Name: preparation of a non-cardiomyocyte cell suspension for single-cell rna sequencing from a post-myocardial infarction adult mouse heart
Uploaded: 2023-02-03T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מדעי הטבע של פרובינציית ג'ג'יאנג (LQ22H020010).

כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה באוניברסיטת ג'ג'יאנג ואושרו על ידי הוועדה המייעצת לבעלי חיים באוניברסיטת ג'ג'יאנג.
1. ניתוח קשירת עורקים כליליים יורדת קדמית שמאלית (קשירת LAD)
הערה: עכברי C57BL/6J זכרים בני שמונה שבועות שימשו כמודל...

<ol>
	<li>Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction.">Acute myocardial infarction.</a> Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).</li><li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incident+heart+failure+in+patients+with+coronary+artery+disease+undergoing+percutaneous+coronary+intervention.">Incident heart failure in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 727727 (2021).</li><li>Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+response+in+myocardial+injury,+repair,+and+remodelling.">The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling.</a> Nature Reviews. Cardiology. 11 (5), 255-265 (2014).</li><li>Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+revisited:+Inflammation+versus+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction.">Inflammation revisited: Inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444 (2014).</li><li>Tzahor, E., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+coalition+to+heal-the+impact+of+the+cardiac+microenvironment.">A coalition to heal-the impact of the cardiac microenvironment.</a> Science. 377 (6610), 4443 (2022).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li><li>Massaia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+gene+expression+to+understand+the+dynamic+architecture+of+the+heart.">Single cell gene expression to understand the dynamic architecture of the heart.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 167 (2018).</li><li>Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+to+explore+immune+cell+heterogeneity.">Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity.</a> Nature Reviews. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).</li><li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+reveals+the+temporal+diversity+and+dynamics+of+cardiac+immunity+after+myocardial+infarction.">Single-cell RNA sequencing reveals the temporal diversity and dynamics of cardiac immunity after myocardial infarction.</a> Small Methods. 6 (3), 2100752 (2022).</li><li>Tombor, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+sequencing+reveals+endothelial+plasticity+with+transient+mesenchymal+activation+after+myocardial+infarction.">Single cell sequencing reveals endothelial plasticity with transient mesenchymal activation after myocardial infarction.</a> Nature Communications. 12 (1), 681 (2021).</li><li>Virag, J. A., Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+artery+ligation+and+intramyocardial+injection+in+a+murine+model+of+infarction.">Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2581 (2011).</li><li>Reichard, A., Asosingh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+preparing+a+single+cell+suspension+from+solid+tissues+for+flow+cytometry.">Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2018).</li><li>Gladka, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+of+the+healthy+and+diseased+heart+reveals+cytoskeleton-associated+protein+4+as+a+new+modulator+of+fibroblasts+activation.">Single-cell sequencing of the healthy and diseased heart reveals cytoskeleton-associated protein 4 as a new modulator of fibroblasts activation.</a> Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).</li><li>Garcia-Flores, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+from+the+human+placenta.">Preparation of single-cell suspensions from the human placenta.</a> Nature Protocols. , (2022).</li><li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+of+immunolabeled+cell+types+from+adult+rat+brain.">FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).</li><li>Rheinl&#228;ndera, A., Schravenab, B., Bommhardt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD45+in+human+physiology+and+clinical+medicine.">CD45 in human physiology and clinical medicine.</a> Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).</li><li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+to+dissect+the+immunological+network+of+autoimmune+myocarditis.">Single-cell RNA sequencing to dissect the immunological network of autoimmune myocarditis.</a> Circulation. 142 (4), 384-400 (2020).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14, 935-936 (2017).</li></ol>

מאמר זה נועד לתאר פרוטוקול לבידוד יחיד שאינו קרדיומיוציטים מלבבות עכברים לאחר MI. ניתן ליישם את הפרוטוקול כדי לבודד סוגים שונים של תאים במיקרו-סביבה שלאחר MI באיכות גבוהה, כולל תאי מערכת החיסון, תאי אנדותל ופיברובלסטים. שלושה גורמים חיוניים חיוניים להשגת תרחיף תאים איכותי לריצוף תא יחיד. הר...

