Name: preparation of a non-cardiomyocyte cell suspension for single-cell rna sequencing from a post-myocardial infarction adult mouse heart
Uploaded: 2023-02-03T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل صناديق العلوم الطبيعية لمقاطعة تشجيانغ (LQ22H020010).

أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام المختبر في جامعة تشجيانغ وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة الاستشارية للحيوانات في جامعة تشجيانغ.
1. جراحة ربط الشريان التاجي الأمامي الأيسر (ربط LAD)
ملاحظة: تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6J البا...

<ol>
	<li>Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction.">Acute myocardial infarction.</a> Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).</li><li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incident+heart+failure+in+patients+with+coronary+artery+disease+undergoing+percutaneous+coronary+intervention.">Incident heart failure in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 727727 (2021).</li><li>Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+response+in+myocardial+injury,+repair,+and+remodelling.">The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling.</a> Nature Reviews. Cardiology. 11 (5), 255-265 (2014).</li><li>Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+revisited:+Inflammation+versus+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction.">Inflammation revisited: Inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444 (2014).</li><li>Tzahor, E., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+coalition+to+heal-the+impact+of+the+cardiac+microenvironment.">A coalition to heal-the impact of the cardiac microenvironment.</a> Science. 377 (6610), 4443 (2022).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li><li>Massaia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+gene+expression+to+understand+the+dynamic+architecture+of+the+heart.">Single cell gene expression to understand the dynamic architecture of the heart.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 167 (2018).</li><li>Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+to+explore+immune+cell+heterogeneity.">Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity.</a> Nature Reviews. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).</li><li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+reveals+the+temporal+diversity+and+dynamics+of+cardiac+immunity+after+myocardial+infarction.">Single-cell RNA sequencing reveals the temporal diversity and dynamics of cardiac immunity after myocardial infarction.</a> Small Methods. 6 (3), 2100752 (2022).</li><li>Tombor, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+sequencing+reveals+endothelial+plasticity+with+transient+mesenchymal+activation+after+myocardial+infarction.">Single cell sequencing reveals endothelial plasticity with transient mesenchymal activation after myocardial infarction.</a> Nature Communications. 12 (1), 681 (2021).</li><li>Virag, J. A., Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+artery+ligation+and+intramyocardial+injection+in+a+murine+model+of+infarction.">Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2581 (2011).</li><li>Reichard, A., Asosingh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+preparing+a+single+cell+suspension+from+solid+tissues+for+flow+cytometry.">Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2018).</li><li>Gladka, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+of+the+healthy+and+diseased+heart+reveals+cytoskeleton-associated+protein+4+as+a+new+modulator+of+fibroblasts+activation.">Single-cell sequencing of the healthy and diseased heart reveals cytoskeleton-associated protein 4 as a new modulator of fibroblasts activation.</a> Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).</li><li>Garcia-Flores, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+from+the+human+placenta.">Preparation of single-cell suspensions from the human placenta.</a> Nature Protocols. , (2022).</li><li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+of+immunolabeled+cell+types+from+adult+rat+brain.">FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).</li><li>Rheinl&#228;ndera, A., Schravenab, B., Bommhardt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD45+in+human+physiology+and+clinical+medicine.">CD45 in human physiology and clinical medicine.</a> Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).</li><li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+to+dissect+the+immunological+network+of+autoimmune+myocarditis.">Single-cell RNA sequencing to dissect the immunological network of autoimmune myocarditis.</a> Circulation. 142 (4), 384-400 (2020).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14, 935-936 (2017).</li></ol>

تهدف هذه المقالة إلى وصف بروتوكول لعزل الخلايا العضلية غير القلبية المفردة من قلوب الفئران بعد MI. يمكن تطبيق البروتوكول لعزل أنواع مختلفة من الخلايا في البيئة المكروية بعد MI بجودة عالية ، بما في ذلك الخلايا المناعية والخلايا البطانية والخلايا الليفية. هناك ثلاثة عوامل أساسية حاسمة للحصو?...

