Name: preparation of a non-cardiomyocyte cell suspension for single-cell rna sequencing from a post-myocardial infarction adult mouse heart
Uploaded: 2023-02-03T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart at JoVE.com

इस काम को झेजियांग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान कोष (एलक्यू 22 एच 020010) द्वारा समर्थित किया गया था।

सभी प्रयोग झेजियांग विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किए गए थे और झेजियांग विश्वविद्यालय में पशु सलाहकार समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थ...

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	<li>Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction.">Acute myocardial infarction.</a> Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).</li><li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incident+heart+failure+in+patients+with+coronary+artery+disease+undergoing+percutaneous+coronary+intervention.">Incident heart failure in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 727727 (2021).</li><li>Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+response+in+myocardial+injury,+repair,+and+remodelling.">The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling.</a> Nature Reviews. Cardiology. 11 (5), 255-265 (2014).</li><li>Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. 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Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).</li><li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+reveals+the+temporal+diversity+and+dynamics+of+cardiac+immunity+after+myocardial+infarction.">Single-cell RNA sequencing reveals the temporal diversity and dynamics of cardiac immunity after myocardial infarction.</a> Small Methods. 6 (3), 2100752 (2022).</li><li>Tombor, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+sequencing+reveals+endothelial+plasticity+with+transient+mesenchymal+activation+after+myocardial+infarction.">Single cell sequencing reveals endothelial plasticity with transient mesenchymal activation after myocardial infarction.</a> Nature Communications. 12 (1), 681 (2021).</li><li>Virag, J. A., Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+artery+ligation+and+intramyocardial+injection+in+a+murine+model+of+infarction.">Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2581 (2011).</li><li>Reichard, A., Asosingh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+preparing+a+single+cell+suspension+from+solid+tissues+for+flow+cytometry.">Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2018).</li><li>Gladka, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+of+the+healthy+and+diseased+heart+reveals+cytoskeleton-associated+protein+4+as+a+new+modulator+of+fibroblasts+activation.">Single-cell sequencing of the healthy and diseased heart reveals cytoskeleton-associated protein 4 as a new modulator of fibroblasts activation.</a> Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).</li><li>Garcia-Flores, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+from+the+human+placenta.">Preparation of single-cell suspensions from the human placenta.</a> Nature Protocols. , (2022).</li><li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+of+immunolabeled+cell+types+from+adult+rat+brain.">FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).</li><li>Rheinl&#228;ndera, A., Schravenab, B., Bommhardt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD45+in+human+physiology+and+clinical+medicine.">CD45 in human physiology and clinical medicine.</a> Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).</li><li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+to+dissect+the+immunological+network+of+autoimmune+myocarditis.">Single-cell RNA sequencing to dissect the immunological network of autoimmune myocarditis.</a> Circulation. 142 (4), 384-400 (2020).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14, 935-936 (2017).</li></ol>

इस लेख का उद्देश्य एमआई के बाद माउस दिल से एकल गैर-कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करना था। प्रोटोकॉल को प्रतिरक्षा कोशिकाओं, एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट सहित उ...

