Name: fluorescent in situ hybridization and 5-ethynyl-2'-deoxyuridine labeling for stem-like cells in the hydrozoan jellyfish cladonema pacificum
Uploaded: 2022-08-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum at JoVE.com

Detta arbete stöddes av AMED under bidragsnummer JP22gm6110025 (till Y.N.) och av JSPS KAKENHI Grant Number 22H02762 (till Y.N.).

OBS: Se materialförteckningen för detaljer relaterade till alla material, reagenser och utrustning som används i detta protokoll.
1. Sondsyntes
<ol><li>RNA-extraktion<ol><li>Placera tre levande Cladonema medusae som odlas i konstgjort havsvatten (ASW) i ett 1,5 ml rör med en 3,1 ml överföringspipett med spetsen avskuren och ta bort så mycket ASW som möjligt. OBS: ASW framställs genom att lösa en blandning av mineralsalter i kranvatten m...

<ol>
	<li>Lecl&#232;re, L., R&#246;ttinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+cnidarian+muscles:+Function,+anatomy,+development+and+regeneration.">Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157 (2017).</li><li>Bosch, T. C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Back+to+the+basics:+Cnidarians+start+to+fire.">Back to the basics: Cnidarians start to fire.</a> Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).</li><li>Gold, D. A., Jacobs, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+dynamics+in+Cnidaria:+Are+there+unifying+principles.">Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles.</a> Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).</li><li>Technau, U., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+Cnidaria.">Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria.</a> Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).</li><li>Lecl&#232;re, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternally+localized+germ+plasm+mRNAs+and+germ+cell/stem+cell+formation+in+the+cnidarian+Clytia.">Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia.</a> Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).</li><li>Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanisms+underlie+oral+vs+aboral+regeneration+in+the+cnidarian+Hydractinia+echinata.">Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata.</a> eLife. 4, 05506 (2015).</li><li>Sinigaglia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+regulation+in+a+regenerating+jellyfish.">Pattern regulation in a regenerating jellyfish.</a> eLife. 9, 54868 (2020).</li><li>David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+stem+cells+in+Hydra:+Multipotency+and+decision-making.">Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making.</a> The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).</li><li>R&#246;ttinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nematostella+vectensis,+an+emerging+model+for+deciphering+the+molecular+and+cellular+mechanisms+underlying+whole-body+regeneration.">Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration.</a> Cells. 10 (10), 2692 (2021).</li><li>Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clytia+hemisphaerica:+A+jellyfish+cousin+joins+the+laboratory.">Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory.</a> Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).</li><li>Peron, S., Houliston, E., Lecl&#232;re, L., Boutet, A., Shierwater, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Marine+Jellyfish+Model,+Clytia+hemisphaerica.">The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica.</a> Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. , 129-147 (2021).</li><li>Denker, E., Manuel, M., Lecl&#232;re, L., Le Guyader, H., Rabet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+progression+of+nematogenesis+from+stem+cells+through+differentiation+stages+in+the+tentacle+bulb+of+Clytia+hemisphaerica+(Hydrozoa,+Cnidaria).">Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria).</a> Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).</li><li>Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+potential+of+jellyfish:+Cellular+mechanisms+and+molecular+insights.">Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights.</a> Genes. 12 (5), 758 (2021).</li><li>Suga, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexibly+deployed+Pax+genes+in+eye+development+at+the+early+evolution+of+animals+demonstrated+by+studies+on+a+hydrozoan+jellyfish.">Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).</li><li>Fujiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+pattern+and+morphogenesis+of+medusa+tentacles+in+the+jellyfish+Cladonema+pacificum+(Hydrozoa,+Cnidaria).">Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria).</a> Zoological Letters. 5 (12), 13 (2019).</li><li>Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+controls+body+size+growth,+tentacle+morphogenesis,+and+regeneration+in+hydrozoan+jellyfish+Cladonema+pacificum.">Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum.</a> PeerJ. 7, 7579 (2019).</li><li>Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+accumulation+of+interstitial+cells+generates+the+branched+structure+of+Cladonema+medusa+tentacles.">Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles.</a> Development. 148 (23), (2021).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Angerer, L. M., Angerer, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+poly+A+++RNA+in+sea+urchin+eggs+and+embryos+by+quantitative+in+situ+hybridization.">Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization.</a> Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).</li><li>Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+in+organotypic+cerebellar+slice+cultures.">Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60353 (2019).</li><li>Tanaka, E. M., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+for+animal+regeneration.">The cellular basis for animal regeneration.</a> Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).</li><li>Penzo-M&#233;ndez, A. I., Stanger, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-size+regulation+in+mammals.">Organ-size regulation in mammals.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240 (2015).</li><li>Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Lecl&#232;re, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+safer,+urea-based+in+situ+hybridization+method+improves+detection+of+gene+expression+in+diverse+animal+species.">A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species.</a> Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).</li><li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Developmental Biology. 13 (1), 8 (2013).</li><li>Flici, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+SoxB-Hdac2+crosstalk+regulates+neurogenesis+in+a+cnidarian.">An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian.</a> Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+axial+Hox+code+controls+tissue+segmentation+and+body+patterning+in+Nematostella+vectensis.">An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis.</a> Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).</li><li>Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow-cycling+stem+cells+in+hydra+contribute+to+head+regeneration.">Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration.</a> Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).</li><li>Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+is+necessary+for+the+regeneration+of+oral+structures+in+the+anthozoan+cnidarian+Nematostella+vectensis.">Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis.</a> BMC Developmental Biology. 12 (1), 34 (2012).</li><li>Gold, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+developmental+disparity+in+the+tentacles+of+the+moon+jellyfish+Aurelia+sp.1.">Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1.</a> PLoS One. 10 (8), 0134741 (2015).</li><li>Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+tracking+supports+secondary+gastrulation+in+the+moon+jellyfish+Aurelia.">Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia.</a> Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).</li><li>Cheng, L. -. C., Alvarado, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+BrdU+staining+with+fluorescence+in+situ+hybridization+in+planarians.">Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians.</a> Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).</li></ol>

