Name: fluorescent in situ hybridization and 5-ethynyl-2'-deoxyuridine labeling for stem-like cells in the hydrozoan jellyfish cladonema pacificum
Uploaded: 2022-08-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل AMED تحت رقم المنحة JP22gm6110025 (إلى Y.N.) ومن قبل JSPS KAKENHI رقم المنحة 22H02762 (إلى Y.N.).

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. توليف التحقيق
<ol><li>استخراج الحمض النووي الريبي<ol><li>ضع ثلاثة Cladonema medusae حية مستزرعة في مياه البحر الاصطناعية (ASW) في أنبوب سعة 1.5 مل باس?...

<ol>
	<li>Lecl&#232;re, L., R&#246;ttinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+cnidarian+muscles:+Function,+anatomy,+development+and+regeneration.">Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157 (2017).</li><li>Bosch, T. C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Back+to+the+basics:+Cnidarians+start+to+fire.">Back to the basics: Cnidarians start to fire.</a> Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).</li><li>Gold, D. A., Jacobs, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+dynamics+in+Cnidaria:+Are+there+unifying+principles.">Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles.</a> Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).</li><li>Technau, U., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+Cnidaria.">Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria.</a> Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).</li><li>Lecl&#232;re, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternally+localized+germ+plasm+mRNAs+and+germ+cell/stem+cell+formation+in+the+cnidarian+Clytia.">Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia.</a> Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).</li><li>Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanisms+underlie+oral+vs+aboral+regeneration+in+the+cnidarian+Hydractinia+echinata.">Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata.</a> eLife. 4, 05506 (2015).</li><li>Sinigaglia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+regulation+in+a+regenerating+jellyfish.">Pattern regulation in a regenerating jellyfish.</a> eLife. 9, 54868 (2020).</li><li>David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+stem+cells+in+Hydra:+Multipotency+and+decision-making.">Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making.</a> The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).</li><li>R&#246;ttinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nematostella+vectensis,+an+emerging+model+for+deciphering+the+molecular+and+cellular+mechanisms+underlying+whole-body+regeneration.">Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration.</a> Cells. 10 (10), 2692 (2021).</li><li>Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clytia+hemisphaerica:+A+jellyfish+cousin+joins+the+laboratory.">Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory.</a> Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).</li><li>Peron, S., Houliston, E., Lecl&#232;re, L., Boutet, A., Shierwater, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Marine+Jellyfish+Model,+Clytia+hemisphaerica.">The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica.</a> Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. , 129-147 (2021).</li><li>Denker, E., Manuel, M., Lecl&#232;re, L., Le Guyader, H., Rabet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+progression+of+nematogenesis+from+stem+cells+through+differentiation+stages+in+the+tentacle+bulb+of+Clytia+hemisphaerica+(Hydrozoa,+Cnidaria).">Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria).</a> Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).</li><li>Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+potential+of+jellyfish:+Cellular+mechanisms+and+molecular+insights.">Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights.</a> Genes. 12 (5), 758 (2021).</li><li>Suga, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexibly+deployed+Pax+genes+in+eye+development+at+the+early+evolution+of+animals+demonstrated+by+studies+on+a+hydrozoan+jellyfish.">Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).</li><li>Fujiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+pattern+and+morphogenesis+of+medusa+tentacles+in+the+jellyfish+Cladonema+pacificum+(Hydrozoa,+Cnidaria).">Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria).</a> Zoological Letters. 5 (12), 13 (2019).</li><li>Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+controls+body+size+growth,+tentacle+morphogenesis,+and+regeneration+in+hydrozoan+jellyfish+Cladonema+pacificum.">Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum.</a> PeerJ. 7, 7579 (2019).</li><li>Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+accumulation+of+interstitial+cells+generates+the+branched+structure+of+Cladonema+medusa+tentacles.">Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles.</a> Development. 148 (23), (2021).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Angerer, L. M., Angerer, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+poly+A+++RNA+in+sea+urchin+eggs+and+embryos+by+quantitative+in+situ+hybridization.">Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization.</a> Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).</li><li>Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+in+organotypic+cerebellar+slice+cultures.">Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60353 (2019).</li><li>Tanaka, E. M., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+for+animal+regeneration.">The cellular basis for animal regeneration.</a> Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).</li><li>Penzo-M&#233;ndez, A. I., Stanger, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-size+regulation+in+mammals.">Organ-size regulation in mammals.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240 (2015).</li><li>Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Lecl&#232;re, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+safer,+urea-based+in+situ+hybridization+method+improves+detection+of+gene+expression+in+diverse+animal+species.">A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species.</a> Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).</li><li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Developmental Biology. 13 (1), 8 (2013).</li><li>Flici, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+SoxB-Hdac2+crosstalk+regulates+neurogenesis+in+a+cnidarian.">An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian.</a> Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+axial+Hox+code+controls+tissue+segmentation+and+body+patterning+in+Nematostella+vectensis.">An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis.</a> Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).</li><li>Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow-cycling+stem+cells+in+hydra+contribute+to+head+regeneration.">Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration.</a> Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).</li><li>Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+is+necessary+for+the+regeneration+of+oral+structures+in+the+anthozoan+cnidarian+Nematostella+vectensis.">Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis.</a> BMC Developmental Biology. 12 (1), 34 (2012).</li><li>Gold, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+developmental+disparity+in+the+tentacles+of+the+moon+jellyfish+Aurelia+sp.1.">Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1.</a> PLoS One. 10 (8), 0134741 (2015).</li><li>Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+tracking+supports+secondary+gastrulation+in+the+moon+jellyfish+Aurelia.">Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia.</a> Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).</li><li>Cheng, L. -. C., Alvarado, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+BrdU+staining+with+fluorescence+in+situ+hybridization+in+planarians.">Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians.</a> Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).</li></ol>

