Name: preparation of a non-cardiomyocyte cell suspension for single-cell rna sequencing from a post-myocardial infarction adult mouse heart
Uploaded: 2023-02-03T12:40:00
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Ce travail a été soutenu par le Fonds des sciences naturelles de la province du Zhejiang (LQ22H020010).

Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire à l’Université du Zhejiang et ont été approuvées par le Comité consultatif des animaux de l’Université du Zhejiang.
1. Chirurgie de ligature de l’artère coronaire antérieure descendante gauche (ligature LAD)
NOTE: Des souris C57BL / 6J mâles âgées de huit semaines ont été utilisées comme modèles. Les c...

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	<li>Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction.">Acute myocardial infarction.</a> Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).</li><li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incident+heart+failure+in+patients+with+coronary+artery+disease+undergoing+percutaneous+coronary+intervention.">Incident heart failure in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 727727 (2021).</li><li>Frangogiannis, N. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li><li>Massaia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+gene+expression+to+understand+the+dynamic+architecture+of+the+heart.">Single cell gene expression to understand the dynamic architecture of the heart.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 167 (2018).</li><li>Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+to+explore+immune+cell+heterogeneity.">Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity.</a> Nature Reviews. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+of+the+healthy+and+diseased+heart+reveals+cytoskeleton-associated+protein+4+as+a+new+modulator+of+fibroblasts+activation.">Single-cell sequencing of the healthy and diseased heart reveals cytoskeleton-associated protein 4 as a new modulator of fibroblasts activation.</a> Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).</li><li>Garcia-Flores, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+from+the+human+placenta.">Preparation of single-cell suspensions from the human placenta.</a> Nature Protocols. , (2022).</li><li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+of+immunolabeled+cell+types+from+adult+rat+brain.">FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).</li><li>Rheinl&#228;ndera, A., Schravenab, B., Bommhardt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD45+in+human+physiology+and+clinical+medicine.">CD45 in human physiology and clinical medicine.</a> Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).</li><li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+to+dissect+the+immunological+network+of+autoimmune+myocarditis.">Single-cell RNA sequencing to dissect the immunological network of autoimmune myocarditis.</a> Circulation. 142 (4), 384-400 (2020).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14, 935-936 (2017).</li></ol>

Cet article visait à décrire un protocole pour isoler des non-cardiomyocytes uniques de cœurs de souris après l’IM. Le protocole peut être appliqué pour isoler différents types de cellules dans le microenvironnement post-MI avec une haute qualité, y compris les cellules immunitaires, les cellules endothéliales et les fibroblastes. Trois facteurs essentiels sont cruciaux pour obtenir une suspension cellulaire de haute qualité pour le séquençage unicellulaire. Le premier est le réglage de la digestion enzyma...