احتشاء عضلة القلب (MI) هو واحد من أكثر أمراض القلب والأوعية الدموية شيوعا ، ويزداد معدل الوفيات في جميع أنحاء العالم1. يحدث MI بسبب عدم كفاية إمدادات الدم إلى عضلة القلب المحيطة ، والتي يمكن أن تكون نتيجة لانسداد الشريان التاجي الذي يحدث مع تمزق لوحة تصلب الشرايين. على الرغم من أن التدخل التاجي عن طريق الجلد (PCI) قد قلل من معدلات وفيات مرضى MI الحاد ، إلا أن ارتفاع معدل انتشار قصور القلب بعد MI لا يزال يمثلمشكلة 2. الفيزيولوجيا المرضية الرئيسية الكامنة وراء قصور القلب بعد MI هي استجابة الجسم التعويضية لإصابات القلب ، والتي تنطوي على استبدال عضلة القلب الميتة بندوب ليفية غير مقلصة. تعتمد هذه الاستجابات التكيفية بشكل كبير على الالتهاب الموضعي بوساطة التفاعلات بين أنواع الخلايا المتعددة وخلايا أنسجة القلب ، ويعتبر هذا الالتهاب الآن هدفا علاجيا محتملا لتقليل تكوين الندبة الليفية ، وبالتالي الحماية من قصور القلب بعد MI 3,4. ومن المثير للاهتمام أن البيئة المكروية في موقع الاحتشاء تشهد انتقالا يعتمد على الوقت في أنواع الخلايا المتسللة ووظائفها في مراحل مختلفة من MI 1,5. أظهرت العديد من الدراسات أن الخلايا غير القلبية (مثل الخلايا المناعية والخلايا الليفية والخلايا البطانية) تلعب أدوارا مركزية في التهاب ما بعد MI وإصلاح الأنسجة 5,6. في السنوات الأخيرة ، تم استخدام تسلسل الخلية الواحدة على نطاق واسع كأداة قوية لتوضيح مشاركات ووظائف الخلايا العضلية غير القلبية في البيئة الدقيقة بعد MI 7,8. يوفر هذا نظرة ثاقبة على الفيزيولوجيا المرضية لإصابة وإصلاح ما بعد MI وتطوير العلاجات المحتملة ضد قصور القلب بعد MI.
تسلسل الحمض النووي الريبي عالي الإنتاجية (RNA-Seq) هو تقنية تستخدم لدراسة النسخ الكاملة بتفصيل كبير باستخدام تسلسل الجيل التالي (NGS) 7،8،9. في الآونة الأخيرة ، أحدث تطوير scRNA-Seq ثورة في مجال البحوث الطبية الحيوية. بالمقارنة مع التسلسل السائب التقليدي ، يحلل scRNA-Seq ملفات تعريف التعبير الجيني وعدم تجانس النسخ على مستوى الخليةالواحدة 7,8. تعزز هذه التقنية بشكل كبير البحث في الفيزيولوجيا المرضية الخلوية ل MI 9,10 من خلال تحديد أنواع الخلايا المتداولة المختلفة في البيئة المكروية بعد MI والكشف عن التفاعل بين خلايا عضلة القلب والخلايا العضلية غير القلبية. تساهم هذه النتائج أيضا في الكشف عن أهداف علاجية جديدة لفشل القلب بعد MI. بشكل عام ، تتضمن تجربة ما بعد MI القائمة على scRNA-seq ثلاثة أقسام رئيسية: (1) إنشاء نموذج حيواني بعد MI. (2) إعداد تعليق الخلية ؛ و (3) تسلسل العينات وتحليل البيانات. من الملاحظ أن تحضير تعليق الخلية هو الخطوة الأكثر أهمية في إعداد تجربة scRNA-Seq لأن جودة تعليق الخلية تحدد دقة النتائج.
تم تصميم هذا البروتوكول لاستخراج تعليق الخلايا غير القلبية من الأنسجة القلبية بعد MI. بشكل ملحوظ ، يتم تضمين التفاصيل المحددة للحفاظ على صلاحية الخلية وحلها. وفي الوقت نفسه ، يمكن العثور على المعدات المستخدمة في هذا البروتوكول ، مثل المجموعات الجراحية للفئران وأجهزة تهوية القوارض وأجهزة الطرد المركزي ، في معظم مراكز التجارب على الحيوانات والمختبرات الطبية الحيوية ، وبالتالي ، فإن تكلفة تجربة هذا البروتوكول منخفضة نسبيا. علاوة على ذلك ، إذا تم النظر في النقاط الزمنية ومواقع الاحتشاء كمتغيرات ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لمحاكاة مجموعة واسعة من السيناريوهات السريرية ، خاصة بالنسبة لمضاعفات ما بعد MI.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acridine Orange / Propidium Iodide Stain</td>
			<td>Logos biosystems</td>
			<td>F23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated&#160;Cell&#160;Counter</td>
			<td>Logos biosystems</td>
			<td>L20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G5001</td>
			<td>Cytoprotective effect</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Slides</td>
			<td>Logos biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Digestive enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693</td>
			<td>Digestive enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Prevent cell clumping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;40&#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>Remove cell clumps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;70&#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>Remove undigested tissue and clumps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor</td>
			<td>OU QING SI</td>
			<td>10054963976859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>FST</td>
			<td>12061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F14012-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic Scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S11036-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3702-120ml</td>
			<td>Remove red blood cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rib Retractor</td>
			<td>FST</td>
			<td>17005-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Ventilator</td>
			<td>Harvard</td>
			<td>730043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Solvent&#160;solution of enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Scissor</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S14014-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a non-cardiomyocyte cell suspension for single-cell rna sequencing from a post-myocardial infarction adult mouse heart