אוטם שריר הלב (MI) היא אחת ממחלות הלב וכלי הדם הנפוצות ביותר, ותמותה עולה ברחבי העולם1. MI נגרמת על ידי אספקת דם לא מספקת לשריר הלב שמסביב, אשר יכול להיות תוצאה של חסימת עורקים כליליים המתרחשת עם קרע רובד טרשתי. למרות שהתערבות כלילית מלעורית (PCI) הפחיתה את שיעורי התמותה של חולי MI חריפים, השכיחות הגבוהה של אי ספיקת לב לאחר MI נותרה בעיה2. הפתופיזיולוגיה העיקרית העומדת בבסיס אי ספיקת לב לאחר MI היא תגובת הפיצוי של הגוף לפגיעות לב, הכוללת החלפת שריר הלב המת בצלקות פיברוטיות שאינן מתכווצות. תגובות אדפטיביות אלה מסתמכות באופן משמעותי על דלקת מקומית המתווכת על ידי אינטראקציות בין סוגי תאים מרובים ותאי רקמת לב, ודלקת זו נחשבת כיום כיעד טיפולי פוטנציאלי להפחתת היווצרות צלקות פיברוטיות, ובכך להגן מפני אי ספיקת לב שלאחר MI 3,4. באופן מעניין, המיקרו-סביבה באתר אוטם חווה מעבר תלוי זמן בסוגי התאים החודרים ובתפקודים בשלבים שונים של MI 1,5. מחקרים רבים הראו כי לא-קרדיומיוציטים (למשל, תאי מערכת החיסון, פיברובלסטים ותאי אנדותל) ממלאים תפקידים מרכזיים בדלקת שלאחר MI ובתיקון רקמות 5,6. בשנים האחרונות, ריצוף חד-תאי נמצא בשימוש נרחב ככלי רב עוצמה להבהרת המעורבות והתפקודים של לא-קרדיומיוציטים במיקרו-סביבה 7,8 שלאחר MI. זה מספק תובנות לגבי הפתופיזיולוגיה של פציעה ותיקון לאחר MI ופיתוח טיפולים פוטנציאליים נגד אי ספיקת לב לאחר MI.
ריצוף RNA בתפוקה גבוהה (RNA-Seq) היא טכניקה המשמשת לחקר תעתיקים שלמים בפירוט רב באמצעות ריצוף הדור הבא (NGS)7,8,9. לאחרונה, הפיתוח של scRNA-Seq חולל מהפכה בתחום המחקר הביו-רפואי. בהשוואה לריצוף קונבנציונלי בתפזורת, scRNA-Seq מנתח פרופילי ביטוי גנים והטרוגניות שעתוק ברמת התא הבודד 7,8. טכניקה זו מקדמת באופן משמעותי את המחקר של הפתופיזיולוגיה התאית של MI 9,10 על ידי זיהוי סוגי תאים שונים במחזור הדם במיקרו-סביבה שלאחר MI וחשיפת האינטראקציה בין קרדיומיוציטים ושאינם קרדיומיוציטים. ממצאים אלה תורמים עוד יותר לחשיפת מטרות טיפוליות חדשות לאי ספיקת לב לאחר MI. באופן כללי, ניסוי הפוסט-MI מבוסס scRNA-seq כולל שלושה חלקים עיקריים: (1) ביסוס מודל בעלי חיים פוסט-MI; (2) הכנת השעיית התא; ו-(3) ריצוף מדגם וניתוח נתונים. באופן בולט, הכנת תרחיף התא היא השלב הקריטי ביותר בהכנת ניסוי scRNA-Seq מכיוון שאיכות תרחיף התא קובעת את דיוק התוצאות.
פרוטוקול זה נועד לחלץ תרחיף תאים שאינו קרדיומיוציטים מרקמת הלב שלאחר MI; באופן משמעותי, הפרטים הספציפיים לשמירה על כדאיות התא ורזולוציה נכללים. בינתיים, את הציוד המשמש בפרוטוקול זה, כגון ערכות ניתוח לעכברים, מנשמי מכרסמים וצנטריפוגות, ניתן למצוא ברוב מרכזי הניסויים בבעלי חיים ובמעבדות ביו-רפואיות, ולכן עלות הניסוי של פרוטוקול זה נמוכה יחסית. יתר על כן, אם לוקחים בחשבון נקודות זמן ואתרים של אוטם כמשתנים, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לדמות מגוון רחב של תרחישים קליניים, במיוחד עבור סיבוכים לאחר MI.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acridine Orange / Propidium Iodide Stain</td>
			<td>Logos biosystems</td>
			<td>F23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated&#160;Cell&#160;Counter</td>
			<td>Logos biosystems</td>
			<td>L20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G5001</td>
			<td>Cytoprotective effect</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Slides</td>
			<td>Logos biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Digestive enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693</td>
			<td>Digestive enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Prevent cell clumping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;40&#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>Remove cell clumps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;70&#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>Remove undigested tissue and clumps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor</td>
			<td>OU QING SI</td>
			<td>10054963976859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>FST</td>
			<td>12061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F14012-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic Scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S11036-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3702-120ml</td>
			<td>Remove red blood cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rib Retractor</td>
			<td>FST</td>
			<td>17005-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Ventilator</td>
			<td>Harvard</td>
			<td>730043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Solvent&#160;solution of enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Scissor</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S14014-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a non-cardiomyocyte cell suspension for single-cell rna sequencing from a post-myocardial infarction adult mouse heart

