Name: fluorescent in situ hybridization and 5-ethynyl-2'-deoxyuridine labeling for stem-like cells in the hydrozoan jellyfish cladonema pacificum
Uploaded: 2022-08-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum at JoVE.com

本研究は、AMEDの課題番号JP22gm6110025(Y.N.宛)およびJSPS科研費22H02762(Y.N.宛)の支援を受けて行われました。

注意: このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器に関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。
1. プローブ合成
<ol><li>RNA抽出<ol><li>人工海水(ASW)で培養した生きたクラ ドネマ ・メデューサ3種を、先端を切り落とした3.1mLトランスファーピペットを用いて1.5mLチューブに入れ、できるだけ多くのASWを除去?...

<ol>
	<li>Lecl&#232;re, L., R&#246;ttinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+cnidarian+muscles:+Function,+anatomy,+development+and+regeneration.">Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157 (2017).</li><li>Bosch, T. C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Back+to+the+basics:+Cnidarians+start+to+fire.">Back to the basics: Cnidarians start to fire.</a> Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).</li><li>Gold, D. A., Jacobs, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+dynamics+in+Cnidaria:+Are+there+unifying+principles.">Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles.</a> Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).</li><li>Technau, U., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+Cnidaria.">Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria.</a> Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).</li><li>Lecl&#232;re, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternally+localized+germ+plasm+mRNAs+and+germ+cell/stem+cell+formation+in+the+cnidarian+Clytia.">Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia.</a> Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).</li><li>Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanisms+underlie+oral+vs+aboral+regeneration+in+the+cnidarian+Hydractinia+echinata.">Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata.</a> eLife. 4, 05506 (2015).</li><li>Sinigaglia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+regulation+in+a+regenerating+jellyfish.">Pattern regulation in a regenerating jellyfish.</a> eLife. 9, 54868 (2020).</li><li>David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+stem+cells+in+Hydra:+Multipotency+and+decision-making.">Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making.</a> The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).</li><li>R&#246;ttinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nematostella+vectensis,+an+emerging+model+for+deciphering+the+molecular+and+cellular+mechanisms+underlying+whole-body+regeneration.">Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration.</a> Cells. 10 (10), 2692 (2021).</li><li>Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clytia+hemisphaerica:+A+jellyfish+cousin+joins+the+laboratory.">Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory.</a> Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).</li><li>Peron, S., Houliston, E., Lecl&#232;re, L., Boutet, A., Shierwater, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Marine+Jellyfish+Model,+Clytia+hemisphaerica.">The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica.</a> Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. , 129-147 (2021).</li><li>Denker, E., Manuel, M., Lecl&#232;re, L., Le Guyader, H., Rabet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+progression+of+nematogenesis+from+stem+cells+through+differentiation+stages+in+the+tentacle+bulb+of+Clytia+hemisphaerica+(Hydrozoa,+Cnidaria).">Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria).</a> Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).</li><li>Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+potential+of+jellyfish:+Cellular+mechanisms+and+molecular+insights.">Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights.</a> Genes. 12 (5), 758 (2021).</li><li>Suga, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexibly+deployed+Pax+genes+in+eye+development+at+the+early+evolution+of+animals+demonstrated+by+studies+on+a+hydrozoan+jellyfish.">Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).</li><li>Fujiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+pattern+and+morphogenesis+of+medusa+tentacles+in+the+jellyfish+Cladonema+pacificum+(Hydrozoa,+Cnidaria).">Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria).</a> Zoological Letters. 5 (12), 13 (2019).</li><li>Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+controls+body+size+growth,+tentacle+morphogenesis,+and+regeneration+in+hydrozoan+jellyfish+Cladonema+pacificum.">Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum.</a> PeerJ. 7, 7579 (2019).</li><li>Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+accumulation+of+interstitial+cells+generates+the+branched+structure+of+Cladonema+medusa+tentacles.">Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles.</a> Development. 148 (23), (2021).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Angerer, L. M., Angerer, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+poly+A+++RNA+in+sea+urchin+eggs+and+embryos+by+quantitative+in+situ+hybridization.">Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization.</a> Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).</li><li>Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+in+organotypic+cerebellar+slice+cultures.">Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60353 (2019).</li><li>Tanaka, E. M., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+for+animal+regeneration.">The cellular basis for animal regeneration.</a> Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).</li><li>Penzo-M&#233;ndez, A. I., Stanger, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-size+regulation+in+mammals.">Organ-size regulation in mammals.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240 (2015).</li><li>Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Lecl&#232;re, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+safer,+urea-based+in+situ+hybridization+method+improves+detection+of+gene+expression+in+diverse+animal+species.">A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species.</a> Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).</li><li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Developmental Biology. 13 (1), 8 (2013).</li><li>Flici, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+SoxB-Hdac2+crosstalk+regulates+neurogenesis+in+a+cnidarian.">An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian.</a> Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+axial+Hox+code+controls+tissue+segmentation+and+body+patterning+in+Nematostella+vectensis.">An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis.</a> Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).</li><li>Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow-cycling+stem+cells+in+hydra+contribute+to+head+regeneration.">Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration.</a> Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).</li><li>Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+is+necessary+for+the+regeneration+of+oral+structures+in+the+anthozoan+cnidarian+Nematostella+vectensis.">Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis.</a> BMC Developmental Biology. 12 (1), 34 (2012).</li><li>Gold, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+developmental+disparity+in+the+tentacles+of+the+moon+jellyfish+Aurelia+sp.1.">Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1.</a> PLoS One. 10 (8), 0134741 (2015).</li><li>Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+tracking+supports+secondary+gastrulation+in+the+moon+jellyfish+Aurelia.">Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia.</a> Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).</li><li>Cheng, L. -. C., Alvarado, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+BrdU+staining+with+fluorescence+in+situ+hybridization+in+planarians.">Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians.</a> Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).</li></ol>

