Name: fluorescent in situ hybridization and 5-ethynyl-2'-deoxyuridine labeling for stem-like cells in the hydrozoan jellyfish cladonema pacificum
Uploaded: 2022-08-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por AMED bajo el número de subvención JP22gm6110025 (a Y.N.) y por el número de subvención JSPS KAKENHI 22H02762 (a Y.N.).

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos y equipos utilizados en este protocolo.
1. Síntesis de la sonda
<ol><li>Extracción de ARN<ol><li>Coloque tres Cladonema medusae vivas que se cultivan en agua de mar artificial (ASW) en un tubo de 1,5 ml utilizando una pipeta de transferencia de 3,1 ml con la punta cortada, y retire la mayor cantidad de ASW posible. NOTA: ASW se prepara d...

<ol>
	<li>Lecl&#232;re, L., R&#246;ttinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+cnidarian+muscles:+Function,+anatomy,+development+and+regeneration.">Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157 (2017).</li><li>Bosch, T. C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Back+to+the+basics:+Cnidarians+start+to+fire.">Back to the basics: Cnidarians start to fire.</a> Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).</li><li>Gold, D. A., Jacobs, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+dynamics+in+Cnidaria:+Are+there+unifying+principles.">Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles.</a> Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).</li><li>Technau, U., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+Cnidaria.">Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria.</a> Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).</li><li>Lecl&#232;re, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternally+localized+germ+plasm+mRNAs+and+germ+cell/stem+cell+formation+in+the+cnidarian+Clytia.">Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia.</a> Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).</li><li>Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanisms+underlie+oral+vs+aboral+regeneration+in+the+cnidarian+Hydractinia+echinata.">Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata.</a> eLife. 4, 05506 (2015).</li><li>Sinigaglia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+regulation+in+a+regenerating+jellyfish.">Pattern regulation in a regenerating jellyfish.</a> eLife. 9, 54868 (2020).</li><li>David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+stem+cells+in+Hydra:+Multipotency+and+decision-making.">Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making.</a> The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).</li><li>R&#246;ttinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nematostella+vectensis,+an+emerging+model+for+deciphering+the+molecular+and+cellular+mechanisms+underlying+whole-body+regeneration.">Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration.</a> Cells. 10 (10), 2692 (2021).</li><li>Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clytia+hemisphaerica:+A+jellyfish+cousin+joins+the+laboratory.">Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory.</a> Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).</li><li>Peron, S., Houliston, E., Lecl&#232;re, L., Boutet, A., Shierwater, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Marine+Jellyfish+Model,+Clytia+hemisphaerica.">The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica.</a> Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. , 129-147 (2021).</li><li>Denker, E., Manuel, M., Lecl&#232;re, L., Le Guyader, H., Rabet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+progression+of+nematogenesis+from+stem+cells+through+differentiation+stages+in+the+tentacle+bulb+of+Clytia+hemisphaerica+(Hydrozoa,+Cnidaria).">Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria).</a> Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).</li><li>Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+potential+of+jellyfish:+Cellular+mechanisms+and+molecular+insights.">Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights.</a> Genes. 12 (5), 758 (2021).</li><li>Suga, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexibly+deployed+Pax+genes+in+eye+development+at+the+early+evolution+of+animals+demonstrated+by+studies+on+a+hydrozoan+jellyfish.">Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).</li><li>Fujiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+pattern+and+morphogenesis+of+medusa+tentacles+in+the+jellyfish+Cladonema+pacificum+(Hydrozoa,+Cnidaria).">Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria).</a> Zoological Letters. 5 (12), 13 (2019).</li><li>Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+controls+body+size+growth,+tentacle+morphogenesis,+and+regeneration+in+hydrozoan+jellyfish+Cladonema+pacificum.">Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum.</a> PeerJ. 7, 7579 (2019).</li><li>Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+accumulation+of+interstitial+cells+generates+the+branched+structure+of+Cladonema+medusa+tentacles.">Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles.</a> Development. 148 (23), (2021).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Angerer, L. M., Angerer, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+poly+A+++RNA+in+sea+urchin+eggs+and+embryos+by+quantitative+in+situ+hybridization.">Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization.</a> Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).</li><li>Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+in+organotypic+cerebellar+slice+cultures.">Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60353 (2019).</li><li>Tanaka, E. M., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+for+animal+regeneration.">The cellular basis for animal regeneration.</a> Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).</li><li>Penzo-M&#233;ndez, A. I., Stanger, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-size+regulation+in+mammals.">Organ-size regulation in mammals.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240 (2015).</li><li>Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Lecl&#232;re, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+safer,+urea-based+in+situ+hybridization+method+improves+detection+of+gene+expression+in+diverse+animal+species.">A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species.</a> Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).</li><li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Developmental Biology. 13 (1), 8 (2013).</li><li>Flici, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+SoxB-Hdac2+crosstalk+regulates+neurogenesis+in+a+cnidarian.">An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian.</a> Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+axial+Hox+code+controls+tissue+segmentation+and+body+patterning+in+Nematostella+vectensis.">An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis.</a> Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).</li><li>Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow-cycling+stem+cells+in+hydra+contribute+to+head+regeneration.">Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration.</a> Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).</li><li>Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+is+necessary+for+the+regeneration+of+oral+structures+in+the+anthozoan+cnidarian+Nematostella+vectensis.">Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis.</a> BMC Developmental Biology. 12 (1), 34 (2012).</li><li>Gold, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+developmental+disparity+in+the+tentacles+of+the+moon+jellyfish+Aurelia+sp.1.">Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1.</a> PLoS One. 10 (8), 0134741 (2015).</li><li>Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+tracking+supports+secondary+gastrulation+in+the+moon+jellyfish+Aurelia.">Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia.</a> Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).</li><li>Cheng, L. -. C., Alvarado, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+BrdU+staining+with+fluorescence+in+situ+hybridization+in+planarians.">Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians.</a> Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).</li></ol>

