Name: analyzing starvation-induced autophagy in the drosophila melanogaster larval fat body
Uploaded: 2022-08-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body at JoVE.com

Vi er takknemlige for THFC og BDSC for å gi fluestammene. Dr. Tong Chao støttes av National Natural Science Foundation of China (32030027, 91754103, 92157201) og grunnleggende forskningsfond for de sentrale universitetene. Vi takker kjernefasiliteten i Life Sciences Institute (LSI) for å tilby tjenester.

1. Drosophila-kryssing og egglegging
<ol><li>Introduser 3 mannlige (genotype hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) og 15 kvinnelige (genotype y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP ) voksne fluer (se materialfortegnelse) i et hetteglass med dyrkning (med standard maismel/melasse/agar Drosophila media ved 25 °C) for parring. MERK: Flere dyrkningsglass med samme kors må settes opp for å sikre nok larver til videre eksperimenter. Den mannlige fluestamm...

<ol>
	<li>Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+Molecular+machinery+for+self-eating.">Autophagy: Molecular machinery for self-eating.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).</li><li>Jin, S., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+autophagy+in+cancer:+Management+of+metabolic+stress.">Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress.</a> Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).</li><li>Mizushima, N., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+human+diseases.">Autophagy in human diseases.</a> New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).</li><li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion.">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).</li><li>Yang, Z., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eaten+alive:+A+history+of+macroautophagy.">Eaten alive: A history of macroautophagy.</a> Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).</li><li>Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagosome:+Origins+unknown,+biogenesis+complex.">The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).</li><li>Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosomes,+phagosomes,+autolysosomes,+phagolysosomes,+autophagolysosomes...Wait,I'mconfused.">Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes...Wait,I'mconfused.</a> Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).</li><li>Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+autophagy+proteins-Diversification+in+eukaryotes+and+potential+ancestors+in+prokaryotes.">The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes.</a> Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).</li><li>Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+and+regulation+of+starvation-induced+autophagy+in+the+Drosophila+fat+body.">Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body.</a> Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+import+regulates+cytosolic+protein+homeostasis+and+neuronal+integrity.">Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity.</a> Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).</li><li>Ichimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ubiquitin-like+system+mediates+protein+lipidation.">A ubiquitin-like system mediates protein lipidation.</a> Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).</li><li>Rusten, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+autophagy+in+the+Drosophila+fat+body+is+induced+by+ecdysone+through+regulation+of+the+PI3K+pathway.">Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway.</a> Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).</li><li>Nishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Atg5/Atg7-independent+alternative+macroautophagy.">Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy.</a> Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).</li><li>Ravikumar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mammalian+autophagy+in+physiology+and+pathophysiology.">Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).</li><li>Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg8+controls+phagophore+expansion+during+autophagosome+formation.">Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).</li><li>Shintani, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+proteins+facilitate+the+formation+of+transport+vesicles+in+the+cytoplasm+to+vacuole+targeting+pathway.">Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).</li><li>Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+regulation+by+nutrient+signaling.">Autophagy regulation by nutrient signaling.</a> Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).</li><li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+and+why+to+study+autophagy+in+Drosophila:+It's+more+than+just+a+garbage+chute.">How and why to study autophagy in Drosophila: It's more than just a garbage chute.</a> Methods. 75, 151-161 (2015).</li><li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome.">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59 (3), 499-509 (1989).</li><li>Senecoff, J. F., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directionality+in+FLP+protein-promoted+site-specific+recombination+is+mediated+by+DNA-DNA+pairing.">Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).</li><li>Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+in+Drosophila.">Mosaic analysis in Drosophila.</a> Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).</li><li>Zappia, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F/Dp+inactivation+in+fat+body+cells+triggers+systemic+metabolic+changes.">E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes.</a> eLife. 10, 67753 (2021).</li><li>Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Drosophila. , (1965).</li><li>Rizki, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+fat+body+surfaces.">Drosophila larval fat body surfaces.</a> Wilhelm Roux's Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).</li><li>Szeto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALIS+are+stress-induced+protein+storage+compartments+for+substrates+of+the+proteasome+and+autophagy.">ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy.</a> Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).</li><li>Renna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+inducers+of+autophagy+that+enhance+the+clearance+of+mutant+proteins+in+neurodegenerative+diseases.">Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).</li><li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+RNA+interference+screen+identifies+genes+that+regulate+autophagy+at+different+stages.">A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages.</a> Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).</li><li>Tian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+for+analysis+of+autophagy+induction.">An antibody for analysis of autophagy induction.</a> Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).</li><li>Nezis, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+autophagy+in+Drosophila.">Selective autophagy in Drosophila.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 146767 (2012).</li><li>Chu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+materials+for+monitoring+mitochondrial+biology.">Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology.</a> Materials. 14 (15), 4180 (2021).</li></ol>

