוטופגיההנפוץ ביותר 11. ב- Drosophila melanogaster, זנים טרנסגניים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המתויג Atg8a פותחו בהצלחה12. GFP-Atg8a מפוזר בציטוזול ובגרעינים בתאים המוזנים. לאחר הרעבה, GFP-Atg8a מעובד ושונה על ידי פוספטידיל-אתנולאמין (PE) ויוצר פונקטה, אשר מסמנת את קרומי הבידוד ואת האוטופגוזומים המפותחים במלואם13,14. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ישיר, ניתן לראות בקלות את השראת האוטופגיה כעלייה בהיווצרות GFP-Atg8 puncta15. Atg8a puncta לא ייווצר בתגובה לרעב בנוכחות פגם בהתחלת אוטופגיה. מכיוון ש-GFP-Atg8a יכול להיות מרווה-מעוכל על ידי ה-pH הנמוך באוטוליזוזומים, GFP-Atg8a puncta עשוי לעלות במספרים אם אוטופגיה נחסמת בשלבים מאוחרים16.
מכיוון שאוטופגיה רגישה מאוד לזמינות תזונתית17, הבדלים קלים בתנאי התרבית מובילים לעתים קרובות לשינויים בפנוטיפים. לכן, לאנליזה של שבטים, שיטה המנתחת תאים מוטנטיים לעומת תאי ביקורת מסוג בר באותה רקמה, יש יתרון גדול בניתוח פגמים אוטופגיים18. תוך ניצול של רקומבינציה ספציפית לאתר בתיווך FLPASE/FLPASE (FLP/FRT) בין כרומוזומים הומולוגיים, זבובים הנושאים רקמות פסיפס מיוצרים בקלות19,20. התאים מסוג פרא המקיפים את התאים המוטנטיים יוצרים בקרה פנימית מושלמת כדי למנוע הבדלים אינדיבידואליים21.
המחקר הנוכחי מתאר כיצד לגרום לאוטופגיה על ידי רעב חומצות אמינו וליצור רקמות גוף של שומן פסיפס המבטא GFP-Atg8a. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש לניתוח הבדלים באוטופגיה בין שיבוטים מוטנטיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 Dressions Spot plate</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100854-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610440-0500</td>
			<td>Composition of 1x PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600445-0500</td>
			<td>Composition of 1x PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory spatula</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long forceps</td>
			<td>R&#39; DEER</td>
			<td>RST-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>CITOTEST</td>
			<td>80340-1130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>CITOTEST</td>
			<td>80302-2104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>Composition of 1x PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610476-0005</td>
			<td>Composition of 1x PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard cornmeal/molasses/agar fly food</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tong Lab-made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.</td>
			<td>10021418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield antifade mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vectorlabratory</td>
			<td>H-1200-10</td>
			<td>Recommended mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y&#39;w* Iso FRT19A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tong Lab&#39;s fly stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y&#39;w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tong Lab&#39;s fly stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y&#39;w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tong Lab&#39;s fly stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tong Lab&#39;s fly stocks</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing starvation-induced autophagy in the drosophila melanogaster larval fat body

אוטופגיה היא תהליך של עיכול עצמי תאי. הוא מעביר מטען לליזוזומים לפירוק בתגובה ללחצים שונים, כולל רעב. תקלה של אוטופגיה קשורה להזדקנות ומחלות אנושיות מרובות. מנגנון האוטופגיה שמור מאוד - משמרים ועד בני אדם. גוף שומן הזחל של Drosophila melanogaster, אנלוגי לכבד חולייתנים ולרקמת שומן, מספק מודל ייחודי לניטור אוטופגיה in vivo. אוטופגיה יכולה להיגרם בקלות על ידי רעב תזונתי בגוף שומן הזחל. רוב הגנים הקשורים לאוטופגיה נשמרים בדרוזופילה. פותחו זנים רבים של זבובים טרנסגניים המבטאים סמני אוטופגיה מתויגים, המאפשרים ניטור של שלבים שונים בתהליך האוטופגיה. ניתוח השבטים מאפשר השוואה קרובה של סמני אוטופגיה בתאים בעלי גנוטיפים שונים באותה פיסת רקמה. הפרוטוקול הנוכחי מפרט נהלים עבור (1) יצירת שיבוטים סומטיים בגוף שומן הזחל, (2) גרימת אוטופגיה באמצעות רעב חומצות אמינו, ו-(3) ניתוח גוף שומן הזחל, במטרה ליצור מודל לניתוח הבדלים באוטופגיה באמצעות סמן אוטופגוזום (GFP-Atg8a) וניתוח שבטים.

