Name: analyzing starvation-induced autophagy in the drosophila melanogaster larval fat body
Uploaded: 2022-08-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body at JoVE.com

Sinek suşlarını sağladıkları için THFC ve BDSC'ye minnettarız. Dr. Tong Chao, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32030027, 91754103, 92157201) ve merkezi üniversiteler için Temel araştırma fonları tarafından desteklenmektedir. Yaşam Bilimleri Enstitüsü'ndeki (LSI) çekirdek tesise hizmet verdiği için teşekkür ederiz.

1. Drosophila geçişi ve yumurtlama
<ol><li>Çiftleşme için 3 erkek (genotip hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) ve 15 dişi (genotip y' w* Mu FRT19A / FM7, Kr GFP ) yetişkin sinekleri (bakınız Malzeme Tablosu) çiftleşme için bir kültür şişesine (25 ° C'de standart mısır unu / pekmez / agar Drosophila ortamı ile) koyun. NOT: Daha sonraki deneyler için yeterli larva sağlamak için aynı haçtan oluşan çoklu kültür şi?...

<ol>
	<li>Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+Molecular+machinery+for+self-eating.">Autophagy: Molecular machinery for self-eating.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).</li><li>Jin, S., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+autophagy+in+cancer:+Management+of+metabolic+stress.">Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress.</a> Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).</li><li>Mizushima, N., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+human+diseases.">Autophagy in human diseases.</a> New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).</li><li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion.">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).</li><li>Yang, Z., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eaten+alive:+A+history+of+macroautophagy.">Eaten alive: A history of macroautophagy.</a> Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).</li><li>Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagosome:+Origins+unknown,+biogenesis+complex.">The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).</li><li>Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosomes,+phagosomes,+autolysosomes,+phagolysosomes,+autophagolysosomes...Wait,I'mconfused.">Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes...Wait,I'mconfused.</a> Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).</li><li>Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+autophagy+proteins-Diversification+in+eukaryotes+and+potential+ancestors+in+prokaryotes.">The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes.</a> Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).</li><li>Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+and+regulation+of+starvation-induced+autophagy+in+the+Drosophila+fat+body.">Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body.</a> Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+import+regulates+cytosolic+protein+homeostasis+and+neuronal+integrity.">Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity.</a> Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).</li><li>Ichimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ubiquitin-like+system+mediates+protein+lipidation.">A ubiquitin-like system mediates protein lipidation.</a> Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).</li><li>Rusten, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+autophagy+in+the+Drosophila+fat+body+is+induced+by+ecdysone+through+regulation+of+the+PI3K+pathway.">Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway.</a> Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).</li><li>Nishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Atg5/Atg7-independent+alternative+macroautophagy.">Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy.</a> Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).</li><li>Ravikumar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mammalian+autophagy+in+physiology+and+pathophysiology.">Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).</li><li>Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg8+controls+phagophore+expansion+during+autophagosome+formation.">Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).</li><li>Shintani, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+proteins+facilitate+the+formation+of+transport+vesicles+in+the+cytoplasm+to+vacuole+targeting+pathway.">Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).</li><li>Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+regulation+by+nutrient+signaling.">Autophagy regulation by nutrient signaling.</a> Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).</li><li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+and+why+to+study+autophagy+in+Drosophila:+It's+more+than+just+a+garbage+chute.">How and why to study autophagy in Drosophila: It's more than just a garbage chute.</a> Methods. 75, 151-161 (2015).</li><li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome.">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59 (3), 499-509 (1989).</li><li>Senecoff, J. F., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directionality+in+FLP+protein-promoted+site-specific+recombination+is+mediated+by+DNA-DNA+pairing.">Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).</li><li>Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+in+Drosophila.">Mosaic analysis in Drosophila.</a> Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).</li><li>Zappia, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F/Dp+inactivation+in+fat+body+cells+triggers+systemic+metabolic+changes.">E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes.</a> eLife. 10, 67753 (2021).</li><li>Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Drosophila. , (1965).</li><li>Rizki, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+fat+body+surfaces.">Drosophila larval fat body surfaces.</a> Wilhelm Roux's Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).</li><li>Szeto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALIS+are+stress-induced+protein+storage+compartments+for+substrates+of+the+proteasome+and+autophagy.">ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy.</a> Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).</li><li>Renna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+inducers+of+autophagy+that+enhance+the+clearance+of+mutant+proteins+in+neurodegenerative+diseases.">Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).</li><li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+RNA+interference+screen+identifies+genes+that+regulate+autophagy+at+different+stages.">A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages.</a> Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).</li><li>Tian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+for+analysis+of+autophagy+induction.">An antibody for analysis of autophagy induction.</a> Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).</li><li>Nezis, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+autophagy+in+Drosophila.">Selective autophagy in Drosophila.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 146767 (2012).</li><li>Chu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+materials+for+monitoring+mitochondrial+biology.">Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology.</a> Materials. 14 (15), 4180 (2021).</li></ol>