Las células proliferantes y las células madre son fuentes celulares importantes en diversos procesos como la morfogénesis, el crecimiento y la regeneración21,22. Este artículo describe un método para teñir conjuntamente el marcador de células madre Nanos1 mediante el etiquetado de FISH y EdU en Cladonema medusae. Trabajos previos utilizando el etiquetado de EdU o BrdU han sugerido que las células proliferativas se localizan en los bulbo...

Cnidaria es considerado un filo metazoario de ramificación basal que contiene animales con nervios y músculos, colocándolos en una posición única para comprender la evolución del desarrollo y la fisiología animal 1,2. Los cnidarios se clasifican en dos grupos principales: los antholozoos (por ejemplo, las anémonas de mar y los corales) poseen solo larvas de planula y etapas de pólipos sésiles, mientras que los medusozoos (miembros de hidrozoos, estaurozoos, esciphozoa y cubozoa) generalmente toman la forma de medusas o medusas que nadan libremente, así como larvas y pólipos de plánula. Los cnidarios comúnmente exhiben una alta capacidad regenerativa, y sus mecanismos celulares subyacentes, particularmente su posesión de células madre adultas y células proliferativas, han atraído mucha atención 3,4. Inicialmente identificadas en Hydra, las células madre hidrozoarias se encuentran en los espacios intersticiales entre las células epiteliales ectodérmicas y se conocen comúnmente como células intersticiales o células i3.
Las células i hidrozoarias comparten características comunes que incluyen multipotencia, la expresión de marcadores de células madre ampliamente conservados (por ejemplo, Nanos, Piwi, Vasa) y potencial de migración 3,5,6,7,8. Como células madre funcionales, las células i están ampliamente involucradas en el desarrollo, fisiología y respuestas ambientales de los animales hidrozoarios, lo que atestigua su alta capacidad regenerativa y plasticidad3. Si bien las células madre, similares a las células i, no se han identificado fuera de los hidrozoos, incluso en la especie modelo establecida Nematostella, las células proliferativas todavía están involucradas en el mantenimiento y la regeneración del tejido somático, así como en la línea germinal9. Como los estudios sobre el desarrollo y la regeneración del cnidario se han realizado predominantemente en animales de tipo pólipo como Hydra, Hydractinia y Nematostella, la dinámica celular y las funciones de las células madre en especies de medusas siguen sin abordarse en gran medida.
La medusa hidrozoaria Clytia hemisphaerica , una especie de medusa cosmopolita con diferentes hábitats en todo el mundo, incluyendo el Mar Mediterráneo y América del Norte, ha sido utilizada como animal modelo experimental en varios estudios de desarrollo y evolución10. Con su pequeño tamaño, fácil manejo y huevos grandes, Clytia es adecuado para el mantenimiento en laboratorio, así como para la introducción de herramientas genéticas como los métodos de transgénesis y knockout recientemente establecidos11, abriendo la oportunidad para un análisis detallado de los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a la biología de las medusas. En el tentáculo de Clytia medusa, las células I se localizan en la región proximal, llamada bulbo, y los progenitores como los nematoblastos migran a la punta distal mientras se diferencian en distintos tipos de células, incluidos los nematocitos12.
Durante la regeneración del Clytia manubrium, el órgano oral de las medusas, las células Nanos1+ i que están presentes en las gónadas migran a la región donde se pierde el manubrio en respuesta al daño y participan en la regeneración del manubrio7. Estos hallazgos apoyan la idea de que las células I en Clytia también se comportan como células madre funcionales que están involucradas en la morfogénesis y la regeneración. Sin embargo, dado que las propiedades de las células i difieren entre animales representativos de tipo pólipo como Hydra e Hydractinia3, es posible que las características y funciones de las células madre se diversifiquen entre las especies de medusas. Además, con la excepción de Clytia, las técnicas experimentales han sido limitadas para otras medusas, y la dinámica detallada de las células proliferativas y las células madre son desconocidas13.
La medusa hidrozoaria Cladonema pacificum es un organismo modelo emergente que se puede mantener en un entorno de laboratorio sin una bomba de agua o sistema de filtración. El Cladonema medusa tiene tentáculos ramificados, una característica común en la familia Cladonematidae, y un órgano fotorreceptor llamado ocelo en la capa ectodérmica cerca del bulbo14. El proceso de ramificación del tentáculo ocurre en un nuevo sitio de ramificación que aparece a lo largo del lado adaxial del tentáculo. Con el tiempo, los tentáculos continúan alargando y ramificándose, con las ramas más viejas empujadas hacia la punta15. Además, los tentáculos de Cladonema pueden regenerarse en unos pocos días después de la amputación. Estudios recientes han sugerido el papel de las células proliferantes y las células madre en la ramificación y regeneración de tentáculos en Cladonema16,17. Sin embargo, mientras que la hibridación in situ convencional (ISH) se ha utilizado para visualizar la expresión génica en Cladonema, debido a su baja resolución, actualmente es difícil observar la dinámica de las células madre a nivel celular en detalle.