אוטם שריר הלב (MI) היא אחת ממחלות הלב וכלי הדם הנפוצות ביותר, עם תמותה גוברת ברחבי העולם. לא-קרדיומיוציטים מהווים יותר ממחצית מכלל אוכלוסיית תאי הלב, והם תורמים לפיצויים אדפטיביים על פגיעה בשריר הלב, כולל תגובות דלקתיות, תיקון רקמות והיווצרות צלקות. כדי לחקור את המיקרו-סביבה הלבבית שלאחר MI, ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) נמצא בשימוש נרחב לזיהוי סוגים שונים של תאי לב ותקשורת בין-תאית. בין ההליכים של הכנת דגימת scRNA-seq, הכנת תרחיף התא הוא אחד השלבים הקריטיים ביותר, מכיוון שיכולת הקיום של התא יכולה להשפיע על איכות תוצאות scRNA-seq. לכן, תכננו פרוטוקול ניסיוני להכנת תרחיף תאים שאינו קרדיומיוציטים מלבבות עכברים לאחר MI עם דגש נוסף על שיפור יכולת הקיום של התא על ידי בחירת אנזימי עיכול עדינים, שליטה בזמן העיכול ויישום מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS). לבסוף, בודדנו תאי CD45+ מתרחיף התאים שאינו קרדיומיוציטים המתקבל באמצעות פרוטוקול זה, ולאחר מכן ביצענו scRNA-seq.

תרחיף חד-תאי בעל חיוניות גבוהה הושג על ידי יישום סעיף 2 לפרוטוקול זה. אולם עדיין ניתן היה לצפות במקטעי תאים (איור 1A); לפיכך, מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) בוצע כדי לשפר עוד יותר את האיכות16. לאחר FACS, גודל התא הממוצע מצטמצם מ-9.6 מיקרומטר ל-9.1 מיקרומטר ( <s...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart at JoVE.com

Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבידוד כמות מספקת של לא-קרדיומיוציטים בודדים עם כדאיות גבוהה מלב עכבר לאחר אוטם שריר הלב (MI). זה יכול לשמש לריצוף תא בודד לאחר מכן, ניתוח ציטומטריית זרימה, ותרבית תאים ראשונית.

הכנת תרחיף תאים שאינו קרדיומיוציטים לריצוף RNA חד-תאי מלב עכבר בוגר לאחר אוטם שריר הלב

Myocardial infarction (MI) is one of the most common cardiovascular diseases, with increasing mortality worldwide. Non-cardiomyocytes account for more ...