Mevcut protokol, (1) larva yağ cisimlerinde mutant klonlar taşıyan sinekler üretmek, (2) amino asit açlığı yoluyla otofajiyi indüklemek ve (3) larva yağ cisimleri diseke etmek için yöntemleri açıklamaktadır. Larva yağ gövdelerinde klonları başarılı bir şekilde üretmek için, aşağıdaki kritik adımların özenle gerçekleştirilmesi gerekir. (1) Isı şokunun doğru bir şekilde zamanlaması çok önemlidir, çünkü mitotik rekombinasyon sadece doku mitoz geçirdiğinde gerçekleşir ve (2) hem ...

Otofaji, amino asit açlığı1 dahil olmak üzere çeşitli streslerin neden olduğu "kendi kendine yeme" sürecidir. Makrootofaji (bundan böyle otofaji olarak anılacaktır) en iyi çalışılmış otofaji türüdür ve hücresel homeostazın korunmasında yeri doldurulamaz bir rol oynar2. Otofajinin arızalanması çeşitli insan hastalıkları ile ilişkilidir3. Ek olarak, otofaji ile ilişkili bazı genler çeşitli hastalıkların tedavisinde potansiyel hedeflerdir4. 
Otofaji son derece sofistike bir şekilde düzenlenir5. Açlıktan öldükten sonra, izolasyon membranları çift membranlı otofagozomlar oluşturmak için sitoplazmik materyalleri ayırır6. Otofagozomlar daha sonra amfizomlar ve otolizozomlar oluşturmak için endozomlar ve lizozomlarla kaynaşır. Lizozomal hidrolitik enzimlerin yardımıyla, yutulan sitoplazmik içerikler parçalanır ve besinler geri dönüştürülür7. 
Otofaji evrimsel olarak korunmuş bir süreçtir8. Drosophila melanogaster, in vivo otofaji sürecini incelemek için harika bir modeldir. Amino asit açlığı, insan karaciğeri ve yağ dokusunun bir analoğu olan sinek yağ vücut dokusunda otofajiyi kolayca indükler9. Otofajideki kusurlar, diğerlerinin yanı sıra Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 ve p62 gibi otofaji ile ilişkili çeşitli proteinlerin farklı punkta paternlerini bozar10. Bu nedenle, bu otofaji belirteçlerinin paternlerini analiz etmek, otofaji defektlerinin oluşumunu ve kusurlu otofaji basamağını ayırt etmeye yardımcı olacaktır. Örneğin, ubikitin benzeri protein Atg8, en yaygın kullanılan otofaji belirteci11'dir. Drosophila melanogaster'de, yeşil floresan protein (GFP) etiketli Atg8a içeren transgenik suşlar başarıyla geliştirilmiştir12. GFP-Atg8a, beslenen hücrelerdeki sitosol ve çekirdeklerde yayılır. Açlıktan ölmek üzere, GFP-Atg8a fosfatidiletanolamin (PE) tarafından işlenir ve modifiye edilir ve izolasyon membranlarını ve tamamen gelişmiş otofagozomları13,14 etiketleyen punkta oluşturur. Doğrudan floresan mikroskopi ile otofaji indüksiyonu, GFP-Atg8 punkta oluşumu15'te bir artış olarak kolayca gözlemlenebilir. Atg8a puncta, otofaji başlatma defekti varlığında açlığa yanıt olarak oluşmaz. GFP-Atg8a, otolizozomlardaki düşük pH ile söndürülüp sindirilebildiğinden, otofaji geç evrelerde16'da bloke edilirse, GFP-Atg8a puncta sayıları artabilir.
Otofaji beslenme mevcudiyetine karşı oldukça hassas olduğu için17, kültür koşullarındaki küçük farklılıklar genellikle fenotiplerde farklılıklara yol açar. Bu nedenle, aynı dokudaki vahşi tip kontrol hücrelerine karşı mutant hücreleri analiz eden bir yöntem olan klonal analiz, otofaji defektlerinin diseksiyonunda büyük bir avantaja sahiptir18. Homolog kromozomlar arasındaki flippas / flippase tanıma hedefi (FLP / FRT) aracılı bölgeye özgü rekombinasyondan yararlanarak, mozaik dokuları taşıyan sinekler kolayca19,20 yapılır. Mutant hücreleri çevreleyen vahşi tip hücreler, bireysel farklılıkları önlemek için mükemmel bir iç kontrol oluşturur21.