Prolifererande celler och stamceller är viktiga cellulära källor i olika processer såsom morfogenes, tillväxt och regenerering21,22. Denna artikel beskriver en metod för att samfärga stamcellsmarkören Nanos1 med FISH och EdU-märkning i Cladonema medusae. Tidigare arbete med EdU- eller BrdU-märkning har föreslagit att proliferativa celler lokaliseras till tentakellökarna16,17,...

Cnidaria anses vara en basalt förgrenande metazoisk fylum som innehåller djur med nerver och muskler, vilket placerar dem i en unik position för att förstå utvecklingen av djurutveckling och fysiologi 1,2. Cnidarians kategoriseras i två huvudgrupper: Anthozoa (t.ex. havsanemoner och koraller) har endast planulalarver och sessila polypstadier, medan Medusozoa (medlemmar av Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa och Cubozoa) vanligtvis har formen av frisimmande medusae eller maneter, liksom planula larver och polyper. Cnidarians uppvisar vanligtvis hög regenerativ kapacitet, och deras underliggande cellulära mekanismer, särskilt deras innehav av vuxna stamceller och proliferativa celler, har väckt stor uppmärksamhet 3,4. Ursprungligen identifierade i Hydra är hydrozoa stamceller belägna i de interstitiella utrymmena mellan ektodermala epitelceller och kallas vanligtvis interstitiella celler eller i-celler3.
Hydrozoa i-celler delar gemensamma egenskaper som inkluderar multipotens, uttryck av allmänt bevarade stamcellsmarkörer (t.ex. Nanos, Piwi, Vasa) och migrationspotential 3,5,6,7,8. Som funktionella stamceller är i-celler i stor utsträckning involverade i utveckling, fysiologi och miljörespons hos hydrozoa djur, vilket vittnar om deras höga regenerativa kapacitet och plasticitet3. Medan stamceller, som liknar i-celler, inte har identifierats utanför hydrozoer, även i den etablerade modellarten Nematostella, är proliferativa celler fortfarande involverade i underhåll och regenerering av somatisk vävnad, liksom bakterielinjen9. Eftersom studier i cnidarisk utveckling och regenerering huvudsakligen har utförts på polyp-typ djur som Hydra, Hydractinia och Nematostella, förblir den cellulära dynamiken och funktionerna hos stamceller i manetarter i stort sett oadresserade.
Den hydrozoiska maneten Clytia hemisphaerica , en kosmopolitisk manetart med olika livsmiljöer runt om i världen, inklusive Medelhavet och Nordamerika, har använts som ett experimentellt modelldjur i flera utvecklings- och evolutionära studier10. Med sin lilla storlek, enkla hantering och stora ägg är Clytia lämplig för laboratorieunderhåll, liksom för introduktion av genetiska verktyg som de nyligen etablerade transgenes- och knockoutmetoderna11, vilket öppnar möjligheten för detaljerad analys av de cellulära och molekylära mekanismerna som ligger till grund för manetbiologi. I Clytia medusa-tentakeln är i-celler lokaliserade i den proximala regionen, kallad glödlampan, och förfäder som nematoblaster migrerar till den distala spetsen medan de differentieras till distinkta celltyper, inklusive nematocyter12.
Under regenerering av Clytia manubrium migrerar det orala organet av maneter, Nanos1+ i-celler som finns i gonaderna till regionen där manubriet går förlorat som svar på skador och deltar i regenereringen av manubrium7. Dessa fynd stöder tanken att i-celler i Clytia också beter sig som funktionella stamceller som är involverade i morfogenes och regenerering. Med tanke på att egenskaperna hos i-celler skiljer sig åt bland representativa polyp-typ djur såsom Hydra och Hydractinia3, är det möjligt att stamcellernas egenskaper och funktioner är diversifierade bland manetarter. Dessutom, med undantag för Clytia, har experimentella tekniker begränsats för andra maneter, och den detaljerade dynamiken hos proliferativa celler och stamceller är okänd13.
Den hydrozoa maneten Cladonema pacificum är en framväxande modellorganism som kan hållas i laboratoriemiljö utan vattenpump eller filtreringssystem. Cladonema medusa har grenade tentakler, en vanlig egenskap i familjen Cladonematidae, och ett fotoreceptororgan som kallas ocellus på det ektodermala skiktet nära glödlampan14. Tentakelförgreningsprocessen sker vid en ny förgreningsplats som visas längs tentakelns adaxiala sida. Med tiden fortsätter tentaklerna att förlängas och förgrena sig, med de äldre grenarna som skjuts ut mot spetsen15. Dessutom kan Cladonema-tentakler regenerera inom några dagar vid amputation. Nya studier har föreslagit rollen av prolifererande celler och stamliknande celler i tentakelförgrening och regenerering i Cladonema16,17. Men medan konventionell in situ-hybridisering (ISH) har använts för att visualisera genuttryck i Cladonema, på grund av dess låga upplösning, är det för närvarande svårt att observera stamcellsdynamik på cellnivå i detalj.