Este artículo describe un método para visualizar células madre en Cladonema por FISH y co-tinción con EdU, un marcador de proliferación celular18. Visualizamos el patrón de expresión de Nanos1, un marcador de células madre 5,17, por FISH, que permite la identificación de la distribución de células madre a nivel de una sola célula. Además, la co-tinción de la expresión de Nanos1 con el etiquetado de EdU permite distinguir células similares a las células madre que proliferan activamente. Este método para monitorear tanto las células madre como las células proliferativas se puede aplicar a una amplia gama de áreas de investigación, incluida la ramificación de tentáculos, la homeostasis tisular y la regeneración de órganos en Cladonema, y se puede aplicar un enfoque similar a otras especies de medusas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>137-06862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.1 mL transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>233-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>029-15043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DIG-POD</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11207733910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cladonema pacificum Nanos1 forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC 
			GA-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cladonema pacificum Piwi forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA 
			AGGC -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cladonema pacificum Piwi reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA 
			CTGGC -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>C10337</td>
			<td>EdU kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coroline off</td>
			<td>GEX Co. ltd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>chlorine neutralizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11175041910</td>
			<td>blocking buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG RNA labeling mix&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11277073910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P117B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECOS competent cell DH5&#945;</td>
			<td>NIPPON GENE</td>
			<td>316-06233</td>
			<td>competent cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast gene Gel/PCR Extraction kit</td>
			<td>Fast gene</td>
			<td>FG-91302</td>
			<td>gel extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast gene plasmid mini kit</td>
			<td>Fast gene</td>
			<td>FG-90502</td>
			<td>plasmid miniprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Wako&#160;</td>
			<td>068-00426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH&#160;</td>
			<td>H3393-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>096-05143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700-025</td>
			<td>agar plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12780-052</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>134-00495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mini Quick spin RNA columns</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814427001</td>
			<td>clean-up column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako&#160;</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONEC-W</td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20)</td>
			<td>Wako&#160;</td>
			<td>166-21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerMasher 2</td>
			<td>nippi&#160;</td>
			<td>891300</td>
			<td>homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Nacarai Tesque&#160;</td>
			<td>29442-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>74004</td>
			<td>total RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 RNase-Free Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T9172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEA LIFE</td>
			<td>Marin Tech</td>
			<td>N/A</td>
			<td>mixture of mineral salts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 RNA polymerase&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11031163001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10881767001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAITEC HB-100</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0040534-000</td>
			<td>Hybridization incuvator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa Ex Taq&#160;</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR001A</td>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>6210A</td>
			<td>cDNA synthesis kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Clone</td>
			<td>TOYOBO&#160;</td>
			<td>TAK101</td>
			<td>pTA2 Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA Plus Cyanine 5</td>
			<td>AKOYA Biosciences</td>
			<td>NEL745001KT</td>
			<td>tyramide signal amplification (TSA) technique</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>laser scanning confocal microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent in situ hybridization and 5-ethynyl-2'-deoxyuridine labeling for stem-like cells in the hydrozoan jellyfish cladonema pacificum