増殖細胞および幹細胞は、形態形成、成長、および再生などの様々な過程において重要な細胞源である21,22。この論文では、クラドネマメデューサにおけるFISHおよびEdU標識によって幹細胞マーカーNanos1を共染色する方法について説明しています。EdUまたはBrdU標識を用いた以前の研究では、増殖細胞が触手球根に局在することが示唆さ?...

刺胞動物は、神経と筋肉を持つ動物を含む基本的に分岐した後生動物門と考えられており、動物の発生と生理学の進化を理解するためのユニークな位置にあります1,2。刺胞動物は2つの主要なグループに分類されます:アントゾア(イソギンチャクやサンゴなど)はプラヌラ幼虫と固着性ポリープステージのみを持っていますが、メドゥソゾア(ヒドロゾア、スタウロゾア、シフォゾア、キュボゾアのメンバー)は通常、遊泳するメデューサ、またはクラゲ、およびプラヌラの幼虫とポリープの形をとります。刺胞動物は一般的に高い再生能力を示し、その根底にある細胞メカニズム、特に成体幹細胞と増殖細胞の所有が大きな注目を集めています3,4。Hydraで最初に同定されたヒドロ虫幹細胞は、外胚葉上皮細胞間質間質に位置し、一般に間質細胞またはi細胞と呼ばれます3。
ヒドロ虫i細胞は、多能性、広く保存されている幹細胞マーカー(Nanos、Piwi、Vasaなど)の発現、および遊走の可能性3,5,6,7,8を含む共通の特徴を共有しています。機能的な幹細胞として、i細胞はヒドロ虫動物の発生、生理学、環境応答に広く関与しており、その高い再生能力と可塑性を証明しています3。幹細胞は、i細胞と同様に、ヒドロ虫以外では同定されていませんが、確立されたモデル種である線虫でさえ、増殖細胞は依然として体細胞組織および生殖系列の維持と再生に関与しています9。刺胞動物の発生と再生に関する研究は、主にヒドラ、ヒドラクチニア、ネマトステラなどのポリープ型動物で行われてきたため、クラゲ種の幹細胞の細胞動態と機能はほとんど取り上げられていません。
ヒドロ虫クラゲ Clytia hemisphaerica は、地中海や北米を含む世界中で異なる生息地を持つ国際的なクラゲ種であり、いくつかの発生および進化研究で実験モデル動物として利用されています10。サイズが小さく、取り扱いが簡単で卵が大きいため、 Clytia は実験室でのメンテナンスや、最近確立されたトランスジェネシスやノックアウト法などの遺伝ツールの導入に適しており11、クラゲの生物学の根底にある細胞および分子メカニズムの詳細な分析の機会を開きます。 Clytia medusa触手では、i細胞は球根と呼ばれる近位領域に局在し、線虫などの前駆細胞は線虫細胞を含む異なる細胞型に分化しながら遠位先端に移動します12。
クラゲの口腔器官であるClytia manubriumの再生中に、生殖腺に存在するNanos1+ i細胞は、損傷に応答してマヌブリウムが失われる領域に移動し、マニュブリウム7の再生に関与します。これらの知見は、Clytiaのi細胞が、形態形成と再生に関与する機能的な幹細胞としても振る舞うという考えを支持している。しかし、ヒドラやヒドラクチニア3などの代表的なポリープ型動物ではi細胞の性質が異なることから、クラゲ種間で幹細胞の特性や機能が多様化している可能性があります。さらに、Clytiaを除いて、他のクラゲの実験技術は限られており、増殖細胞と幹細胞の詳細な動態は不明です13。
ヒドロ虫クラゲCladonema pacificumは、ウォーターポンプやろ過システムなしで実験室環境で保管できる新しいモデル生物です。クラドネマメデューサは、クラドネマ科に共通する特徴である枝分かれした触手と、球根14近くの外胚葉層に卵子と呼ばれる光受容体器官を持っています。触手分岐プロセスは、触手の軸方向に沿って現れる新しい分岐部位で発生します。時間が経つにつれて、触手は伸びて枝分かれし続け、古い枝は先端15に向かって押し出されます。さらに、クラドネーマの触手は切断後数日以内に再生する可能性があります。最近の研究では、クラドネーマの触手の分岐と再生における増殖細胞と幹細胞のような細胞の役割が示唆されています16,17。しかし、従来のin situハイブリダイゼーション(ISH)は、クラドネーマの遺伝子発現を可視化するために利用されてきましたが、分解能が低いため、幹細胞の動態を細胞レベルで詳細に観察することは現在のところ困難です。
この論文では、FISHによってクラドネーマの幹細胞様細胞を可視化し、細胞増殖のマーカーであるEdUと共染色する方法について説明しています18。幹細胞マーカー5,17であるNanos1の発現パターンをFISHで可視化することで、幹細胞様細胞の分布を1細胞レベルで同定することができます。さらに、Nanos1発現とEdU標識の共染色により、活発に増殖している幹細胞様細胞を区別することができます。幹細胞様細胞と増殖細胞の両方をモニタリングするこの方法は、クラドネーマにおける触手の分岐、組織の恒常性、臓器再生など、幅広い研究分野に適用でき、同様のアプローチは他のクラゲ種にも適用できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>137-06862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.1 mL transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>233-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>029-15043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DIG-POD</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11207733910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cladonema pacificum Nanos1 forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC 
			GA-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cladonema pacificum Piwi forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA 
			AGGC -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cladonema pacificum Piwi reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA 
			CTGGC -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>C10337</td>
			<td>EdU kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coroline off</td>
			<td>GEX Co. ltd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>chlorine neutralizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11175041910</td>