الخلايا المتكاثرة والخلايا الجذعية هي مصادر خلوية مهمة في عمليات مختلفة مثل التشكل والنمو والتجديد21,22. تصف هذه الورقة طريقة للتلوين المشترك لعلامة الخلايا الجذعية Nanos1 بواسطة FISH و EdU وضع العلامات في Cladonema medusae. اقترح العمل السابق باستخدام وضع العلا...

تعتبر Cnidaria شعبة metazoan متفرعة بشكل أساسي تحتوي على ذات أعصاب وعضلات ، مما يضعها في وضع فريد لفهم تطور نمو الحيوان وعلم وظائف الأعضاء 1,2. يتم تصنيف Cnidarians إلى مجموعتين رئيسيتين: Anthozoa (على سبيل المثال ، شقائق النعمان البحرية والشعاب المرجانية) تمتلك فقط يرقات planula ومراحل polyp sessile ، في حين أن Medusozoa (أعضاء Hydrozoa و Staurozoaو Scyphozoa و Cubozoa) عادة ما تأخذ شكل medusae السباحة الحرة ، أو قنديل البحر ، وكذلك يرقات planula والأورام الحميدة. عادة ما يظهر Cnidarians قدرة عالية على التجدد ، وقد جذبت آلياتهم الخلوية الأساسية ، وخاصة امتلاكهم للخلايا الجذعية البالغة والخلايا التكاثرية ، الكثير من الاهتمام 3,4. تم تحديد الخلايا الجذعية الهيدروزوانية في البداية في هيدرا ، وتقع في الفراغات الخلالية بين الخلايا الظهارية الأديم الظاهر ويشار إليها عادة باسم الخلايا الخلالية أو الخلايا i3.
تشترك خلايا Hydrozoan i في خصائص مشتركة تشمل تعدد القدرات ، والتعبير عن علامات الخلايا الجذعية المحفوظة على نطاق واسع (على سبيل المثال ، Nanos ، Piwi ، Vasa) ، وإمكانية الهجرة3،5،6،7،8. كخلايا جذعية وظيفية ، تشارك الخلايا i على نطاق واسع في التطور وعلم وظائف الأعضاء والاستجابات البيئية للحيوانات الهيدروزوانية ، مما يشهد على قدرتها العالية على التجدد واللدونة3. في حين أن الخلايا الجذعية ، على غرار الخلايا i ، لم يتم تحديدها خارج الهيدروزوان ، حتى في الأنواع النموذجية الراسخة Nematostella ، لا تزال الخلايا التكاثرية تشارك في صيانة وتجديد الأنسجة الجسدية ، وكذلك الخط الجرثومي9. نظرا لأن الدراسات في التطور والتجديد cnidarian قد أجريت في الغالب على من نوع polyp مثل Hydra و Hydractinia و Nematostella ، فإن الديناميات الخلوية ووظائف الخلايا الجذعية في أنواع قناديل البحر لا تزال دون معالجة إلى حد كبير.
تم استخدام قنديل البحر الهيدروزواني Clytia hemisphaerica ، وهو نوع من قناديل البحر العالمية ذات الموائل المختلفة حول العالم ، بما في ذلك البحر الأبيض المتوسط وأمريكا الشمالية ، كحيوان نموذجي تجريبي في العديد من الدراسات التنموية والتطورية10. بفضل صغر حجمها وسهولة التعامل معها وبيضها الكبير ، فإن Clytia مناسبة لصيانة المختبر ، وكذلك لإدخال الأدوات الوراثية مثل الجينات المحورة التي تم إنشاؤها مؤخرا وطرق خروج المغلوب11 ، مما يفتح الفرصة لإجراء تحليل مفصل للآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء بيولوجيا قنديل البحر. في مخالب Clytia medusa ، تتمركز الخلايا i في المنطقة القريبة ، والتي تسمى البصلة ، وتهاجر الأسلاف مثل الأرومات الخيطية إلى الطرف البعيد بينما تتمايز إلى أنواع خلايا متميزة ، بما في ذلك الخلايا الخيطية12.
أثناء تجديد Clytia manubrium ، العضو الفموي لقناديل البحر ، تهاجر خلايا Nanos1 + i الموجودة في الغدد التناسلية إلى المنطقة التي يفقد فيها manubrium استجابة للضرر وتشارك في تجديد manubrium7. تدعم هذه النتائج فكرة أن الخلايا i في Clytia تتصرف أيضا كخلايا جذعية وظيفية تشارك في التشكل والتجديد. ومع ذلك ، بالنظر إلى أن خصائص الخلايا i تختلف بين الحيوانات التمثيلية من نوع الاورام الحميدة مثل Hydra و Hydractinia3 ، فمن الممكن أن تتنوع خصائص ووظائف الخلايا الجذعية بين أنواع قناديل البحر. علاوة على ذلك ، باستثناء Clytia ، كانت التقنيات التجريبية محدودة لقناديل البحر الأخرى ، والديناميات التفصيلية للخلايا التكاثرية والخلايا الجذعية غير معروفة13.
قنديل البحر الهيدروزواني Cladonema pacificum هو كائن نموذجي ناشئ يمكن الاحتفاظ به في بيئة معملية بدون مضخة مياه أو نظام ترشيح. تحتوي Cladonema medusa على مخالب متفرعة ، وهي سمة مشتركة في عائلة Cladonematidae ، وعضو مستقبلات ضوئية يسمى ocellus على طبقة الأديم الظاهر بالقرب من المصباح14. تحدث عملية تفرع اللامسة في موقع تفرع جديد يظهر على طول الجانب المحوري من المجسة. بمرور الوقت ، تستمر المجسات في الاستطالة والتفرع ، مع دفع الفروع القديمة نحو الطرف15. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تتجدد مخالب كلادونيما في غضون أيام قليلة عند البتر. اقترحت الدراسات الحديثة دور الخلايا المتكاثرة والخلايا الشبيهة بالجذع في تفرع اللامسة وتجديدها في Cladonema16,17. ومع ذلك ، في حين تم استخدام التهجين التقليدي في الموقع (ISH) لتصور التعبير الجيني في Cladonema ، نظرا لدقته المنخفضة ، فمن الصعب حاليا مراقبة ديناميكيات الخلايا الجذعية على المستوى الخلوي بالتفصيل.