Denna artikel beskriver en metod för att visualisera stamliknande celler i Cladonema av FISH och samfärgning med EdU, en markör för cellproliferation18. Vi visualiserar uttrycksmönstret för Nanos1, en stamcellsmarkör 5,17, av FISH, vilket möjliggör identifiering av stamliknande cellfördelning på encellsnivå. Dessutom gör samfärgningen av Nanos1-uttryck med EdU-märkning det möjligt att skilja aktivt prolifererande stamliknande celler. Denna metod för övervakning av både stamliknande celler och proliferativa celler kan tillämpas på ett brett spektrum av undersökningsområden, inklusive tentakelförgrening, vävnadshomeostas och organregenerering i Cladonema, och ett liknande tillvägagångssätt kan tillämpas på andra manetarter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>137-06862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.1 mL transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>233-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>029-15043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DIG-POD</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11207733910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cladonema pacificum Nanos1 forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC 
			GA-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cladonema pacificum Piwi forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA 
			AGGC -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cladonema pacificum Piwi reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA 
			CTGGC -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>C10337</td>
			<td>EdU kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coroline off</td>
			<td>GEX Co. ltd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>chlorine neutralizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11175041910</td>
			<td>blocking buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG RNA labeling mix&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11277073910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P117B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECOS competent cell DH5&#945;</td>
			<td>NIPPON GENE</td>
			<td>316-06233</td>
			<td>competent cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast gene Gel/PCR Extraction kit</td>
			<td>Fast gene</td>
			<td>FG-91302</td>
			<td>gel extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast gene plasmid mini kit</td>
			<td>Fast gene</td>
			<td>FG-90502</td>
			<td>plasmid miniprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Wako&#160;</td>
			<td>068-00426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH&#160;</td>
			<td>H3393-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>096-05143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700-025</td>
			<td>agar plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12780-052</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>134-00495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mini Quick spin RNA columns</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814427001</td>
			<td>clean-up column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako&#160;</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONEC-W</td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20)</td>
			<td>Wako&#160;</td>
			<td>166-21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerMasher 2</td>
			<td>nippi&#160;</td>
			<td>891300</td>
			<td>homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Nacarai Tesque&#160;</td>
			<td>29442-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>74004</td>
			<td>total RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 RNase-Free Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T9172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEA LIFE</td>
			<td>Marin Tech</td>
			<td>N/A</td>
			<td>mixture of mineral salts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 RNA polymerase&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11031163001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10881767001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAITEC HB-100</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0040534-000</td>
			<td>Hybridization incuvator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa Ex Taq&#160;</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR001A</td>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>6210A</td>
			<td>cDNA synthesis kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Clone</td>
			<td>TOYOBO&#160;</td>
			<td>TAK101</td>
			<td>pTA2 Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA Plus Cyanine 5</td>
			<td>AKOYA Biosciences</td>
			<td>NEL745001KT</td>
			<td>tyramide signal amplification (TSA) technique</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>laser scanning confocal microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent in situ hybridization and 5-ethynyl-2'-deoxyuridine labeling for stem-like cells in the hydrozoan jellyfish cladonema pacificum