मायोकार्डियल रोधगलन (एमआई) सबसे आम कार्डियोवैस्कुलर बीमारियों में से एक है, और इसकी मृत्युदर दुनिया भर में बढ़ रही है। एमआई आसपास के मायोकार्डियम में अपर्याप्त रक्त की आपूर्ति के कारण होता है, जो एथेरोस्क्लेरोटिक पट्टिका टूटने के साथ होने वाली कोरोनरी धमनी रुकावट का परिणाम हो सकता है। हालांकि पर्क्यूटेनियस कोरोनरी इंटरवेंशन (पीसीआई) ने तीव्र एमआई रोगियों की मृत्यु दर को कम कर दिया है, लेकिन एमआई के बाद दिल की विफलता का उच्च प्रसार एक समस्याबनी हुई है। एमआई दिल की विफलता के बाद अंतर्निहित प्रमुख पैथोफिज़ियोलॉजी हृदय की चोटों के लिए शरीर की प्रतिपूरक प्रतिक्रिया है, जिसमें मृत हृदय की मांसपेशियों को गैर-सिकुड़ा हुआ फाइब्रोटिक निशान के साथ बदलना शामिल है। ये अनुकूली प्रतिक्रियाएं कई सेल प्रकारों और हृदय ऊतक कोशिकाओं के बीच बातचीत द्वारा मध्यस्थता की गई स्थानीय सूजन पर काफी निर्भर करती हैं, और इस सूजन को अब फाइब्रोटिक निशान गठन को कम करने के लिए एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य माना जाता है और इस प्रकार, पोस्ट-एमआई दिल की विफलता 3,4 से बचाता है। दिलचस्प बात यह है कि रोधगलन स्थल पर माइक्रोएन्वायरमेंट एमआई 1,5 के विभिन्न चरणों में घुसपैठ करने वाले सेल प्रकारों और कार्यों में समय-निर्भर संक्रमण का अनुभव करता है। कई अध्ययनों से पता चला है कि गैर-कार्डियोमायोसाइट्स (जैसे, प्रतिरक्षा कोशिकाएं, फाइब्रोब्लास्ट और एंडोथेलियल कोशिकाएं) पोस्ट-एमआई सूजन और ऊतक की मरम्मतमें केंद्रीय भूमिका निभाती हैं। हाल के वर्षों में, एकल-कोशिका अनुक्रमण का व्यापक रूप से पोस्ट-एमआई माइक्रोएनवायरमेंट 7,8 में गैर-कार्डियोमायोसाइट्स की भागीदारी और कार्यों को स्पष्ट करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उपयोग किया गया है। यह पोस्ट-एमआई चोट और मरम्मत के पैथोफिज़ियोलॉजी और पोस्ट-एमआई दिल की विफलता के खिलाफ संभावित उपचारों के विकास में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।
उच्च-थ्रूपुट आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सेक) एक तकनीक है जिसका उपयोग अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) 7,8,9 का उपयोग करके पूरे ट्रांसक्रिपटम्स का बहुत विस्तार से अध्ययन करने के लिए किया जाता है। हाल ही में, एससीआरएनए-सेक के विकास ने जैव चिकित्सा अनुसंधान क्षेत्र में क्रांति ला दी है। पारंपरिक थोक अनुक्रमण की तुलना में, एससीआरएनए-सेक एकल-कोशिका स्तर 7,8 पर जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल और ट्रांसक्रिप्शनल विषमता का विश्लेषण करता है। यह तकनीक पोस्ट-एमआई माइक्रोएन्वायरमेंट में विभिन्न परिसंचारी सेल प्रकारों की पहचान करके और कार्डियोमायोसाइट्स और गैर-कार्डियोमायोसाइट्स के बीच बातचीत को उजागर करके एमआई 9,10 के सेलुलर पैथोफिज़ियोलॉजी के अनुसंधान को काफी बढ़ावा देती है। ये निष्कर्ष पोस्ट-एमआई दिल की विफलता के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्यों को उजागर करने में योगदान करते हैं। सामान्य तौर पर, एससीआरएनए-सेक-आधारित पोस्ट-एमआई प्रयोग में तीन मुख्य खंड शामिल हैं: (1) पोस्ट-एमआई पशु मॉडल की स्थापना; (2) सेल निलंबन की तैयारी; और (3) नमूना अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण। उल्लेखनीय रूप से, सेल निलंबन तैयार करना एससीआरएनए-सेक प्रयोग की तैयारी में सबसे महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि सेल निलंबन की गुणवत्ता परिणामों की सटीकता निर्धारित करती है।
यह प्रोटोकॉल पोस्ट-एमआई कार्डियक ऊतक से एक गैर-कार्डियोमायोसाइट सेल निलंबन निकालने के लिए डिज़ाइन किया गया है; गौरतलब है कि सेल व्यवहार्यता और संकल्प को बनाए रखने के लिए विशिष्ट विवरण शामिल हैं। इस बीच, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले उपकरण, जैसे चूहों के लिए सर्जिकल किट, कृंतक वेंटिलेटर और सेंट्रीफ्यूज, अधिकांश पशु प्रयोग केंद्रों और जैव चिकित्सा प्रयोगशालाओं में पाए जा सकते हैं, और इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल की प्रयोग लागत अपेक्षाकृत कम है। इसके अलावा, यदि समय बिंदुओं और रोधगलन की साइटों को चर के रूप में माना जाता है, तो इस प्रोटोकॉल को नैदानिक परिदृश्यों की एक विस्तृत श्रृंखला का अनुकरण करने के लिए लागू किया जा सकता है, खासकर पोस्ट-एमआई जटिलताओं के लिए।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acridine Orange / Propidium Iodide Stain</td>
			<td>Logos biosystems</td>
			<td>F23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated&#160;Cell&#160;Counter</td>
			<td>Logos biosystems</td>
			<td>L20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G5001</td>
			<td>Cytoprotective effect</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Slides</td>
			<td>Logos biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Digestive enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693</td>
			<td>Digestive enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Prevent cell clumping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;40&#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>Remove cell clumps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;70&#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>Remove undigested tissue and clumps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor</td>
			<td>OU QING SI</td>
			<td>10054963976859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>FST</td>
			<td>12061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F14012-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic Scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S11036-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3702-120ml</td>
			<td>Remove red blood cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rib Retractor</td>
			<td>FST</td>
			<td>17005-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Ventilator</td>
			<td>Harvard</td>
			<td>730043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Solvent&#160;solution of enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Scissor</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S14014-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a non-cardiomyocyte cell suspension for single-cell rna sequencing from a post-myocardial infarction adult mouse heart