تصف هذه الورقة طريقة لتصور الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية في Cladonema بواسطة FISH والتلوين المشترك مع EdU ، وهي علامة على تكاثر الخلايا18. نتصور نمط التعبير عن Nanos1 ، وهي علامة الخلايا الجذعية 5,17 ، بواسطة FISH ، والتي تسمح بتحديد توزيع الخلايا الشبيهة بالجذع على مستوى الخلية الواحدة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التلوين المشترك لتعبير Nanos1 مع وضع العلامات EdU يجعل من الممكن التمييز بين الخلايا الشبيهة بالجذعية المتكاثرة بنشاط. يمكن تطبيق هذه الطريقة لمراقبة كل من الخلايا الشبيهة بالجذع والخلايا التكاثرية على مجموعة واسعة من مناطق التحقيق ، بما في ذلك تفرع المجسات ، وتوازن الأنسجة ، وتجديد الأعضاء في كلادونيما ، ويمكن تطبيق نهج مماثل على أنواع قناديل البحر الأخرى.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>137-06862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.1 mL transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>233-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>029-15043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DIG-POD</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11207733910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cladonema pacificum Nanos1 forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC 
			GA-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cladonema pacificum Piwi forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA 
			AGGC -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cladonema pacificum Piwi reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA 
			CTGGC -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>C10337</td>
			<td>EdU kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coroline off</td>
			<td>GEX Co. ltd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>chlorine neutralizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11175041910</td>
			<td>blocking buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG RNA labeling mix&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11277073910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P117B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECOS competent cell DH5&#945;</td>
			<td>NIPPON GENE</td>
			<td>316-06233</td>
			<td>competent cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast gene Gel/PCR Extraction kit</td>
			<td>Fast gene</td>
			<td>FG-91302</td>
			<td>gel extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast gene plasmid mini kit</td>
			<td>Fast gene</td>
			<td>FG-90502</td>
			<td>plasmid miniprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Wako&#160;</td>
			<td>068-00426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH&#160;</td>
			<td>H3393-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>096-05143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700-025</td>
			<td>agar plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12780-052</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>134-00495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mini Quick spin RNA columns</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814427001</td>
			<td>clean-up column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako&#160;</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONEC-W</td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20)</td>
			<td>Wako&#160;</td>
			<td>166-21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerMasher 2</td>
			<td>nippi&#160;</td>
			<td>891300</td>
			<td>homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Nacarai Tesque&#160;</td>
			<td>29442-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>74004</td>
			<td>total RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 RNase-Free Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T9172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEA LIFE</td>
			<td>Marin Tech</td>
			<td>N/A</td>
			<td>mixture of mineral salts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 RNA polymerase&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11031163001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10881767001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAITEC HB-100</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0040534-000</td>
			<td>Hybridization incuvator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa Ex Taq&#160;</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR001A</td>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>6210A</td>
			<td>cDNA synthesis kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Clone</td>
			<td>TOYOBO&#160;</td>
			<td>TAK101</td>
			<td>pTA2 Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA Plus Cyanine 5</td>
			<td>AKOYA Biosciences</td>
			<td>NEL745001KT</td>
			<td>tyramide signal amplification (TSA) technique</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>laser scanning confocal microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent in situ hybridization and 5-ethynyl-2'-deoxyuridine labeling for stem-like cells in the hydrozoan jellyfish cladonema pacificum