Cnidarians, inklusive havsanemoner, koraller och maneter, uppvisar olika morfologi och livsstilar som manifesteras i sessila polyper och frisimmande medusae. Som exemplifieras i etablerade modeller som Hydra och Nematostella bidrar stamceller och/eller proliferativa celler till utveckling och regenerering av cnidariska polyper. De underliggande cellulära mekanismerna i de flesta maneter, särskilt i medusastadiet, är dock till stor del oklara, och därför är det viktigt att utveckla en robust metod för att identifiera specifika celltyper. Detta dokument beskriver ett protokoll för visualisering av stamliknande prolifererande celler i hydrozoan maneter Cladonema pacificum. Cladonema medusae har grenade tentakler som kontinuerligt växer och upprätthåller regenerativ kapacitet under hela sitt vuxna stadium, vilket ger en unik plattform för att studera de cellulära mekanismerna som orkestreras av prolifererande och / eller stamliknande celler. Helmonterad fluorescerande in situ-hybridisering (FISH) med hjälp av en stamcellsmarkör möjliggör detektering av stamliknande celler, medan pulsmärkning med 5-etynyl-2'-deoxiuridin (EdU), en S-fasmarkör, möjliggör identifiering av prolifererande celler. Genom att kombinera både FISH- och EdU-märkning kan vi upptäcka aktivt prolifererande stamliknande celler på fasta djur, och denna teknik kan tillämpas brett på andra djur, inklusive maneter som inte är modeller.

Cladonema tentakler har använts som modell för att studera de cellulära processerna för morfogenes och regenerering15,16,17. Tentakelstrukturen består av ett epitelrör där stamliknande celler, eller i-celler, är belägna i den proximala regionen, kallad tentakellampan, och nya grenar läggs sekventiellt till baksidan av lampans distala region längs den adaxiella sidan (figur 3A)<su...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum at JoVE.com

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Här beskriver vi ett protokoll för visualisering av stamliknande prolifererande celler i maneten Cladonema. Helmonterad fluorescerande in situ-hybridisering med en stamcellsmarkör möjliggör detektering av stamliknande celler, och 5-etynyl-2'-deoxiuridinmärkning möjliggör identifiering av prolifererande celler. Tillsammans kan aktivt prolifererande stamliknande celler detekteras.