Denne protokollen beskriver metodene for å (1) generere fluer som bærer mutante kloner i larvefettlegemene, (2) indusere autofagi gjennom aminosyresult og (3) dissekere larvefettlegemene. For å generere kloner vellykket i larvefettlegemene, må følgende kritiske trinn utføres flittig. (1) Timing av varmesjokket nøyaktig er avgjørende fordi mitotisk rekombinasjon bare skjer når vevet gjennomgår mitose, og (2) både varmesjokktemperatur og varighet er kritiske for å indusere FLP-uttrykk. Et standard vannbad på 3...

Autofagi er en "selvspisende" prosess indusert av ulike påkjenninger, inkludert aminosyresult1. Makroautofagi (heretter kalt autofagi) er den mest studerte typen autofagi og spiller en uerstattelig rolle i å opprettholde cellulær homeostase2. Funksjonsfeil i autofagi er forbundet med flere menneskelige sykdommer3. I tillegg er noen autofagirelaterte gener potensielle mål for behandling av ulike sykdommer4. 
Autofagi reguleres på en svært sofistikert måte5. Ved sult sekvestrerer isolasjonsmembranene cytoplasmatiske materialer for å danne dobbeltmembranerte autofagosomer6. Autofagosomer smelter deretter sammen med endosomer og lysosomer for å danne amfisomer og autolysosomer. Ved hjelp av lysosomale hydrolytiske enzymer nedbrytes det oppslukte cytoplasmatiske innholdet, og næringsstoffene resirkuleres7. 
Autofagi er en evolusjonært bevart prosess8. Drosophila melanogaster er en flott modell for å studere autofagiprosessen in vivo. Aminosyresult induserer lett autofagi i fluefett kroppsvev, en analog av menneskelig lever og fettvev9. Defekter i autofagi forstyrrer de distinkte punctamønstrene til flere autofagirelaterte proteiner, som Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 og p62, blant andre10. Derfor vil en analyse av mønstrene til disse autofagimarkørene bidra til å skjelne forekomsten av autofagidefekter og det defekte autofagitrinnet. For eksempel er det ubiquitinlignende proteinet Atg8 den mest brukte autofagimarkøren11. I Drosophila melanogaster har transgene stammer med et grønt fluorescerende protein (GFP)-merket Atg8a blitt utviklet12. GFP-Atg8a diffunderes i cytosol og kjerner i matede celler. Ved sult blir GFP-Atg8a behandlet og modifisert av fosfatidyletanolamin (PE) og danner puncta, som merker isolasjonsmembranene og fullt utviklede autofagosomer13,14. Gjennom direkte fluorescensmikroskopi kan autofagiinduksjonen lett observeres som en økning i GFP-Atg8 punctadannelse15. Atg8a puncta ville ikke dannes som respons på sult i nærvær av en autofagi initieringsdefekt. Siden GFP-Atg8a kan slukkes og fordøyes av den lave pH-verdien i autolysosomer, kan GFP-Atg8a puncta øke i antall hvis autofagi blokkeres sent i trinn16.
Siden autofagi er svært følsom for ernæringstilgjengelighet17, fører små forskjeller i kulturforhold ofte til variasjoner i fenotyper. Derfor har klonal analyse, en metode som analyserer mutante celler versus villtype kontrollceller i samme vev, en stor fordel i å dissekere autofagidefekter18. Ved å dra nytte av flippase / flippase recognition target (FLP / FRT)-mediert stedsspesifikk rekombinasjon mellom homologe kromosomer, blir fluer som bærer mosaikkvev lett laget19,20. Villtypecellene som omgir mutantcellene danner en perfekt indre kontroll for å unngå individuelle forskjeller21.
Denne studien beskriver hvordan man induserer autofagi ved aminosyresult og genererer GFP-Atg8a-uttrykkende kroppsvev med mosaikkfett. Disse protokollene kan brukes til å analysere forskjeller i autofagi blant mutante kloner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 Dressions Spot plate</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100854-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610440-0500</td>
			<td>Composition of 1x PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600445-0500</td>
			<td>Composition of 1x PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory spatula</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long forceps</td>
			<td>R&#39; DEER</td>
			<td>RST-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>CITOTEST</td>
			<td>80340-1130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>CITOTEST</td>
			<td>80302-2104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>Composition of 1x PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610476-0005</td>
			<td>Composition of 1x PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard cornmeal/molasses/agar fly food</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tong Lab-made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.</td>
			<td>10021418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield antifade mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vectorlabratory</td>
			<td>H-1200-10</td>
			<td>Recommended mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y&#39;w* Iso FRT19A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tong Lab&#39;s fly stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y&#39;w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tong Lab&#39;s fly stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y&#39;w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tong Lab&#39;s fly stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tong Lab&#39;s fly stocks</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing starvation-induced autophagy in the drosophila melanogaster larval fat body