يظهر Cnidarians ، بما في ذلك شقائق النعمان البحرية والشعاب المرجانية وقناديل البحر ، مورفولوجيا وأنماط حياة متنوعة تتجلى في الاورام الحميدة اللاطئة و medusae السباحة الحرة. كما يتضح من النماذج الراسخة مثل Hydra و Nematostella ، تساهم الخلايا الجذعية و / أو الخلايا التكاثرية في تطوير وتجديد الاورام الحميدة cnidarian. ومع ذلك ، فإن الآليات الخلوية الأساسية في معظم قناديل البحر ، وخاصة في مرحلة ميدوسا ، غير واضحة إلى حد كبير ، وبالتالي ، فإن تطوير طريقة قوية لتحديد أنواع معينة من الخلايا أمر بالغ الأهمية. تصف هذه الورقة بروتوكولا لتصور الخلايا المتكاثرة الشبيهة بالساق في قنديل البحر الهيدروزواني Cladonema pacificum. تمتلك Cladonema medusae مخالب متفرعة تنمو باستمرار وتحافظ على قدرتها على التجدد طوال مرحلة البلوغ ، مما يوفر منصة فريدة لدراسة الآليات الخلوية التي تنظمها الخلايا المتكاثرة و / أو الشبيهة بالجذعية. يسمح التهجين الفلوري الكامل في الموقع (FISH) باستخدام علامة الخلايا الجذعية باكتشاف الخلايا الشبيهة بالجذع ، بينما يتيح وضع العلامات النبضية باستخدام 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ، وهي علامة طور S ، تحديد الخلايا المتكاثرة. من خلال الجمع بين كل من وضع العلامات FISH و EdU ، يمكننا اكتشاف الخلايا الشبيهة بالجذع المتكاثرة بنشاط على الحيوانات الثابتة ، ويمكن تطبيق هذه التقنية على نطاق واسع على الحيوانات الأخرى ، بما في ذلك أنواع قناديل البحر غير النموذجية.