בתנאים מוזנים, החלבון דמוי האוביקוויטין המתויג GFP, GFP-Atg8a, מפוזר בתוך התאים. עם רעב, הוא יוצר פונקטה ירוקה ומתייג אוטופגוזומים. ברגע שאוטופגוזומים מתמזגים עם ליזוזומים, GFP מרוה באוטוליזוזומים החומציים, והפונקטה הירוקה נעלמת. אם אוטופגיה אינה מושרית או שההבשלה האוטופגוזומית מואצת, מספר ה-GFP pu...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body at JoVE.com

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השראת האוטופגיה בגוף השומן של הזחל Drosophila melanogaster באמצעות דלדול חומרי מזון ומנתח שינויים באוטופגיה באמצעות זני זבובים טרנסגניים.

ניתוח אוטופגיה הנגרמת על ידי רעב בגוף השומן של הזחל Drosophila melanogaster

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

פרוטוקול זה מתאר כיצד לגרום לאוטופגיה בגוף השומן של זחל Drosophila melanogaster באמצעות דלדול חומצות אמינו וכיצד לנתח את ההבדלים באוטופגיה בין שיבוטים מוטנטיים. מכיוון שאוטופגיה רגישה מאוד לזמינות תזונתית בתנאי תרבית, לאנליזה של שבטים, שיטה המנתחת תאים מוטנטיים לעומת תאים מסוג בר באותה רקמה, יש יתרון בניתוח פגמים באוטופגיה. התחילו בהחדרת שלושה זכרים ו-15 נקבות זבובים בוגרים לבקבוקון תרבית עם קמח תירס סטנדרטי או מולסה או אגר דרוזופילה מדיה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס להזדווגות.48 שעות לאחר הזירוז, הקש על בקבוקון ההזדווגות עד שהזבובים יהיו המומים וצנח על המדיה שבבסיס הבקבוקון. נתקו את בקבוקון ההזדווגות וכסו את פיו בבקבוקון תרבית הפוך מנותק במדיה טרייה. לאחר מכן הפכו והקישו על הבקבוקונים כדי להעביר את הזבובים לבקבוקון התרבית הטרי.חברו את בקבוקון התרבית הטרי והשליכו את הבקבוקון הישן. מניחים את בקבוקון התרבית הטרייה באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס להטלת ביצים על המצע הטרי. הוציאו את הזבובים לאחר שש שעות של הטלת ביצים והשליכו את הזבובים על ידי השלכתם לבקבוק המכיל 75% אתנול.לדגור על הבקבוקון עם עוברים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי לגרום לביטוי פליפאז. לאחר מכן, הניחו אותם באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס ואפשרו לעוברים להמשיך להתפתח. בעזרת מרית מעבדה, גרפו את המדיה המכילה את הזחלים המתפתחים לתוך צלחת פטרי 75 שעות לאחר הטלת הביצים.הוסיפו 1X PBS לתבשיל והפרידו בעדינות את מצע התרבית ואת הזחלים באמצעות מלקחיים ארוכים. לאחר מכן בחר 10 עד 15 זחלי כוכב שלישי מוקדם. מלאו את הבארות של צלחת ספוט שקע זכוכית בעלת תשע בארות עם PBS 1X והניחו את הזחלים המופרדים של הכוכב השלישי בבארות באמצעות מלקחיים ארוכים.לשטוף את הזחלים ביסודיות כדי להסיר את כל שאריות התקשורת. קח חמישה מיליליטר של תמיסת 20% סוכרוז בבקבוקון ריק ושים את הזחלים הנקיים של כוכב שלישי בתמיסה זו באמצעות מלקחיים ארוכים. דגרו על בקבוקון זה באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס במשך שש שעות לפני הקציר לנתיחה.