Autofagi er en cellulær selvfordøyelsesprosess. Det leverer last til lysosomene for nedbrytning som svar på ulike påkjenninger, inkludert sult. Funksjonsfeil i autofagi er forbundet med aldring og flere menneskelige sykdommer. Autofagimaskineriet er sterkt konservert – fra gjær til mennesker. Larvefettlegemet til Drosophila melanogaster, en analog for virveldyr lever og fettvev, gir en unik modell for overvåking av autofagi in vivo. Autofagi kan lett induseres av næringssult i larvefettkroppen. De fleste autofagirelaterte gener er bevart i Drosophila. Det er utviklet mange transgene fluestammer som uttrykker merkede autofagimarkører, noe som letter overvåkingen av ulike trinn i autofagiprosessen. Den klonale analysen muliggjør en nøye sammenligning av autofagimarkører i celler med forskjellige genotyper i samme vevsstykke. Den nåværende protokollen beskriver prosedyrer for (1) generering av somatiske kloner i larvefettlegemet, (2) indusering av autofagi via aminosyresult og (3) dissekering av larvefettlegemet, med sikte på å lage en modell for å analysere forskjeller i autofagi ved hjelp av en autofagosommarkør (GFP-Atg8a) og klonal analyse.

Under matede forhold diffunderes det GFP-merkede ubiquitinlignende proteinet, GFP-Atg8a, inne i cellene. Ved sult danner den grønn puncta og merker autofagosomer. Når autofagosomer smelter sammen med lysosomer, slukkes GFP i de sure autolysosomene, og den grønne puncta forsvinner. Hvis autofagi ikke induseres eller autofagosommodningen akselereres, forventes antallet GFP-puncta å være lavt. Imidlertid, hvis fusjonen mellom autofagosomer og lysosomer er blokkert eller pH i autolysosomet blir grunnleggende, forventes ...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body at JoVE.com

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Denne protokollen beskriver induksjon av autofagi i Drosophila melanogaster larvefettlegeme via næringsutarming og analyserer endringer i autofagi ved bruk av transgene fluestammer.