تم استخدام مخالب Cladonema كنموذج لدراسة العمليات الخلوية للتشكل والتجديد15،16،17. يتكون هيكل اللامسة من أنبوب ظهاري حيث توجد خلايا تشبه الساق ، أو الخلايا i ، في المنطقة القريبة ، تسمى لمبة اللامسة ، وتضاف فروع جديدة بالتتابع إلى الجزء الخ...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum at JoVE.com

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

هنا ، نصف بروتوكولا لتصور الخلايا المتكاثرة الشبيهة بالساق في قنديل البحر Cladonema. يسمح التهجين الفلوري الكامل في الموقع مع علامة الخلايا الجذعية باكتشاف الخلايا الشبيهة بالجذع ، ويتيح وضع العلامات 5-ethynyl-2'-deoxyuridine تحديد الخلايا المتكاثرة. معا ، يمكن اكتشاف الخلايا الشبيهة بالجذعية المتكاثرة بنشاط.

التهجين الفلوري في الموقع ووضع العلامات 5-ethynyl-2'-deoxyuridine للخلايا الشبيهة بالجذعية في قنديل البحر الهيدروزواني Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and ...

يتيح التلوين المشترك لتعبير Nanos1 مع وضع العلامات EdU التمييز بين الخلايا الشبيهة بالجذعية المتكاثرة بنشاط. يمكننا تحديد توزيع الخلايا الشبيهة بالساق على مستوى الخلية المفردة في قنديل البحر كلادونيما. يمكننا تصور الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية والخلايا المتكاثرة في نفس عينة قنديل البحر ، مما يسمح باكتشاف الخلايا الجذعية المتكاثرة وغير المتكاثرة ، مما يؤدي إلى فهم عدم تجانس الخلايا الجذعية.علم الأحياء التنموي ودراسات التجديد باستخدام نماذج حيوانية تتضمن الخلايا الجذعية. قنديل البحر الهيدروزواني Cladonema pacificum هو كائن نموذجي ناشئ يمكن الاحتفاظ به في بيئة معملية دون أي نظام متخصص. Cladonema medusae لها مخالب متفرعة.يحدث التفرع في موقع جديد على طول الجانب المحوري من المجسة. بمرور الوقت ، تستمر المجسات في الاستطالة والتفرع ، مع دفع الفروع القديمة نحو الحافة. يمكن أن تتجدد المجسات أيضا في غضون أيام قليلة من البتر.الحجم الصغير وسهولة التعامل ووجود الخلايا الجذعية البالغة أو الخلايا الشبيهة بالجذع تجعل Cladonema نظاما جيدا للتحقيق في دور الخلايا الجذعية في العمليات المختلفة. للبدء ، ضع Cladonema medusae في أنابيب سعة 1.5 ملليلتر باستخدام ماصة نقل 3.5 ملليلتر وأضف ASW حتى إجمالي حجم 500 ميكرولتر. أضف 7.5 ميكرولتر من محلول مخزون EdU 10 مليمولار واحتضان العينات لمدة ساعة واحدة عند 22 درجة مئوية.انتظر لمدة ساعة وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من ASW الذي يحتوي على EdU. بعد تخدير medusae ، احتضان لمدة خمس دقائق. إصلاح medusae بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية مع 4 ٪ بارافورمالدهيد في ASW.لعلاج البروتيناز وما بعد التثبيت ، قم بإزالة البارافورمالدهيد واغسل العينات باستخدام PBS التي تحتوي على 0.1٪ توين 20 ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها. قم بإزالة PBST وإضافة المخزن المؤقت للتهجين. احتضان العينات في المخزن المؤقت للتهجين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.