Fluorescerande in situ-hybridisering och 5-etynyl-2'-deoxiuridinmärkning för stamliknande celler i hydrozomaneten Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and ...

Samfärgning av Nanos1-uttryck med EdU-märkning gör det möjligt att urskilja aktivt prolifererande stamliknande celler. Vi kan identifiera stamliknande cellfördelning på encellsnivå i maneten Cladonema. Vi kan visualisera stamliknande celler och prolifererande celler i samma manetprov, vilket möjliggör detektion av prolifererande och icke-prolifererande stamliknande celler, vilket leder till förståelse av stamcellsheterogenitet.Utvecklingsbiologi och regenereringsstudier med hjälp av djurmodeller som inkluderar stamceller. Den hydrozoa maneten Cladonema pacificum är en framväxande modellorganism som kan förvaras i laboratoriemiljö utan något specialiserat system. Cladonema medusae har grenade tentakler.Förgreningen sker på en ny plats längs tentakelns apostialära sida. Med tiden fortsätter tentaklerna att förlängas och förgrena sig, med äldre grenar som skjuts ut mot spetsen. Tentaklerna kan också regenerera inom några dagar efter amputation.Liten storlek, enkel hantering och närvaron av vuxna stamceller eller stamliknande celler gör Cladonema till ett bra system för att undersöka stamcellernas roll i olika processer. För att börja, placera Cladonema medusae i 1,5 ml rör med en 3,5 ml överföringspipett och tillsätt ASW upp till en total volym på 500 mikroliter. Tillsätt 7,5 mikroliter 10 millimolar EdU-stamlösning och inkubera proverna i en timme vid 22 grader Celsius.Vänta en timme och ta bort så mycket ASW som innehåller EdU som möjligt. Efter bedövning av medusae, inkubera i fem minuter. Fixa medusan över natten vid fyra grader Celsius med 4% paraformaldehyd i ASW.För proteinasbehandling och efterfixering, ta bort paraformaldehyden och tvätta proverna med PBS som innehåller 0,1% Tween 20 tre gånger i 10 minuter vardera. Ta bort PBST och lägg till hybridiseringsbufferten. Inkubera proverna i hybridiseringsbufferten i 15 minuter vid rumstemperatur.Ta bort hybridiseringsbufferten och lägg till den nya hybridiseringsbufferten. Förhybridisera vid 55 grader Celsius i minst två timmar i en hybridiseringsinkubator. Ta bort hybridiseringsbufferten och inkubera med hybridiseringsbufferten som innehåller sonderna.Hybridisera vid 55 grader Celsius i 18 till 24 timmar i en hybridiseringsinkubator. Fortsätt sedan med borttagning av sond. Börja med att ta bort hybridiseringsbufferten som innehåller sonder och lägg sedan till tvättbuffert en.Tvätta proverna med tvättbuffert två gånger i 15 minuter vid 55 grader Celsius. Ta bort tvättbuffert ett och tillsätt tvättbuffert två. Tvätta proverna med tvättbuffert två gånger i 15 minuter vid 55 grader Celsius.Ta bort tvättbuffert två och tillsätt sedan 2X SSC. Tvätta proverna med 2X SSC två gånger i 15 minuter vid 55 grader Celsius. Ta bort 2X SSC och lägg sedan till förvärmd PBST.Tvätta proverna i 15 minuter med PBST vid rumstemperatur. För anti-DIG-antikroppsinkubation, börja med att ta bort PBST och lägg sedan till 1% blockerande buffert. Inkubera proverna i minst en timme vid rumstemperatur medan du skakar långsamt på en vippa.Efter blockering, ta bort 1% blockerande buffert. Tillsätt anti-DIG-POD-lösning och inkubera proverna över natten vid fyra grader Celsius. För att upptäcka den DIG-märkta sonden, ta bort anti-DIG-POD-lösningen och tillsätt tris natriumklorid Tween-buffert.Tvätta proverna med trisnatriumklorid Tween buffert tre gånger i 10 minuter vid rumstemperatur. Späd fluorescerande färgämne konjugerad tyramid stamlösning i amplifieringsutspädningsbufferten för att göra den aktiva Cy5-tyramidlösningen. Ta bort så mycket trisnatriumklorid tweenbuffert som