मायोकार्डियल रोधगलन (एमआई) दुनिया भर में बढ़ती मृत्यु दर के साथ सबसे आम हृदय रोगों में से एक है। गैर-कार्डियोमायोसाइट्स कुल कार्डियक सेल आबादी के आधे से अधिक के लिए जिम्मेदार हैं, और वे मायोकार्डियल चोट पर अनुकूली मुआवजे में योगदान करते हैं, जिसमें भड़काऊ प्रतिक्रियाएं, ऊतक की मरम्मत और निशान गठन शामिल हैं। पोस्ट-एमआई कार्डियक माइक्रोएन्वायरमेंट का अध्ययन करने के लिए, एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण (एससीआरएनए-सेक) का व्यापक रूप से विभिन्न कार्डियक सेल प्रकारों और अंतरकोशिकीय संचार की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है। एससीआरएनए-सेक नमूना तैयारी की प्रक्रियाओं में, सेल निलंबन तैयार करना सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है, क्योंकि सेल व्यवहार्यता एससीआरएनए-सेक परिणामों की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकती है। इसलिए, हमने हल्के पाचन एंजाइमों को चुनने, पाचन समय को नियंत्रित करने और प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) लागू करके सेल व्यवहार्यता में सुधार करने पर अतिरिक्त ध्यान देने के साथ पोस्ट-एमआई माउस दिलों से एक गैर-कार्डियोमायोसाइट सेल निलंबन तैयार करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल तैयार किया। अंत में, हमने इस प्रोटोकॉल के माध्यम से प्राप्त गैर-कार्डियोमायोसाइट सेल निलंबन से सीडी 45+ कोशिकाओं को अलग किया, और फिर हमने एससीआरएनए-सेक का प्रदर्शन किया।

इस प्रोटोकॉल की धारा 2 को लागू करके उच्च जीवन शक्ति के साथ एक एकल-सेल निलंबन प्राप्त किया गया था। हालांकि, सेल के टुकड़े अभी भी देखे जा सकते हैं (चित्रा 1 ए); इसलिए, प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टि?...