Analyse av sultindusert autofagi i Drosophila melanogaster larvefettlegeme

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Denne protokollen beskriver hvordan man induserer autofagi i Drosophila melanogaster larvefettlegeme via aminosyreuttømming og hvordan man analyserer forskjellene i autofagi blant mutante kloner. Siden autofagi er svært følsom for ernæringstilgjengelighet under dyrkningsbetingelser, har klonal analyse, en metode som analyserer mutante celler versus villtypeceller i samme vev, en fordel i å dissekere autofagidefekter. Begynn med å introdusere tre hanner og 15 kvinnelige voksne fluer i et hetteglass med standard maismel eller melasse eller agar Drosophila media ved 25 grader Celsius for parring.48 timer etter induksjon, knips på hetteglasset med parring til fluene er bedøvet og slipp ned på mediet nederst i hetteglasset. Trekk ut parringshetteglasset og dekk munnen med et omvendt hetteglass med nye medier. Snu og bank deretter på hetteglassene for å overføre fluene til det ferske hetteglasset.Plugg hetteglasset med fersk kultur og kast det gamle hetteglasset. Plasser hetteglasset med fersk kultur i en 25 graders Celsius-inkubator for egglegging på ferske medier. Fjern fluene etter seks timers egglegging og kast fluene ved å dumpe dem i en kolbe som inneholder 75% etanol.Inkuber hetteglasset med embryoer i et 37 graders vannbad i en time for å indusere flippase-uttrykk. Deretter plasserer du dem i en 25 graders Celsius-inkubator og lar embryoene fortsette å utvikle seg. Bruk en laboratoriespatel, øs ut mediet som inneholder de utviklende larver i en petriskål 75 timer etter egglegging.Tilsett 1X PBS i fatet og skill forsiktig ut kulturmediet og larvene med lange tang. Velg deretter 10 til 15 tidlige tredje instar larver. Fyll brønnene på en ni-brønns glassforsenkningspunktplate med 1X PBS og plasser de separerte tredje instarlarvene i brønnene ved hjelp av lange tang.Vask larvene grundig for å fjerne alle medierester. Ta fem milliliter 20% sukroseoppløsning i et tomt hetteglass og legg de rene tredje instar larver i denne løsningen ved hjelp av lange tang. Inkuber dette hetteglasset i en 25 graders Celsius-inkubator i seks timer før du høster dem for disseksjon.Tilsett 1X PBS i hver brønn på den ni-brønns glassforsenkningspunktplaten og overfør larvene inn i brønnene med lange tang. Plasser en larve i en brønn med dorsalsiden vendt oppover. Ta tak i larvens kutikula med to 5 tang midt på larvestammen og riv forsiktig opp neglebåndene.De eksponerte fettlegemene, sammen med andre larvevev, vil fortsatt være festet til larvens. Trekk nok til å eksponere de indre organene så mye som mulig. Gjenta dette trinnet for alle larver.Overfør larvekroppen til et 1,5 milliliter mikrosentrifugerør inneholdende 500 mikroliter 4% PFA og inkuber i 30 minutter ved 25 grader Celsius uten å riste rørene. Etter 30 minutter pipetterer du ut PFA-oppløsningen. Tilsett 500 mikroliter 1X PBS i røret.Rist røret forsiktig på en flat rotator i 10 minutter og kast deretter 1X PBS-oppløsningen. Gjenta dette tre ganger. Bruk lange tanger til å overføre det faste og vaskede larvekadaveret til en brønn i den ni forsenkningspunktplaten fylt med 1X PBS.Fjern alt ikke-fett kroppsvev med 5 tang. Til slutt monterer du bitene av fettlegemet på et mikroskopglass med 80% glyserol som monteringsmedium og legger et deksel på toppen. Mutant en og mutant to er to uavhengige dødelige mutanter på X-kromosomet og isogeniserte gulhvite FRT 19A-fluer fungerer som en kontroll her.GFP-Atg8a-mønstre ble analysert i kontroll-, mutante en- eller mutant-to mosaikklarvefettlegemer, og de mutante klonene eller kontrollklonene ble negativt markert med RFP. I kontrollklonene var mønstrene til GFP-Atg8a Puncta lik de i de omkringliggende RFP-positive cellene. I mutante en mutant kloner ble GFP-Atg8a Puncta sterkt redusert.Og i mutante to mutante kloner ble antallet og størrelsen på GFP-Atg8a Puncta økt. Larvenes utviklingsstadium er kritisk her. Tiden for utvikling og varigheten av sult må endres i henhold til hvert laboratoriums kulturmediumoppskrifter.Denne prosedyren kan brukes til å utforske selektiv autofagi. For eksempel kan mitofagi overvåkes i fluefettlegemer ved å feste et fluorescerende protein til en mitokondriell målrettingssekvens.

Research

JoVE Journal

Biology

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Måling av levetid i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Imaging Gjennom pupal Case of<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Måling av Larve Aktiviteten i<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...