Bu çalışma, amino asit açlığı ile otofajinin nasıl indükleneceğini ve GFP-Atg8a eksprese eden mozaik yağ vücut dokularının nasıl üretileceğini açıklamaktadır. Bu protokoller, mutant klonlar arasındaki otofajideki farklılıkları analiz etmek için kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 Dressions Spot plate</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100854-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610440-0500</td>
			<td>Composition of 1x PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600445-0500</td>
			<td>Composition of 1x PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory spatula</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long forceps</td>
			<td>R&#39; DEER</td>
			<td>RST-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>CITOTEST</td>
			<td>80340-1130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>CITOTEST</td>
			<td>80302-2104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>Composition of 1x PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610476-0005</td>
			<td>Composition of 1x PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard cornmeal/molasses/agar fly food</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tong Lab-made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.</td>
			<td>10021418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield antifade mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vectorlabratory</td>
			<td>H-1200-10</td>
			<td>Recommended mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y&#39;w* Iso FRT19A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tong Lab&#39;s fly stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y&#39;w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tong Lab&#39;s fly stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y&#39;w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tong Lab&#39;s fly stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tong Lab&#39;s fly stocks</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing starvation-induced autophagy in the drosophila melanogaster larval fat body

Otofaji, hücresel bir kendi kendine sindirim sürecidir. Açlık da dahil olmak üzere çeşitli streslere yanıt olarak bozunma için lizozomlara kargo gönderir. Otofajinin arızalanması yaşlanma ve çoklu insan hastalıkları ile ilişkilidir. Otofaji makinesi, mayadan insanlara kadar yüksek oranda korunmaktadır. Omurgalı karaciğeri ve yağ dokusu için bir analog olan Drosophila melanogaster'in larva yağ gövdesi, in vivo otofajiyi izlemek için benzersiz bir model sağlar. Otofaji, larva yağ gövdesindeki besin açlığı ile kolayca indüklenebilir. Otofaji ile ilişkili genlerin çoğu Drosophila'da korunur. Etiketli otofaji belirteçlerini ifade eden birçok transgenik sinek suşu geliştirilmiştir, bu da otofaji sürecindeki farklı adımların izlenmesini kolaylaştırır. Klonal analiz, aynı doku parçasında farklı genotiplere sahip hücrelerdeki otofaji belirteçlerinin yakından karşılaştırılmasını sağlar. Mevcut protokol, (1) larva yağ gövdesinde somatik klonlar üretmek, (2) amino asit açlığı yoluyla otofajiyi indüklemek ve (3) larva yağ gövdesini diseke etmek, otofaji farklılıklarını bir otofagozom belirteci (GFP-Atg8a) ve klonal analiz kullanarak analiz etmek için bir model oluşturmayı amaçlayan prosedürleri detaylandırmaktadır.