قم بإزالة المخزن المؤقت للتهجين وأضف المخزن المؤقت للتهجين الجديد. قبل التهجين عند 55 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل في حاضنة التهجين. قم بإزالة المخزن المؤقت للتهجين واحتضان المخزن المؤقت للتهجين الذي يحتوي على المجسات.تهجين عند 55 درجة مئوية لمدة 18 إلى 24 ساعة في حاضنة التهجين. بعد ذلك ، تابع إزالة المسبار. ابدأ بإزالة المخزن المؤقت للتهجين الذي يحتوي على مجسات ثم أضف محلول الغسيل العازل الأول.اغسل العينات بمحلول الغسيل مرتين لمدة 15 دقيقة عند 55 درجة مئوية. قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل الأول وأضف المخزن المؤقت للغسيل اثنين. اغسل العينات بمحلول غسيل مرتين لمدة 15 دقيقة عند 55 درجة مئوية.قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل الثاني ثم أضف 2X SSC. اغسل العينات باستخدام 2X SSC مرتين لمدة 15 دقيقة عند 55 درجة مئوية. قم بإزالة 2X SSC ثم أضف PBST المسخن مسبقا.اغسل العينات لمدة 15 دقيقة باستخدام PBST في درجة حرارة الغرفة. لحضانة الأجسام المضادة المضادة ل DIG ، ابدأ بإزالة PBST ثم أضف 1٪ من المخزن المؤقت للحظر. احتضان العينات لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أثناء الهز ببطء على الروك.بعد الحظر ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر بنسبة 1٪. أضف محلول مضاد ل DIG-POD واحتضان العينات طوال الليل عند أربع درجات مئوية. للكشف عن المسبار المسمى DIG ، قم بإزالة المحلول المضاد ل DIG-POD وأضف محلول تريس كلوريد الصوديوم توين المؤقت.اغسل العينات باستخدام محلول تريس كلوريد الصوديوم توين ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تمييع صبغة الفلورسنت مترافق محلول مخزون تيراميد في المخزن المؤقت لتخفيف التضخيم لجعل محلول تيراميد Cy5 النشط. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من محلول تريس كلوريد الصوديوم توين ثم أضف محلول تيراميد Cy5 النشط.احتضان العينات لمدة 10 دقائق في الظلام. اغسل العينات باستخدام PBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في الظلام. لتحضير كوكتيل الكشف عن EdU ، امزج المكونات.قم بإزالة PBST ثم أضف كوكتيل الكشف عن EdU. احتضان العينة في الظلام لمدة 30 دقيقة. يغسل مع PBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في الظلام.لتلطيخ الحمض النووي ، قم بتخفيف Hoechst في PBST لتحضير محلول Hoechst. إزالة PBST ثم قم بإضافة حل Hoechst. احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في الظلام.اغسل العينات باستخدام PBST ثلاث إلى أربع مرات لمدة 10 دقائق في الظلام. بعد ذلك للتركيب ، قم بنقل medusae إلى البنك على زجاج الشريحة باستخدام ماصة نقل مع قطع الطرف. ضعي غطاء برفق على medusae بالملقط وأغلقي جانب الغطاء بطلاء أظافر شفاف.