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Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart

यहां, हम पोस्ट-मायोकार्डियल रोधगलन (एमआई) माउस दिल से उच्च व्यवहार्यता के साथ पर्याप्त मात्रा में एकल गैर-कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इसका उपयोग बाद में एकल-कोशिका अनुक्रमण, प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण और प्राथमिक सेल संस्कृति के लिए किया जा सकता है।

पोस्ट-मायोकार्डियल रोधगलन वयस्क माउस हार्ट से सिंगल-सेल आरएनए अनुक्रमण के लिए एक गैर-कार्डियोमायोसाइट सेल निलंबन की तैयारी

Myocardial infarction (MI) is one of the most common cardiovascular diseases, with increasing mortality worldwide. Non-cardiomyocytes account for more ...

हमारा प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत कम लागत पर एकल सेल निलंबन की सेल व्यवहार्यता और अलगाव दक्षता दोनों सुनिश्चित करता है। प्रयोगशाला उपकरणों के लिए अपेक्षाकृत कम लागत और आवश्यकताएं इस तकनीक के मुख्य फायदे हैं। एकल कोशिका अनुक्रमण कार्डियक पैथोफिज़ियोलॉजी में गैर कार्डियोमायोसाइट्स की विविधता को प्रकट करता है, और हृदय रोग के लिए बुनियादी और नैदानिक अध्ययन के लिए विचार भी प्रदान करता है।इस प्रोटोकॉल का उपयोग पोस्ट-एमआई कार्डियोवैस्कुलर वातावरण जैसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भागीदारी पर इस अध्ययन में किया जा सकता है। पहली बार की तैयारी के लिए, मेरा सुझाव है कि नमूना पेप्सिन और पाचन समय पर अतिरिक्त ध्यान दिया जाना चाहिए। एक बार जब पांडुलिपि में वर्णित बफर और समाधान तैयार हो जाते हैं, तो एक इच्छामृत्यु माउस रखें जिसे दो सप्ताह पहले मायोकार्डियल रोधगलन हुआ था, सर्जिकल टेबल पर लापरवाह स्थिति में।चिपकने वाला टेप का उपयोग करके इसके पिछले अंगों को ठीक करें। दिल को एक्साइज करने के लिए, शरीर को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। लीवर से बचते हुए पेट की त्वचा और मांसपेशियों के माध्यम से एक ऊर्ध्वाधर चीरा लगाएं।दिल को घुमाए बिना, वक्ष को सावधानीपूर्वक खोलें और बाएं वेंट्रिकल को प्री-कूल पीबीएस समाधान के साथ तब तक प्रबोहित करें जब तक कि छिड़काव द्रव रंगहीन न हो जाए। बल का उपयोग करके, धीरे से हृदय को उठाएं और नेत्र कैंची के साथ इसके बाहरी हिस्से से जुड़े अतिरिक्त ऊतकों को काट दें। दिल को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्री-कूल्ड पीबीएस के एक मिलीलीटर में रखें।दिल को बर्फ पर रखी 24 कुएं की प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें। पिपेट 150 माइक्रोलीटर कार्डियक पृथक्करण बफर को कुएं में डालें, और कैंची का उपयोग करके दिल को एक मिलीमीटर आकार के टुकड़ों में काट दें। कीमा वाले हृदय ऊतक को 15 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें ऊतक पृथक्करण बफर के पांच मिलीलीटर होते हैं।ट्यूब को थर्मोस्टैटिक पारस्परिक शेकर में रखें। सस्पेंशन को हर 20 मिनट में 10 बार ऊपर और नीचे करें। झुरमुट और बिना पचे हुए ऊतक को हटाने के लिए, 25 मिलीलीटर सेल वॉश बफर का उपयोग करके 70 माइक्रोमीटर सेल छन्नी के माध्यम से सेल निलंबन को फ़िल्टर करें।सेंट्रीफ्यूज ट्यूब और सेल छन्नी को धो लें। इसके बाद, आगे सेल क्लंप को हटाने के लिए 40 माइक्रोमीटर सेल छन्नी के माध्यम से सेल निलंबन को फ़िल्टर करें। फ़िल्टर किए गए सेल सस्पेंशन को 300 x g पर चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।आरबीसी लाइसिस बफर के पांच संस्करणों में सेल के नमूने को फिर से निलंबित करें और कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। अब, सेल सस्पेंशन और सेंट्रीफ्यूज में सेल वॉश बफर के चार वॉल्यूम जोड़ें जैसा कि पहले दिखाया गया है। सतह पर तैरने वाले को त्यागने के बाद, सेल वॉश बफर और सेंट्रीफ्यूज के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को एक बार फिर से निलंबित करें।सेंट्रीफ्यूजेशन के अंत में, सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और एक मिलीलीटर सेल वॉश बफर में गोली को फिर से निलंबित करें। एक अन्य सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में निलंबन के 18 माइक्रोलीटर लें और दो माइक्रोलीटर एक्रिडीन ऑरेंज प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला घोल जोड़ें। एक गिनती कक्ष स्लाइड में इस दाग वाले घोल के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें।एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके सेल संख्या और व्यवहार्यता का मूल्यांकन करें। एकल कोशिका कार्डियक निलंबन में कोशिका के टुकड़े देखे गए। प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग ने प्रभावी रूप से सेल टुकड़ों और सेल क्लंपिंग के अनुपात को कम कर दिया जिसके परिणामस्वरूप औसत सेल आकार में कमी आई।आरएनए अनुक्रमण ने सात प्रकार की प्रतिरक्षा कोशिकाओं का एक स्पष्ट पृथक्करण साबित किया जैसा कि असुरक्षित क्लस्टरिंग और कम टी-वितरित स्टोकेस्टिक पड़ोसी एम्बेडिंग द्वारा प्रदर्शित किया गया है। प्रत्येक प्रतिरक्षा कोशिका ने क्लासिक मार्करों की एक उच्च अभिव्यक्ति दिखाई। अधूरे पाचन से बचने के लिए हृदय के ऊतकों को काफी छोटा काटने की आवश्यकता होती है, जिससे सेल निलंबन में बहुत सारे सेल गांठ हो जाते हैं।इस प्रोटोकॉल द्वारा प्राप्त एकल सेल निलंबन को प्राथमिक सेल संस्कृति के प्रवाह विश्लेषण में आगे लागू किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल मायोकार्डियल संक्रमण के माइक्रोएन्वायरमेंट पर अध्ययन को लाभ पहुंचाता है, जो शोधकर्ताओं को हृदय के ऊतकों से परे देखने और मायोकार्डियल संक्रमण को एक व्यवस्थित समस्या के रूप में मानने में मदद कर सकता है।