Beslenen koşullar altında, GFP etiketli ubikitin benzeri protein, GFP-Atg8a, hücrelerin içine yayılır. Açlıktan öldüğünde, yeşil punkta oluşturur ve otofagozomları etiketler. Otofagozomlar lizozomlarla kaynaştığında, GFP asidik otolizozomlarda söndürülür ve yeşil punkta kaybolur. Otofaji indüklenmezse veya otofagozom olgunlaşması hızlanırsa, GFP punkta sayısının düşük olması beklenir. Bununla birlikte, otofagozomlar ve lizozomlar arasındaki füzyon bloke edilirse veya otolizozomun pH'...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body at JoVE.com

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Bu protokol, Drosophila melanogaster larva yağ gövdesinde otofajinin besin tükenmesi yoluyla indüklenmesini açıklamakta ve transgenik sinek suşlarını kullanarak otofajideki değişiklikleri analiz etmektedir.

Drosophila melanogaster larva yağ gövdesinde açlığa bağlı otofajinin analizi

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Bu protokol, Drosophila melanogaster larva yağ gövdesinde amino asit tükenmesi yoluyla otofajinin nasıl indükleneceğini ve mutant klonlar arasındaki otofajideki farklılıkların nasıl analiz edileceğini açıklar. Otofaji, kültür koşullarında beslenme mevcudiyetine karşı oldukça hassas olduğundan, aynı dokudaki vahşi tip hücrelere karşı mutant hücreleri analiz eden bir yöntem olan klonal analiz, otofaji defektlerinin diseksiyonunda bir avantaja sahiptir. Üç erkek ve 15 dişi yetişkin sineği, çiftleşme için 25 santigrat derecede standart mısır unu veya pekmez veya agar Drosophila media içeren bir kültür şişesine sokarak başlayın.İndüksiyondan 48 saat sonra, sinekler sersemleyene kadar çiftleşme şişesine dokunun ve şişenin tabanındaki ortamın üzerine bırakın. Çiftleşme şişesinin fişini çekin ve ağzını taze medya ile fişi çekilmiş ters çevrilmiş bir kültür şişesi ile kapatın. Ardından, sinekleri taze kültür şişesine aktarmak için şişeleri çevirin ve dokunun.Taze kültür şişesini takın ve eski şişeyi atın. Taze kültür şişesini, taze ortama yumurtlamak için 25 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Altı saatlik yumurtlamadan sonra sinekleri çıkarın ve% 75 etanol içeren bir şişeye atarak sinekleri atın.Flippase ekspresyonunu indüklemek için şişeyi embriyolarla 37 santigrat derecelik bir su banyosunda bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, onları 25 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin ve embriyoların gelişmeye devam etmesine izin verin. Bir laboratuvar spatulası kullanarak, gelişmekte olan larvaları içeren ortamı, yumurtlamadan 75 saat sonra bir Petri kabına alın.Yemeğe 1X PBS ekleyin ve uzun forseps kullanarak kültür ortamını ve larvaları yavaşça ayırın. Sonra 10 ila 15 erken üçüncü instar larvasını seçin. Dokuz kuyucuklu bir cam çöküntü spot plakasının kuyularını 1X PBS ile doldurun ve ayrılmış üçüncü instar larvalarını uzun forseps kullanarak kuyucuklara yerleştirin.Tüm ortam kalıntılarını gidermek için larvaları iyice yıkayın. Boş bir şişeye beş mililitre% 20 sakkaroz çözeltisi alın ve temiz üçüncü instar larvalarını uzun forseps kullanarak bu çözeltiye yerleştirin. Bu şişeyi, diseksiyon için hasat etmeden önce altı saat