Los cnidarios, incluidas las anémonas de mar, los corales y las medusas, exhiben una morfología y estilos de vida diversos que se manifiestan en pólipos sésiles y medusas que nadan libremente. Como se ejemplifica en modelos establecidos como Hydra y Nematostella, las células madre y / o células proliferativas contribuyen al desarrollo y regeneración de pólipos cnidarios. Sin embargo, los mecanismos celulares subyacentes en la mayoría de las medusas, particularmente en la etapa de medusa, son en gran medida poco claros y, por lo tanto, es fundamental desarrollar un método sólido para identificar tipos de células específicas. Este artículo describe un protocolo para visualizar células proliferantes similares a tallos en la medusa hidrozoaria Cladonema pacificum. Cladonema medusae posee tentáculos ramificados que crecen continuamente y mantienen la capacidad regenerativa a lo largo de su etapa adulta, proporcionando una plataforma única con la que estudiar los mecanismos celulares orquestados por la proliferación y / o células madre. La hibridación in situ fluorescente de montaje completo (FISH) utilizando un marcador de células madre permite la detección de células madre, mientras que el marcado de pulsos con 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), un marcador de fase S, permite la identificación de células en proliferación. Combinando el etiquetado de FISH y EdU, podemos detectar células madre que proliferan activamente en animales fijos, y esta técnica se puede aplicar ampliamente a otros animales, incluidas las especies de medusas no modelo.

Los tentáculos de Cladonema se han utilizado como modelo para estudiar los procesos celulares de morfogénesis y regeneración15,16,17. La estructura del tentáculo está compuesta por un tubo epitelial donde las células madre, o células i, se encuentran en la región proximal, llamada bulbo del tentáculo, y se agregan nuevas ramas secuencialmente a la parte posterior de la región distal del bulbo a lo largo del la...