احتشاء عضلة القلب (MI) هو واحد من أكثر أمراض القلب والأوعية الدموية شيوعا ، مع زيادة معدل الوفيات في جميع أنحاء العالم. تمثل الخلايا غير القلبية أكثر من نصف إجمالي عدد خلايا القلب ، وتساهم في التعويضات التكيفية عند إصابة عضلة القلب ، بما في ذلك الاستجابات الالتهابية وإصلاح الأنسجة وتشكيل الندبات. لدراسة البيئة المكروية القلبية بعد MI ، يستخدم تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) على نطاق واسع لتحديد أنواع خلايا القلب المختلفة والاتصالات بين الخلايا. من بين إجراءات تحضير عينة scRNA-seq ، يعد تحضير تعليق الخلية أحد أهم الخطوات ، لأن صلاحية الخلية يمكن أن تؤثر على جودة نتائج scRNA-seq. لذلك ، قمنا بتصميم بروتوكول تجريبي لإعداد تعليق الخلايا غير القلبية من قلوب الفئران بعد MI مع التركيز الإضافي على تحسين صلاحية الخلية عن طريق اختيار إنزيمات هضمية خفيفة ، والتحكم في وقت الهضم ، وتطبيق فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS). أخيرا ، قمنا بعزل خلايا CD45 + من تعليق الخلايا غير القلبية التي تم الحصول عليها من خلال هذا البروتوكول ، ثم أجرينا scRNA-seq.

تم الحصول على تعليق أحادي الخلية ذو حيوية عالية من خلال تنفيذ القسم 2 من هذا البروتوكول. ومع ذلك ، لا يزال من الممكن ملاحظة شظايا الخلايا (الشكل 1 أ) ؛ ومن ثم ، تم إجراء فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) لزيادة تحسين الجودة16. بعد FACS ، ينخفض متوسط حجم الخلية من 9.6 ميكر...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart at JoVE.com

Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart

هنا ، نصف بروتوكولا لعزل كمية كافية من الخلايا العضلية غير القلبية المفردة ذات الصلاحية العالية من قلب الفأر بعد احتشاء عضلة القلب (MI). يمكن استخدام هذا لتسلسل الخلية الواحدة اللاحق ، وتحليل قياس التدفق الخلوي ، وزراعة الخلايا الأولية.

إعداد تعليق خلية غير عضلة القلب لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من قلب الفأر البالغ بعد احتشاء عضلة القلب

Myocardial infarction (MI) is one of the most common cardiovascular diseases, with increasing mortality worldwide. Non-cardiomyocytes account for more ...