הפרוטוקול שלנו מבטיח הן את כדאיות התא והן את יעילות הבידוד של תרחיף תא בודד בעלויות נמוכות יחסית. עלויות נמוכות יחסית ודרישות עבור ציוד מעבדה הם היתרונות העיקריים של טכניקה זו. ריצוף תא בודד חושף את ההטרוגניות של לא קרדיומיוציטים בפתופיזיולוגיה של הלב, וגם מספק רעיונות למחקרים בסיסיים וקליניים למחלות לב.פרוטוקול זה יכול לשמש במחקר זה על הסביבה הקרדיווסקולרית שלאחר MI, כגון מעורבות של תאים חיסוניים. עבור הכנות ראשונות, אני מציע להקדיש תשומת לב מיוחדת לפפסין הדגימה ולזמן העיכול. לאחר הכנת החוצצים והתמיסות כמתואר בכתב היד, הניחו על שולחן הניתוחים עכבר שעבר המתת חסד שעבר אוטם שריר הלב שבועיים קודם לכן במצב שכיבה.תקן את הגפיים האחוריות שלו באמצעות סרט הדבקה. כדי להסיר את הלב, לרסס את הגוף עם 70% אתנול. בצע חתך אנכי דרך עור הבטן והשרירים תוך הימנעות מהכבד.מבלי לנקב את הלב, פתחו בזהירות את בית החזה ופזרו את החדר השמאלי בתמיסת PBS קרירה מראש עד שנוזל הזילוח חסר צבע. באמצעות מלקחיים, להרים בעדינות את הלב לחתוך את הרקמות העודפות המחוברות החיצוני שלה עם מספריים אופתלמיים. הניחו את הלב במיליליטר אחד של PBS מקורר מראש בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.מעבירים את הלב לבאר של צלחת 24 באר המונחת על קרח. פיפט 150 מיקרוליטר של חיץ דיסוציאציה לבבית לתוך הבאר, וחתך את הלב לחתיכות בגודל מילימטר אחד באמצעות מספריים. מעבירים את רקמת הלב הטחונה לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של מאגר הדיסוציאציה של הרקמה.מניחים את הצינור בשייקר הדדי תרמוסטטי. מקפיצים את המתלים למעלה ולמטה 10 פעמים כל 20 דקות. כדי להסיר גושים ורקמות לא מעוכלות, סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים בגודל 70 מיקרומטר באמצעות 25 מיליליטר של חיץ שטיפת תאים.שטפו את צינור הצנטריפוגה ואת מסננת התא. לאחר מכן, סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי להסיר גושי תאים נוספים. צנטריפוגה את תרחיף התא המסונן ב 300 x גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.יש להשהות מחדש את דגימת התא בחמישה כרכים של חיץ ליזה RBC ולדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. כעת, הוסף ארבעה נפחים של חיץ שטיפת התאים במתלה התא ובצנטריפוגה כפי שהודגם בעבר. לאחר השלכת הסופרנטנט, השהה מחדש את התאים ב -10 מיליליטר של חיץ שטיפת התא והצנטריפוגה שוב.בסוף הצנטריפוגה, להשליך את supernatant ולתלות מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של חיץ שטיפת תאים. קח 18 מיקרוליטר של המתלה בצינור צנטריפוגה אחר והוסף שני מיקרוליטרים של תמיסת צביעת יודיד תפוז אקרידין. הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסה מוכתמת זו לשקופית תא ספירה.הערך את מספרי התאים ואת הכדאיות באמצעות מונה תאים אוטומטי. שברי תאים נצפו בהשעיית הלב של התא הבודד. מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות הפחית ביעילות את חלקם היחסי של מקטעי התא ואת התגבשות התא וכתוצאה מכך הקטנת גודל התא הממוצע.ריצוף RNA הוכיח הפרדה ברורה של שבעה סוגים של תאים חיסוניים, כפי שהודגם על ידי אשכולות ללא פיקוח והטבעה מופחתת של שכנים סטוכסטיים מבוזרים T. כל תא חיסון הראה ביטוי גבוה של סמנים קלאסיים. רקמת הלב צריכה להיות חתוכה קטנה מספיק כדי למנוע עיכול חלקי, מה שמוביל הרבה גושים תאים השעיית התא.תרחיף התא הבודד המתקבל על ידי פרוטוקול זה יכול להיות מיושם עוד יותר בניתוח זרימה של תרבית תאים ראשונית. פרוטוקול זה מועיל למחקרים על מיקרו-סביבה של זיהום שריר הלב, אשר עשוי לסייע לחוקרים להסתכל מעבר לרקמות הלב ולשקול זיהום שריר הלב כבעיה שיטתית.

Research

JoVE Journal

Medicine

Myocardial Infarction and Functional Outcome Assessment in Pigs

אוטם שריר לב והערכת תוצאה תפקודית בחזירים

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One ...

A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion

שיטה שונה לHeterotopic מאוס לב Transplantion

Mice are often used as heart transplant donors and recipients in studies of transplant immunology due to the wide range of transgenic mice and reagents ...

An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

מערכת העבודה לב מבודדת למודלים בבעלי חיים גדולים

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

קשירת קבע של העורק השמאלי קדמי יורד כלילית בעכברים: דגם של Remodelling אוטם שריר לב ופוסט-אי ספיקת לב

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

רצף עמוק משוחד של RNA וירוסי ממדגמים קליניים

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

דרך יעילה Sieving כדי לבודד Glomeruli ללא פגע מן החולדה למבוגרים כליות

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

בידוד של פרפור מיוציטים מעכברים למבוגרים

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

מודל לפציעה בהקפאה לחקור אוטם שריר הלב בעכבר

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

Establishing a Swine Model of Post-myocardial Infarction Heart Failure for Stem Cell Treatment

הקמת מודל חזירים של אי ספיקת לב לאחר שריר הלב לטיפול בתאי גזע

Although advances have been achieved in the treatment of heart failure (HF) following myocardial infarction (MI), HF following MI remains one of the major ...

Post-Myocardial Infarction Heart Failure in Closed-chest Coronary Occlusion/Reperfusion Model in G&#246;ttingen Minipigs and Landrace Pigs

אי ספיקת לב אוטם לאחר שריר הלב בחזה סגור חסימה / רפרופוזיה מודל ב Göttingen Minipigs ו חזירי Landrace

The development of heart failure is the most powerful predictor of long-term mortality in patients surviving acute myocardial infarction (MI). There is an ...