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Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Aquí, describimos un protocolo para visualizar células proliferantes similares a tallos en la medusa Cladonema. La hibridación in situ fluorescente de montaje completo con un marcador de células madre permite la detección de células madre, y el etiquetado de 5-etinil-2'-desoxiuridina permite la identificación de células en proliferación. Juntas, se pueden detectar células similares a la proliferación activa.

Hibridación fluorescente in situ y etiquetado de 5-etinil-2'-desoxiuridina para células madre en la medusa hidrozoaria Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and ...

La tinción conjunta de la expresión de Nanos1 con el etiquetado de EdU permite distinguir células similares a las células madre que proliferan activamente. Podemos identificar la distribución de células madre a nivel de una sola célula en la medusa Cladonema. Podemos visualizar células madre y células proliferantes en la misma muestra de medusas, lo que permite la detección de células madre proliferantes y no proliferantes, lo que lleva a la comprensión de la heterogeneidad de las células madre.Estudios de biología del desarrollo y regeneración utilizando modelos animales que incluyen células madre. La medusa hidrozoaria Cladonema pacificum es un organismo modelo emergente que se puede mantener en un entorno de laboratorio sin ningún sistema especializado. Cladonema medusae tiene tentáculos ramificados.La ramificación ocurre en un nuevo sitio a lo largo del lado adaxial del tentáculo. Con el tiempo, los tentáculos continúan alargando y ramificándose, y las ramas más viejas son empujadas hacia la punta. Los tentáculos también pueden regenerarse a los pocos días de la amputación.El pequeño tamaño, el fácil manejo y la presencia de células madre adultas o células madre hacen de Cladonema un buen sistema para investigar el papel de las células madre en diferentes procesos. Para comenzar, coloque Cladonema medusae en tubos de 1,5 mililitros utilizando una pipeta de transferencia de 3,5 mililitros y agregue ASW hasta un volumen total de 500 microlitros. Añadir 7,5 microlitros de solución madre de EdU 10 milimolares e incubar las muestras durante una hora a 22 grados centígrados.Espere una hora y retire la mayor cantidad posible de ASW que contenga EdU. Después de anestesiar las medusas, incubar durante cinco minutos. Arregle las medusas durante la noche a cuatro grados centígrados con 4% de paraformaldehído en ASW.Para el tratamiento con proteinasa y post-fijación, retire el paraformaldehído y lave las muestras con PBS que contiene 0,1% Tween 20 tres veces durante 10 minutos cada una. Elimine el PBST y agregue el búfer de hibridación. Incubar las muestras en el tampón de hibridación durante 15 minutos a temperatura ambiente.Retire el búfer de hibridación y agregue el búfer de hibridación nuevo. Prehibridar a 55 grados centígrados durante al menos dos horas en una incubadora de hibridación. Retire el tampón de hibridación e incube con el tampón de hibridación que contiene las sondas.Hibridar a 55 grados centígrados durante 18 a 24 horas en una incubadora de hibridación. A continuación, proceda con la extracción de la sonda. Comience con la eliminación del tampón de hibridación que contiene sondas y luego agregue el tampón de lavado uno.Lave las muestras con tampón de lavado dos veces durante 15 minutos a 55 grados centígrados. Retire el tampón de lavado uno y agregue el tampón de lavado dos. Lave las muestras con tampón de lavado dos veces durante 15 minutos a 55 grados centígrados.Retire el tampón de lavado dos y luego agregue 2X SSC. Lave las muestras con 2X SSC dos veces durante 15 minutos a 55 grados centígrados. Elimine 2X SSC y luego agregue PBST precalentado.Lave las muestras durante 15 minutos con PBST a temperatura ambiente. Para la incubación de anticuerpos anti-DIG, comience por eliminar PBST y luego agregue un tampón de bloqueo del 1%. Incubar las muestras durante al menos una hora a temperatura ambiente mientras agita lentamente un balancín.Después del bloqueo, elimine el búfer de bloqueo del 1%. Agregue la solución anti-DIG-POD e incube las muestras durante la noche a cuatro grados centígrados. Para detectar la sonda marcada con DIG, retire la solución anti-DIG-POD y agregue tampón Tween de cloruro de sodio trisódico.Lave