			<td>blocking buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG RNA labeling mix&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11277073910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P117B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECOS competent cell DH5&#945;</td>
			<td>NIPPON GENE</td>
			<td>316-06233</td>
			<td>competent cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast gene Gel/PCR Extraction kit</td>
			<td>Fast gene</td>
			<td>FG-91302</td>
			<td>gel extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast gene plasmid mini kit</td>
			<td>Fast gene</td>
			<td>FG-90502</td>
			<td>plasmid miniprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Wako&#160;</td>
			<td>068-00426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH&#160;</td>
			<td>H3393-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>096-05143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700-025</td>
			<td>agar plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12780-052</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>134-00495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mini Quick spin RNA columns</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814427001</td>
			<td>clean-up column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako&#160;</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONEC-W</td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20)</td>
			<td>Wako&#160;</td>
			<td>166-21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerMasher 2</td>
			<td>nippi&#160;</td>
			<td>891300</td>
			<td>homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Nacarai Tesque&#160;</td>
			<td>29442-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>74004</td>
			<td>total RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 RNase-Free Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T9172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEA LIFE</td>
			<td>Marin Tech</td>
			<td>N/A</td>
			<td>mixture of mineral salts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 RNA polymerase&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11031163001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10881767001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAITEC HB-100</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0040534-000</td>
			<td>Hybridization incuvator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa Ex Taq&#160;</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR001A</td>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>6210A</td>
			<td>cDNA synthesis kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Clone</td>
			<td>TOYOBO&#160;</td>
			<td>TAK101</td>
			<td>pTA2 Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA Plus Cyanine 5</td>
			<td>AKOYA Biosciences</td>
			<td>NEL745001KT</td>
			<td>tyramide signal amplification (TSA) technique</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>laser scanning confocal microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent in situ hybridization and 5-ethynyl-2'-deoxyuridine labeling for stem-like cells in the hydrozoan jellyfish cladonema pacificum