boyunca 25 santigrat derecelik bir inkübatörde inkübe edin.Dokuz kuyucuklu cam çöküntü spot plakasının her bir kuyucuğuna 1X PBS ekleyin ve larvaları uzun forsepslerle kuyucuklara aktarın. Bir larvayı sırt tarafı yukarı bakacak şekilde bir kuyuya yerleştirin. Larva gövdesinin ortasındaki iki 5 forseps ile larvaların kütikülünü tutun ve tırnak etlerini yavaşça yırtın.Maruz kalan yağ gövdeleri, diğer larva iç dokuları ile birlikte, larvaların karkasına hala bağlanacaktır. İç organları mümkün olduğunca açığa çıkaracak kadar çekin. Tüm larvalar için bu adımı tekrarlayın.Larva karkası, 500 mikrolitre% 4 PFA içeren 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpleri sallamadan 25 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra PFA çözeltisini pipetleyin. Tüpe 500 mikrolitre 1X PBS ekleyin.Tüpü düz bir rotatör üzerinde 10 dakika boyunca yavaşça çalkalayın ve ardından 1X PBS çözeltisini atın. Bunu üç kez tekrarlayın. Uzun forsepsler kullanarak, sabit ve yıkanmış larva karkasını, 1X PBS ile doldurulmuş dokuz çöküntü nokta plakasındaki bir kuyuya aktarın.Yağsız tüm vücut dokularını 5 forseps ile çıkarın. Son olarak, yağ gövdesinin parçalarını, montaj ortamı olarak% 80 gliserol kullanarak bir mikroskop slaydına monte edin ve üstüne bir kapak kayması yerleştirin. Mutant bir ve mutant iki, X kromozomu üzerinde iki bağımsız ölümcül mutanttır ve izojenize sarı beyaz FRT 19A sinekleri burada bir kontrol görevi görür.GFP-Atg8a paternleri kontrol, mutant bir veya mutant iki mozaik larva yağ gövdesinde analiz edildi ve mutant klonlar veya kontrol klonları RFP ile negatif olarak işaretlendi. Kontrol klonlarında, GFP-Atg8a Puncta'nın kalıpları, çevredeki RFP pozitif hücrelerdekilere benzerdi. Mutant bir mutant klonda, GFP-Atg8a Puncta büyük ölçüde azaldı.Ve mutant iki mutant klonda, GFP-Atg8a Puncta'nın sayısı ve büyüklüğü arttı. Larva gelişim aşaması burada kritiktir. Gelişim süresi ve açlık süresi, her laboratuvarın kültür ortamı tariflerine göre değiştirilmelidir.Bu prosedür seçici otofajiyi araştırmak için uygulanabilir. Örneğin, mitopaji, bir mitokondriyal hedefleme dizisine bir floresan proteini ekleyerek sinek yağ gövdelerinde izlenebilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster Larvaların MSS diseksiyonu

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Biyoloji

Drosophila Larval NMJ Dissection

Drosophila Larvaların NMJ Diseksiyon

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila Larvaların NMJ İmmünohistokimya

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Mitoz incelenmesi için Mikroenjeksiyon Teknikleri Drosophila melanogaster Sinsityal Embriyo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Larvaların olarak izlenmesi Kalp Fonksiyonu Drosophila melanogaster Fizyolojik Çalışmaları

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Yetişkin gelen Oenocytes diseksiyonu Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

İzolasyonu Drosophila melanogaster Testisler

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

In ömrü ölçümü<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Larvaların Faaliyet Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...