las muestras con tampón Tween de cloruro de sodio tris tres veces durante 10 minutos a temperatura ambiente. Diluir la solución madre de tiramida conjugada con colorante fluorescente en el tampón diluyente de amplificación para producir la solución activa de tiramida Cy5. Retire la mayor cantidad posible de tampón Tween de cloruro de sodio de tris y, a continuación, agregue la solución activa de tiramida Cy5.Incubar las muestras durante 10 minutos en la oscuridad. Lave las muestras con PBST tres veces durante 10 minutos en la oscuridad. Para preparar el cóctel de detección EdU, mezcle los componentes.Elimine PBST y luego agregue el cóctel de detección EdU. Incubar la muestra en la oscuridad durante 30 minutos. Lavar con PBST tres veces durante 10 minutos en la oscuridad.Para la tinción de ADN, diluir Hoechst en PBST para preparar la solución de Hoechst. Quite el PBST y, a continuación, agregue la solución Hoechst. Incubar las muestras durante 30 minutos en la oscuridad.Lave las muestras con PBST de tres a cuatro veces durante 10 minutos en la oscuridad. A continuación, para el montaje, transfiera las medusas al banco en el vidrio deslizante usando una pipeta de transferencia con la punta cortada. Coloque suavemente un cubreobjetos sobre las medusas con pinzas y selle el costado del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.El etiquetado conjunto de la expresión de Nanos1 y las células positivas de EdU reveló el patrón espacial de células madre y células proliferativas en el tentáculo. Las células positivas para EdU se distribuyeron más ampliamente por todo el bulbo del tentáculo, mientras que las células positivas para Nanos1 se acumularon más localmente en el bulbo del tentáculo y el nuevo sitio de ramificación, lo que sugiere que se detectan distintas distribuciones de células madre y células proliferantes dependiendo del momento del desarrollo y las diferentes etapas. El etiquetado conjunto de EdU y Nanos1 se observó en el 19,79% de las células, lo que sugiere que estas células son una población de células madre que prolifera activamente.Curiosamente, se encontró que el 14,46% de las células eran Nanos1 negativas para EdU en el medio del bulbo y en el nuevo sitio de ramificación, lo que sugiere la presencia de células proliferativas no similares al tallo. En contraste, se observó que el 26,32% de las células eran Nanos1 positivas para EdU negativas en la base del bulbo y en el nuevo sitio de ramificación, lo que indica la presencia de una población de células madre que es de ciclo lento o inactiva, ninguna de las cuales se detecta mediante el etiquetado del pulso de EdU. El etiquetado de pulsos EdU con un tiempo de incubación corto permite la detección de solo células proliferativas entre células madre y células no similares a las células madre.Al cambiar el tiempo de incubación de EdU y combinar experimentos de persecución a largo plazo, se pueden marcar células madre de ciclo lento u otros tipos de células, incluidas la progenie y las células diferenciadas.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

La comprensión temprana Organogenesis Usando una simplificado<em&gt; In Situ</em&gt; Protocolo de hibridación en<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos

Aplicación del ADN específico de la mancha verde de metilo en el etiquetado fluorescente de embriones

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-objetivo Cromogénico Todo el montaje<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación para comparar dominios de expresión génica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Aplicación de RNAi y expresión del Factor de transcripción inducida por choque térmico para reprogramar las células de germen para las neuronas en C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount hibridación In Situ de embriones de Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

En la generación de Vitro del Somite derivados humanos inducida por células madre pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Genotipado y cuantificación de la tinción de hibridación in situ en el pez cebra

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Hibridación en situ de montaje completo en embriones de pez cebra y ensayo de formación de tubos en iPSC-CE para estudiar el papel de la endoglina en el desarrollo vascular

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...