L’infarctus du myocarde (IM) est l’une des maladies cardiovasculaires les plus courantes, et sa mortalité augmente dans le mondeentier 1. L’IM est causée par un apport sanguin insuffisant au myocarde environnant, qui peut être le résultat d’un blocage de l’artère coronaire qui se produit avec la rupture de la plaque d’athérosclérose. Bien que l’intervention coronarienne percutanée (ICP) ait réduit les taux de mortalité des patients atteints d’IM aigu, la prévalence élevée de l’insuffisance cardiaque après l’IM reste un problème2. La physiopathologie clé sous-jacente à l’insuffisance cardiaque post-IM est la réponse compensatoire du corps aux lésions cardiaques, qui consiste à remplacer le muscle cardiaque mort par des cicatrices fibrotiques non contractiles. Ces réponses adaptatives reposent de manière significative sur l’inflammation locale médiée par les interactions entre plusieurs types de cellules et les cellules du tissu cardiaque, et cette inflammation est maintenant considérée comme une cible thérapeutique potentielle pour réduire la formation de cicatrices fibrotiques et, ainsi, protéger contre l’insuffisance cardiaque post-IM 3,4. Fait intéressant, le microenvironnement au site de l’infarctus connaît une transition dépendante du temps dans les types de cellules infiltrantes et fonctionne à différents stades de MI 1,5. De nombreuses études ont montré que les non-cardiomyocytes (p. ex. cellules immunitaires, fibroblastes et cellules endothéliales) jouent un rôle central dans l’inflammation post-IM et la réparation des tissus 5,6. Ces dernières années, le séquençage unicellulaire a été largement utilisé comme un outil puissant pour élucider les implications et les fonctions des non-cardiomyocytes dans le microenvironnement post-MI 7,8. Cela donne un aperçu de la physiopathologie des blessures et des réparations post-IM et du développement de thérapies potentielles contre l’insuffisance cardiaque post-IM.
Le séquençage d’ARN à haut débit (RNA-Seq) est une technique utilisée pour étudier en détail des transcriptomes entiers à l’aide du séquençage de nouvelle génération (NGS)7,8,9. Récemment, le développement de scRNA-Seq a révolutionné le domaine de la recherche biomédicale. Par rapport au séquençage en vrac conventionnel, scRNA-Seq analyse les profils d’expression génique et l’hétérogénéité transcriptionnelle au niveau de la cellule unique 7,8. Cette technique favorise de manière significative la recherche sur la physiopathologie cellulaire de l’IM 9,10 en identifiant différents types de cellules circulantes dans le microenvironnement post-MI et en découvrant l’interaction entre les cardiomyocytes et les non-cardiomyocytes. Ces résultats contribuent également à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques pour l’insuffisance cardiaque post-IM. En général, l’expérience post-MI basée sur scRNA-seq comprend trois sections principales: (1) l’établissement d’un modèle animal post-MI; 2° la préparation de la suspension cellulaire; et (3) le séquençage des échantillons et l’analyse des données. Il est à noter que la préparation de la suspension cellulaire est l’étape la plus critique dans la préparation de l’expérience scRNA-Seq, car la qualité de la suspension cellulaire détermine la précision des résultats.
Ce protocole est conçu pour extraire une suspension cellulaire non cardiomyocytaire du tissu cardiaque post-IM; De manière significative, les détails spécifiques pour maintenir la viabilité et la résolution de la cellule sont inclus. Pendant ce temps, les équipements utilisés dans ce protocole, tels que les kits chirurgicaux pour souris, les ventilateurs pour rongeurs et les centrifugeuses, peuvent être trouvés dans la plupart des centres d’expérimentation animale et des laboratoires biomédicaux, et, par conséquent, le coût de l’expérience de ce protocole est relativement faible. De plus, si l’on considère les points temporels et les sites d’infarctus comme variables, ce protocole peut être appliqué pour simuler un large éventail de scénarios cliniques, en particulier pour les complications post-IM.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Acridine Orange / Propidium Iodide Stain</td>
			<td>Logos biosystems</td>
			<td>F23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated&#160;Cell&#160;Counter</td>
			<td>Logos biosystems</td>
			<td>L20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G5001</td>
			<td>Cytoprotective effect</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Slides</td>
			<td>Logos biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Digestive enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693</td>
			<td>Digestive enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Prevent cell clumping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;40&#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>Remove cell clumps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;70&#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>Remove undigested tissue and clumps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor</td>
			<td>OU QING SI</td>
			<td>10054963976859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>FST</td>
			<td>12061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F14012-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic Scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S11036-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3702-120ml</td>
			<td>Remove red blood cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rib Retractor</td>
			<td>FST</td>
			<td>17005-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Ventilator</td>
			<td>Harvard</td>
			<td>730043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Solvent&#160;solution of enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Scissor</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S14014-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a non-cardiomyocyte cell suspension for single-cell rna sequencing from a post-myocardial infarction adult mouse heart

L’infarctus du myocarde (IM) est l’une des maladies cardiovasculaires les plus courantes, avec une mortalité croissante dans le monde entier. Les non-cardiomyocytes représentent plus de la moitié de la population totale de cellules cardiaques et contribuent aux compensations adaptatives en cas de lésion myocardique, y compris les réponses inflammatoires, la réparation des tissus et la formation de cicatrices. Pour étudier le microenvironnement cardiaque post-MI, le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) est largement utilisé pour identifier différents types de cellules cardiaques et les communications intercellulaires. Parmi les procédures de préparation de l’échantillon scRNA-seq, la préparation de la suspension cellulaire est l’une des étapes les plus critiques, car la viabilité cellulaire peut affecter la qualité des résultats scRNA-seq. Par conséquent, nous avons conçu un protocole expérimental pour la préparation d’une suspension cellulaire non cardiomyocytaire à partir de cœurs de souris post-MI avec un accent supplémentaire sur l’amélioration de la viabilité cellulaire en choisissant des enzymes digestives douces, en contrôlant le temps de digestion et en appliquant un tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Enfin, nous avons isolé des cellules CD45+ à partir de la suspension cellulaire non cardiomyocytaire obtenue grâce à ce protocole, puis nous avons effectué scRNA-seq.

Une suspension unicellulaire à haute vitalité a été obtenue en mettant en œuvre la section 2 de ce protocole. Cependant, des fragments cellulaires ont encore pu être observés (Figure 1A); par conséquent, un tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) a été effectué pour améliorer encore la qualité16. Après FACS, la taille moyenne des cellules passe de 9,6 μm à 9,1 μm ( tableau 1), ce qui suggère que la proportion de fragments cell...

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Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart

Ici, nous décrivons un protocole pour isoler une quantité suffisante de non-cardiomyocytes uniques avec une viabilité élevée d’un cœur de souris post-infarctus du myocarde (IM). Cela peut être utilisé pour le séquençage ultérieur d’une seule cellule, l’analyse de cytométrie en flux et la culture cellulaire primaire.