Research

JoVE Journal

Medicine

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Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

वयस्क चूहे से एट्रियल मायोसाइट्स का अलगाव

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

माउस में Myocardial इन्फेक्शन का अध्ययन करने के लिए एक Cryoinjury मॉडल

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

Establishing a Swine Model of Post-myocardial Infarction Heart Failure for Stem Cell Treatment

स्टेम सेल उपचार के लिए पोस्ट-मायोकार्डियल इन्फेक्शन हार्ट फेलियर का एक सूअर मॉडल स्थापित करना

Although advances have been achieved in the treatment of heart failure (HF) following myocardial infarction (MI), HF following MI remains one of the major ...

Post-Myocardial Infarction Heart Failure in Closed-chest Coronary Occlusion/Reperfusion Model in G&#246;ttingen Minipigs and Landrace Pigs

Post-Myocardial Infarction Heart Failure in Closed-chest Coronary Occlusion/Reperfusion Model in GÃƒÆ’Ã‚Â¶ttingen Minipigs and Landrace Pigs

बाद Myocardial Infarction हार्ट विफलता बंद-छाती कोरोनरी Occlusion/Reperfusion मॉडल में गोटिंगेन Minipigs और Landrace सूअरों

The development of heart failure is the most powerful predictor of long-term mortality in patients surviving acute myocardial infarction (MI). There is an ...