イソギンチャク、サンゴ、クラゲなどの刺胞動物は、固着性ポリープや自由に泳ぐメデューサに現れる多様な形態とライフスタイルを示します。 ヒドラ や ネマトステラなどの確立されたモデルに例示されるように、幹細胞および/または増殖細胞は刺胞動物ポリープの発生と再生に寄与します。しかし、ほとんどのクラゲの根底にある細胞メカニズム、特にメデューサの段階はほとんど不明であるため、特定の細胞タイプを特定するための堅牢な方法を開発することが重要です。この論文は、ヒドロ虫クラゲ Cladonema pacificumにおける茎様増殖細胞を可視化するためのプロトコルを記載する。 Cladonema medusaeは、成体期を通じて継続的に成長し、再生能力を維持する分岐触手を備えており、増殖細胞および/または幹細胞様細胞によって調整される細胞メカニズムを研究するための独自のプラットフォームを提供します。幹細胞マーカーを用いたホールマウント蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)は幹細胞様細胞の検出を可能にし、S期マーカーである5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)によるパルス標識は増殖細胞の同定を可能にします。FISH標識とEdU標識を組み合わせることで、固定動物で活発に増殖している幹細胞を検出することができ、この手法は非モデルクラゲ種を含む他の動物にも広く適用できます。

クラドネーマ触手は、形態形成と再生の細胞プロセスを研究するためのモデルとして使用されています15,16,17。触手構造は、触手球と呼ばれる近位領域に幹状細胞(i細胞)が位置する上皮管で構成され、鰗茎の遠位領域の後部に軸側に沿って新しい枝が順次追加されます(図3A)15?...

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Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

ここでは、クラゲ クラドネーマにおける茎様増殖細胞を可視化するためのプロトコールについて述べる。幹細胞マーカーとのホールマウント蛍光 in situ ハイブリダイゼーションは幹細胞様細胞の検出を可能にし、5-エチニル-2'-デオキシウリジン標識は増殖細胞の同定を可能にします。一緒に、活発に増殖している幹細胞様細胞を検出することができる。

ヒドロ虫クラゲクラドネマパシフィカムにおける幹細胞様細胞の蛍光In situハイブリダイゼーションと5-エチニル-2'-デオキシウリジン標識

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and ...