Préparation d’une suspension cellulaire non cardiomyocytaire pour le séquençage d’ARN unicellulaire à partir d’un cœur de souris adulte post-infarctus du myocarde

Myocardial infarction (MI) is one of the most common cardiovascular diseases, with increasing mortality worldwide. Non-cardiomyocytes account for more ...

Notre protocole garantit à la fois la viabilité cellulaire et l’efficacité d’isolation de la suspension monocellulaire à des coûts relativement faibles. Les coûts et les exigences relativement faibles en matière d’équipement de laboratoire sont les principaux avantages de cette technique. Le séquençage unicellulaire révèle l’hétérogénéité des non-cardiomyocytes dans la physiopathologie cardiaque et fournit également des idées pour des études fondamentales et cliniques sur les maladies cardiaques.Ce protocole peut être utilisé dans ces études sur l’environnement cardiovasculaire post-MI tel que l’implication des cellules immunitaires. Pour les premières préparations, je suggère qu’une attention particulière soit accordée à la pepsine de l’échantillon et au temps de digestion. Une fois les tampons et les solutions préparés comme décrit dans le manuscrit, placez une souris euthanasiée qui a eu un infarctus du myocarde deux semaines plus tôt en décubitus dorsal sur la table chirurgicale.Fixez ses membres postérieurs à l’aide de ruban adhésif. Pour exciser le cœur, vaporisez le corps avec de l’éthanol à 70%. Faites une incision verticale à travers la peau abdominale et les muscles tout en évitant le foie.Sans perforer le cœur, ouvrez soigneusement le thorax et abondez le ventricule gauche avec une solution de PBS pré-refroidie jusqu’à ce que le liquide de perfusion soit incolore. À l’aide de forceps, soulevez doucement le cœur et coupez l’excès de tissus attachés à son extérieur avec des ciseaux ophtalmiques. Placez le cœur dans un millilitre de PBS pré-refroidi dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.Transférer le cœur dans un puits d’une plaque de 24 puits placée sur de la glace. Pipet 150 microlitres du tampon de dissociation cardiaque dans le puits, et couper le cœur en morceaux d’un millimètre à l’aide de ciseaux. Transférer le tissu cardiaque haché dans un tube centrifuge de 15 millilitres contenant cinq millilitres de tampon de dissociation tissulaire.Placez le tube dans un agitateur alternatif thermostatique. Versez la suspension de haut en bas 10 fois toutes les 20 minutes. Pour éliminer les touffes et les tissus non digérés, filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 70 micromètres à l’aide de 25 millilitres de tampon de lavage cellulaire.Rincer le tube de centrifugation et la crépine cellulaire. Ensuite, filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 40 micromètres pour éliminer les autres amas de cellules. Centrifuger la suspension cellulaire filtrée à 300 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Remettez l’échantillon cellulaire en suspension dans cinq volumes de tampon de lyse des globules rouges et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Maintenant, ajoutez quatre volumes du tampon de lavage cellulaire dans la suspension cellulaire et la centrifugeuse comme démontré précédemment. Après avoir jeté le surnageant, remettez les cellules en suspension dans 10 millilitres du tampon de lavage cellulaire et centrifugez à nouveau.À la fin de la centrifugation, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans un millilitre de tampon de lavage cellulaire. Prenez 18 microlitres de la suspension dans un autre tube centrifuge et ajoutez deux microlitres de solution de coloration à l’iodure de propidium d’orange acridine. Ajouter 10 microlitres de cette solution colorée dans une lame de chambre de comptage.Évaluez le nombre de cellules et leur viabilité à l’aide d’un compteur automatique de cellules. Des fragments cellulaires ont été observés dans la suspension cardiaque unicellulaire. Le tri cellulaire activé par fluorescence a effectivement réduit la proportion de fragments cellulaires et l’agglutination cellulaire, ce qui a entraîné une diminution de la taille moyenne des cellules.Le séquençage de l’ARN a prouvé une séparation évidente de sept types de cellules immunitaires, comme le démontrent le regroupement non supervisé et la réduction de l’incorporation stochastique des voisins distribués en T. Chaque cellule immunitaire a montré une expression élevée de marqueurs classiques. Le tissu cardiaque doit être coupé suffisamment petit pour éviter une digestion incomplète, ce qui entraîne de nombreuses bosses cellulaires dans la suspension cellulaire.La suspension unicellulaire obtenue par ce protocole peut être appliquée en continu dans l’analyse en flux de culture cellulaire primaire. Ce protocole profite aux études sur le microenvironnement de l’infection myocardique, ce qui peut aider les chercheurs à regarder au-delà des tissus cardiaques et à considérer l’infection myocardique comme un problème systématique.

Research

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Medicine

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