كشف الوسم المشترك لتعبير Nanos1 والخلايا الإيجابية EdU عن النمط المكاني للخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية والخلايا التكاثرية في المجسة. تم توزيع الخلايا الإيجابية EdU على نطاق أوسع في جميع أنحاء لمبة اللامسة ، في حين أن الخلايا الإيجابية Nanos1 المتراكمة محليا بشكل أكبر في لمبة اللامسة وموقع التفرع الجديد ، تشير إلى أنه يتم اكتشاف توزيعات متميزة للخلايا الشبيهة بالجذع والخلايا المتكاثرة اعتمادا على توقيت النمو والمراحل المختلفة. لوحظ وضع العلامات المشتركة ل EdU و Nanos1 في 19.79٪ من الخلايا ، مما يشير إلى أن هذه الخلايا هي مجموعة خلايا جذعية تتكاثر بنشاط.ومن المثير للاهتمام ، تم العثور على 14.46٪ من الخلايا لتكون EdU إيجابية Nanos1 سلبية في منتصف المصباح وفي موقع التفرع الجديد ، مما يشير إلى وجود خلايا تكاثرية غير شبيهة بالجذعية. في المقابل ، لوحظ أن 26.32٪ من الخلايا إيجابية EdU Nanos1 سلبية في قاعدة المصباح وفي موقع التفرع الجديد ، مما يشير إلى وجود مجموعة من الخلايا الجذعية إما بطيئة الدورة أو هادئة ، ولا يتم اكتشاف أي منها عن طريق وضع علامات نبض EdU. يسمح وضع العلامات النبضية EdU مع وقت حضانة قصير باكتشاف الخلايا التكاثرية فقط بين الخلايا الشبيهة بالجذع والخلايا غير الشبيهة بالجذعية.عند تغيير وقت حضانة EdU والجمع بين تجارب المطاردة طويلة الأمد ، يمكن تمييز الخلايا الجذعية البطيئة أو أنواع الخلايا الأخرى بما في ذلك النسل والخلايا المتمايزة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

فهم توالد المبكر باستخدام المبسطة<em&gt; في الموقع</em&gt; بروتوكول التهجين في<em&gt; القيطم</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos

تطبيق للDNA محددة وصمة عار الميثيل الأخضر في بطاقات المواد الفلورية الأجنة

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

متعددة الهدف اللونية الجامع جبل<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين لمقارنة الجينات مجالات التعبير في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

تصور الخلايا مولتيسيلياتيد في الزرد من خلال بروتوكول مجتمعة في الموقع كله جبل فلوري التهجين والفلوره

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

تطبيق [رني] والحرارة الناجمة عن صدمة "التعبير عامل النسخ" إلى "إعادة برمجة الخلايا الجرثومية" إلى الخلايا العصبية في C. ايليجانس

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

ووليماونت في الموقع التهجين للأجنة أستياناكس

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

في المختبر توليد المشتقات سميط من البشرية التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

الجينوبة والقياس الكمي للتهجين في الموقع تلطيخ في حمار وحشي

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

التهجين الكامل في الموقع في أجنة حمار وحشي وأنبوب تشكيل اساي في iPSC-ECs لدراسة دور Endoglin في التنمية الوعائية

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...