Nanos1発現とEdU標識の共染色により、活発に増殖している幹細胞様細胞を区別することができます。クラゲクラドネマの単一細胞レベルで幹細胞の分布を特定できます。同じクラゲサンプル中の幹細胞様細胞と増殖細胞を可視化することができ、増殖性幹細胞と非増殖性幹細胞の検出が可能となり、幹細胞の不均一性の理解につながります。幹細胞を含む動物モデルを用いた発生生物学・再生研究ヒドロ虫クラゲCladonema pacificumは、特別なシステムなしで実験室環境で維持できる新しいモデル生物です。クラドネマメデューサは枝分かれした触手を持っています。分岐は、触手の軸方向に沿った新しい部位で発生します。時間が経つにつれて、触手は伸びて枝分かれし続け、古い枝は先端に向かって押し出されます。触手は切断後数日以内に再生することもできます。サイズが小さく、取り扱いが簡単で、成体幹細胞または幹細胞様細胞が存在するため、クラドネーマはさまざまなプロセスにおける幹細胞の役割を調査するのに適したシステムです。まず、3.5ミリリットルのトランスファーピペットを使用してCladonema medusaeを1.5ミリリットルのチューブに入れ、ASWを最大500マイクロリットルまで加えます。7.5マイクロリットルの10ミリモルEdUストック溶液を加え、サンプルを摂氏22度で1時間インキュベートします。1 時間待ってから、EdU を含む ASW をできるだけ多く削除します。メデューサを麻酔した後、5分間インキュベートします。ASWに4%パラホルムアルデヒドを入れて摂氏4度で一晩メデューサを固定します。プロテイナーゼ処理および固定後、パラホルムアルデヒドを除去し、0.1%Tweenを含むPBSでサンプルを20回ずつ10分間洗浄します。PBSTを除去し、ハイブリダイゼーションバッファーを追加します。サンプルをハイブリダイゼーションバッファー中で室温で15分間インキュベートします。ハイブリダイゼーションバッファーを除去し、新鮮なハイブリダイゼーションバッファーを添加する。ハイブリダイゼーションインキュベーター内で少なくとも2時間摂氏55度でプレハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションバッファーを除去し、プローブを含むハイブリダイゼーションバッファーと共にインキュベートします。ハイブリダイゼーションインキュベーター内で摂氏55度で18〜24時間ハイブリダイズする。次に、プローブの取り外しに進みます。プローブを含むハイブリダイゼーションバッファーを除去することから始め、次に洗浄バッファー1を追加します。サンプルを洗浄バッファーで摂氏55度で15分間2回洗浄します。洗浄バッファー1を除去し、洗浄バッファー2を追加します。サンプルを洗浄バッファー2で摂氏55度で15分間2回洗浄します。洗浄バッファー2を除去し、次に2X SSCを追加します。サンプルを2X SSCで摂氏55度で15分間2回洗浄します。2X SSCを取り外してから、予熱したPBSTを追加します。サンプルを室温でPBSTで15分間洗浄します。抗DIG抗体のインキュベーションでは、まずPBSTを除去し、次に1%ブロッキングバッファーを追加します。ロッカーでゆっくりと振とうしながら、室温で少なくとも1時間サンプルをインキュベートします。ブロック後、1% ブロッキング バッファーを削除します。抗DIG-POD溶液を加え、サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートします。DIG標識プローブを検出するには、抗DIG-POD溶液を除去し、トリス塩化ナトリウムトゥイーンバッファーを追加します。サンプルを塩化トリスナトリウムトゥイーンバッファーで室温で10分間3回洗浄します。蛍光色素結合チラミドストック溶液を増幅希釈バッファーで希釈し、活性型Cy5チラミド溶液を作ります。できるだけ多くのトリス塩化ナトリウムトゥイーンバッファーを除去してから、活性Cy5チラミド溶液を追加します。サンプルを暗所で10分間インキュベートします。サンプルをPBSTで暗所で10分間3回洗浄します。EdU検出カクテルを準備するには、成分を混合します。PBSTを削除してから、EdU検出カクテルを追加します。サンプルを暗所で30分間インキュベートします。暗所で10分間PBSTで3回洗います。DNA染色の場合は、ヘキストをPBSTで希釈してヘキスト溶液を調製します。PBST を削除し、ヘキスト ソリューションを追加します。サンプルを暗所で30分間インキュベートします。サンプルをPBSTで3〜4回、暗所で10分間洗浄します。次に取り付けるために、先端を切り取ったトランスファーピペットを使用して、メデューサをスライドガラス上の土手に移します。鉗子でメデューサの上にカバーガラスをそっと置き、カバーガラスの側面を透明なマニキュアで密封します。Nanos1発現とEdU陽性細胞の共標識により、触手内の幹細胞と増殖細胞の空間パターンが明らかになりました。EdU陽性細胞は触手球全体に広く分布し、Nanos1陽性細胞は触手球と新しい分岐部位に局所的に蓄積し、発生時期や病期によって幹細胞と増殖細胞の明確な分布が検出されることが示唆されました。EdUとNanos1の共標識は19.79%の細胞で観察され、これらの細胞が活発に増殖する幹細胞集団であることを示唆しています。興味深いことに、細胞の14.46%が球根の中央と新しい分岐部位でEdU陽性のNanos1陰性であることが判明し、非幹様増殖細胞の存在を示唆しています。対照的に、26.32%の細胞が球根の基部と新しい分岐部位でEdU陰性のNanos1陽性であることが観察され、遅いサイクルまたは静止した幹細胞集団の存在を示しており、どちらもEdUパルス標識では検出されません。短いインキュベーション時間のEdUパルス標識により、幹細胞様細胞と非幹細胞様細胞のうち増殖細胞のみを検出することができます。EdUのインキュベーション時間を変更し、長時間の追跡実験を組み合わせる場合、ゆっくりとしたサイクリング幹細胞または子孫および分化細胞を含む他の細胞タイプをマークすることができます。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

簡体字を使用した初期の器官形成の理解<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーションプロトコルで<em&gt;アフリカツメガエル</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

発生生物学

Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos

胚の蛍光標識でDNA特異的染色メチルグリーンの応用

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

マルチターゲット発色ホールマウント<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーションにおける遺伝子発現のドメインを比較します<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

線虫のニューロンに生殖細胞を再プログラムする RNAi と熱衝撃による転写因子の発現のアプリケーション

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

In Situ ハイブリダイゼーションアステュアナクス胚の Wholemount

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

ゼブラフィッシュにおけるin situハイブリダイゼーション染色のジェノタイピングと定量化

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

iPSC-ICにおけるゼブラフィッシュ胚の全山ハイブリダイゼーションとチューブ形成アッセイは血管開発におけるエンドリンの役割を研究する

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...