הוסף 1X PBS לכל באר של צלחת שקע זכוכית תשע בארות ולהעביר את הזחלים לתוך הבארות עם מלקחיים ארוכים. מניחים זחל אחד בבאר כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה. אחזו בקוטיקולה של הזחל עם שתי מלקחיים 5 במרכז גזע הזחל וקרעו בעדינות את הקוטיקולות.גופי השומן החשופים, יחד עם רקמות פנימיות אחרות של הזחל, עדיין יהיו מחוברים לפגר הזחל. משוך מספיק כדי לחשוף את האיברים הפנימיים ככל האפשר. חזור על שלב זה עבור כל הזחלים.מעבירים את פגר הזחל לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר המכיל 500 מיקרוליטר של 4% PFA ודגרים במשך 30 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס מבלי לטלטל את הצינורות. לאחר 30 דקות, פיפטה החוצה את פתרון PFA. הוסף 500 מיקרוליטר של 1X PBS לתוך הצינור.נערו בעדינות את הצינור על מסובב שטוח למשך 10 דקות ולאחר מכן השליכו את תמיסת 1X PBS. חזור על פעולה זו שלוש פעמים. בעזרת מלקחיים ארוכים, מעבירים את פגר הזחל הקבוע והשטוף לבאר בצלחת תשעת שקעי הדיכאון המלאה ב-1X PBS.הסר את כל רקמות הגוף ללא שומן עם 5 מלקחיים. לבסוף, הרכיבו את חלקי גוף השומן על מגלשת מיקרוסקופ באמצעות 80% גליצרול כאמצעי הרכבה והניחו כיסוי על גבי. מוטנט אחד ומוטנט שני הם שני מוטנטים קטלניים עצמאיים על כרומוזום X וזבובי FRT 19A צהובים לבנים איזוגניים משמשים כאן כבקרה.תבניות GFP-Atg8a נותחו בקבוצת הביקורת, מוטנטית אחת או מוטנטית בשני גופי שומן של זחלי פסיפס, ושיבוטים מוטנטיים או שיבוטים של קבוצת ביקורת סומנו באופן שלילי על ידי RFP. בשיבוטים של הביקורת, הדפוסים של GFP-Atg8a Puncta היו דומים לאלה שבתאים החיוביים של RFP שמסביב. בשיבוטים מוטנטיים אחד, ה-GFP-Atg8a Puncta הופחתו במידה ניכרת.ובשני שיבוטים מוטנטיים, המספרים והגודל של GFP-Atg8a Puncta גדלו. השלב ההתפתחותי של הזחלים הוא קריטי כאן. יש לשנות את זמן ההתפתחות ואת משך הרעב בהתאם למתכוני התרבית של כל מעבדה.הליך זה יכול להיות מיושם כדי לחקור אוטופגיה סלקטיבית. לדוגמה, ניתן לנטר מיטופגיה בגופי שומן זבובים על ידי הצמדת חלבון פלואורסצנטי לרצף מיקוד מיטוכונדריאלי.

Research

JoVE Journal

Biology

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Dissection של מערכת העצבים המרכזית הזחל ב תסיסנית melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

תסיסנית הזחל Dissection NMJ

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

תסיסנית הזחל NMJ אימונוהיסטוכימיה

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

ניטור הלב לתפקד הזחל תסיסנית melanogaster ללימודים פיזיולוגיים

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection של Oenocytes מן למבוגרים תסיסנית melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

בידוד תסיסנית melanogaster האשכים

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

מדידה של תוחלת חיים ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

מדידה של הזחל פעילות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; צג פעילות

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...