möjligt och tillsätt sedan den aktiva Cy5-tyramidlösningen.Inkubera proverna i 10 minuter i mörkret. Tvätta proverna med PBST tre gånger i 10 minuter i mörkret. För att förbereda EdU-detekteringscocktailen, blanda komponenterna.Ta bort PBST och lägg sedan till EdU-detekteringscocktailen. Inkubera provet i mörkret i 30 minuter. Tvätta med PBST tre gånger i 10 minuter i mörkret.För DNA-färgning, späd Hoechst i PBST för att bereda Hoechst-lösningen. Ta bort PBST och lägg sedan till Hoechst-lösningen. Inkubera proverna i 30 minuter i mörkret.Tvätta proverna med PBST tre till fyra gånger i 10 minuter i mörkret. Nästa för montering, överför medusae till banken på glidglaset med en överföringspipett med spetsen avskuren. Placera försiktigt en täckglas på medusan med pincett och försegla sidan av täckglaset med klart nagellack.Sammärkningen av Nanos1-uttryck och EdU-positiva celler avslöjade det rumsliga mönstret av stamliknande celler och proliferativa celler i tentakeln. EdU-positiva celler fördelades mer i hela tentakellampan, medan Nanos1-positiva celler ackumulerades mer lokalt vid tentakellampan och den nya förgreningsplatsen, tyder på att distinkta fördelningar av stamliknande celler och prolifererande celler detekteras beroende på utvecklingstidpunkten och olika stadier. Sammärkningen av EdU och Nanos1 observerades i 19,79% av cellerna, vilket tyder på att dessa celler är en aktivt prolifererande stamcellspopulation.Intressant nog befanns 14,46% av cellerna vara EdU-positiva Nanos1-negativa i mitten av glödlampan och på den nya förgreningsplatsen, vilket tyder på närvaron av icke-stamliknande proliferativa celler. Däremot observerades 26,32% av cellerna vara EdU-negativa Nanos1-positiva vid basen av glödlampan och vid den nya förgreningsplatsen, vilket indikerar närvaron av en stamcellspopulation som antingen är långsam cykling eller vilande, varav ingen detekteras av EdU-pulsmärkning. EdU-pulsmärkning med kort inkubationstid möjliggör detektion av endast proliferativa celler bland stamliknande celler och icke-stamliknande celler.När man ändrar inkubationstiden för EdU och kombinerar långvariga jagande experiment kan långsamma cykelstamceller eller andra celltyper inklusive avkomma och differentierade celler markeras.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Förstå Tidig Organogenesis användning av en förenklad<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering protokollet<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos

Tillämpning av DNA-specifika Stain metylgrönt i Fluorescerande märkning av embryon

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-mål Kromogent Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering för jämförelse Gene Expression domäner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion och Immunofluorescerande färgning av svamp kropp och ljusmätare nervceller i vuxen Drosophila melanogaster hjärnor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisera Multiciliated celler i zebrafisk genom en kombinerad protokoll av hela Mount fluorescerande In Situ hybridisering och immunofluorescens

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Tillämpningen av RNAi och värme-chock-inducerad transkription faktorn uttryck att omprogrammera könsceller att nervceller i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ hybridisering för Astyanax embryon

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Genotypning och kvantifiering av In Situ Hybridisering Färgning i Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Helmonterad in situ-hybridisering i Zebrafish Embryon och Tube Formation Assay i iPSC-ECs att studera rollen av Endoglin i vaskulär utveckling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...