يضمن بروتوكولنا كلا من صلاحية الخلية وكفاءة العزل لتعليق الخلية الواحدة بتكاليف منخفضة نسبيا. التكاليف والمتطلبات المنخفضة نسبيا لمعدات المختبرات هي المزايا الرئيسية لهذه التقنية. يكشف تسلسل الخلية المفردة عن عدم تجانس الخلايا العضلية غير القلبية في الفيزيولوجيا المرضية للقلب ، كما يوفر أفكارا للدراسات الأساسية والسريرية لأمراض القلب.يمكن استخدام هذا البروتوكول في هذه الدراسات حول بيئة القلب والأوعية الدموية بعد MI مثل مشاركة الخلايا المناعية. بالنسبة للاستعدادات لأول مرة ، أقترح إيلاء اهتمام إضافي لعينة البيبسين ووقت الهضم. بمجرد تحضير المخازن المؤقتة والمحاليل كما هو موضح في المخطوطة ، ضع فأرا تم قتله رحيما كان مصابا باحتشاء عضلة القلب قبل أسبوعين في وضع ضعيف على طاولة الجراحة.إصلاح أطرافه الخلفية باستخدام شريط لاصق. لاستئصال القلب ، رش الجسم بنسبة 70 ٪ من الإيثانول. قم بعمل شق عمودي عبر جلد البطن والعضلات مع تجنب الكبد.دون ثقب القلب ، افتح الصدر بعناية وغزير البطين الأيسر بمحلول PBS قبل التبريد حتى يصبح سائل التروية عديم اللون. باستخدام الملقط ، ارفع القلب برفق واقطع الأنسجة الزائدة المرتبطة بالخارج بمقص العيون. ضع القلب في ملليلتر واحد من PBS المبرد مسبقا في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.نقل القلب إلى بئر من 24 صفيحة بئر موضوعة على الجليد. ماصة 150 ميكرولتر من العازلة تفكك القلب في البئر ، وقطع القلب إلى قطع بحجم ملليمتر واحد باستخدام المقص. انقل أنسجة القلب المفرومة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت لتفكك الأنسجة.ضع الأنبوب في شاكر ترددي ثرموستاتي. ماصة التعليق صعودا وهبوطا 10 مرات كل 20 دقيقة. لإزالة الكتل والأنسجة غير المهضومة ، قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر باستخدام 25 ملليلتر من المخزن المؤقت لغسل الخلايا.شطف أنبوب الطرد المركزي ومصفاة الخلية. بعد ذلك ، قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر لإزالة المزيد من كتل الخلايا. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية المصفاة عند 300 × جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.أعد تعليق عينة الخلية في خمسة مجلدات من المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء واحتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. الآن ، أضف أربعة مجلدات من المخزن المؤقت لغسيل الخلايا في تعليق الخلية وأجهزة الطرد المركزي كما هو موضح سابقا. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من المخزن المؤقت لغسيل الخلايا وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.في نهاية الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت لغسيل الخلايا. خذ 18 ميكرولترا من التعليق في أنبوب طرد مركزي آخر وأضف ميكرولتر من محلول تلطيخ يوديد البروبيديوم البرتقالي الأكريدين. أضف 10 ميكرولتر من هذا المحلول الملون إلى شريحة غرفة العد.قم بتقييم أرقام الخلايا وصلاحيتها باستخدام عداد الخلايا التلقائي. لوحظت شظايا الخلايا في تعليق القلب أحادي الخلية. أدى فرز الخلايا المنشط بالتألق إلى تقليل نسبة شظايا الخلايا وتكتل الخلايا بشكل فعال مما أدى إلى انخفاض متوسط حجم الخلية.أثبت تسلسل الحمض النووي الريبي فصلا واضحا لسبعة أنواع من الخلايا المناعية كما يتضح من التجميع غير الخاضع للإشراف وتقليل تضمين الجار العشوائي الموزع على شكل حرف T. أظهرت كل خلية مناعية تعبيرا عاليا عن العلامات الكلاسيكية. يجب قطع أنسجة القلب صغيرة بما يكفي لتجنب الهضم غير المكتمل ، مما يؤدي إلى الكثير من كتل الخلايا في تعليق الخلية.يمكن تطبيق تعليق الخلية المفردة الذي تم الحصول عليه بواسطة هذا البروتوكول بشكل أكبر في تحليل تدفق ثقافة الخلية الأولية. يفيد هذا البروتوكول الدراسات على البيئة المكروية لعدوى عضلة القلب ، والتي قد تساعد الباحثين على النظر إلى ما وراء أنسجة القلب والنظر في عدوى عضلة القلب كمشكلة منهجية.

Research

JoVE Journal

Medicine

Myocardial Infarction and Functional Outcome Assessment in Pigs

احتشاء عضلة القلب وتقييم نتائج وظيفية في الخنازير

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One ...

A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion

وهناك طريقة معدلة لغيري مكاني ماوس القلب Transplantion

Mice are often used as heart transplant donors and recipients in studies of transplant immunology due to the wide range of transgenic mice and reagents ...

An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

نظام القلب العامل المعزولة لنماذج حيوانية كبيرة

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

ربط دائم في الشريان التاجي الأيسر الأمامي تنازلي في الفئران: نموذج ما بعد إعادة تشكيل عضلة القلب احتشاء وقصور القلب

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

تسلسل عميق متحيز من الحمض النووي الريبي الفيروسات من العينات السريرية

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

طريقة سيفينج فعالة لعزل Glomeruli سليمة من الفئران الكبار الكلي

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

عزل الخلايا الماية الأذينية من الفئران البالغة

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

نموذج الإصابة بالتبريد لدراسة احتشاء عضلة القلب في الماوس

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

Establishing a Swine Model of Post-myocardial Infarction Heart Failure for Stem Cell Treatment

إنشاء نموذج الخنازير من فشل القلب احتشاء ما بعد عضلة القلب لعلاج الخلايا الجذعية

Although advances have been achieved in the treatment of heart failure (HF) following myocardial infarction (MI), HF following MI remains one of the major ...

Post-Myocardial Infarction Heart Failure in Closed-chest Coronary Occlusion/Reperfusion Model in G&#246;ttingen Minipigs and Landrace Pigs

Post-Myocardial Infarction Heart Failure in Closed-chest Coronary Occlusion/Reperfusion Model in GÃƒÆ’Ã‚Â¶ttingen Minipigs and Landrace Pigs

فشل القلب بعد احتشاء عضلة القلب في انسداد الشريان التاجي المغلق الصدر / نموذج إعادة التروية في الخنازير الصغيرة غوتنغن والخنازير لاندراس

The development of heart failure is the most powerful predictor of long-term mortality in patients surviving acute myocardial infarction (MI). There is an ...