Name: preparation of a non-cardiomyocyte cell suspension for single-cell rna sequencing from a post-myocardial infarction adult mouse heart
Uploaded: 2023-02-03T12:40:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di scienze naturali della provincia di Zhejiang (LQ22H020010).

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio presso l'Università di Zhejiang e sono stati approvati dal Comitato consultivo per gli animali dell'Università di Zhejiang.
1. Chirurgia della legatura dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (legatura LAD)
NOTA: sono stati utilizzati come modelli topi maschi C57BL / 6J di otto settimane. I cuori sono stati racco...

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	<li>Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction.">Acute myocardial infarction.</a> Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).</li><li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incident+heart+failure+in+patients+with+coronary+artery+disease+undergoing+percutaneous+coronary+intervention.">Incident heart failure in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 727727 (2021).</li><li>Frangogiannis, N. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li><li>Massaia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+gene+expression+to+understand+the+dynamic+architecture+of+the+heart.">Single cell gene expression to understand the dynamic architecture of the heart.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 167 (2018).</li><li>Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+to+explore+immune+cell+heterogeneity.">Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity.</a> Nature Reviews. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+of+the+healthy+and+diseased+heart+reveals+cytoskeleton-associated+protein+4+as+a+new+modulator+of+fibroblasts+activation.">Single-cell sequencing of the healthy and diseased heart reveals cytoskeleton-associated protein 4 as a new modulator of fibroblasts activation.</a> Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).</li><li>Garcia-Flores, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+from+the+human+placenta.">Preparation of single-cell suspensions from the human placenta.</a> Nature Protocols. , (2022).</li><li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+of+immunolabeled+cell+types+from+adult+rat+brain.">FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).</li><li>Rheinl&#228;ndera, A., Schravenab, B., Bommhardt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD45+in+human+physiology+and+clinical+medicine.">CD45 in human physiology and clinical medicine.</a> Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).</li><li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+to+dissect+the+immunological+network+of+autoimmune+myocarditis.">Single-cell RNA sequencing to dissect the immunological network of autoimmune myocarditis.</a> Circulation. 142 (4), 384-400 (2020).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14, 935-936 (2017).</li></ol>

Questo articolo mirava a descrivere un protocollo per isolare singoli non cardiomiociti da cuori di topo post MI. Il protocollo può essere applicato per isolare diversi tipi di cellule nel microambiente post-MI con alta qualità, comprese le cellule immunitarie, le cellule endoteliali e i fibroblasti. Tre fattori essenziali sono cruciali per ottenere una sospensione cellulare di alta qualità per il sequenziamento di singole cellule. Il primo è l'impostazione della digestione enzimatica. È importante controllare il te...

L'infarto miocardico (IM) è una delle malattie cardiovascolari più comuni e la sua mortalità aumenta in tutto il mondo1. L'infarto miocardico è causato da un insufficiente apporto di sangue al miocardio circostante, che può essere il risultato di un blocco dell'arteria coronaria che si verifica con la rottura della placca aterosclerotica. Sebbene l'intervento coronarico percutaneo (PCI) abbia ridotto i tassi di mortalità dei pazienti con infarto miocardico acuto, l'alta prevalenza di insufficienza cardiaca post infarto miocardico rimane un problema2. La fisiopatologia chiave alla base dell'insufficienza cardiaca post-MI è la risposta compensativa del corpo alle lesioni cardiache, che comporta la sostituzione del muscolo cardiaco morto con cicatrici fibrotiche non contrattili. Queste risposte adattative si basano significativamente sull'infiammazione locale mediata dalle interazioni tra più tipi di cellule e cellule del tessuto cardiaco, e questa infiammazione è ora considerata come un potenziale bersaglio terapeutico per ridurre la formazione di cicatrici fibrotiche e, quindi, proteggere dall'insufficienza cardiaca post-MI 3,4. È interessante notare che il microambiente nel sito dell'infarto sperimenta una transizione dipendente dal tempo nei tipi di cellule infiltranti e funzioni in diversi stadi di MI 1,5. Molti studi hanno dimostrato che i non-cardiomiociti (ad esempio, cellule immunitarie, fibroblasti e cellule endoteliali) svolgono un ruolo centrale nell'infiammazione post-MI e nella riparazione dei tessuti 5,6. Negli ultimi anni, il sequenziamento a singola cellula è stato ampiamente utilizzato come potente strumento per chiarire i coinvolgimenti e le funzioni dei non cardiomiociti nell'ambiente post-MI 7,8. Ciò fornisce approfondimenti sulla fisiopatologia della lesione e riparazione post-MI e sullo sviluppo di potenziali terapie contro l'insufficienza cardiaca post-MI.
Il sequenziamento dell'RNA ad alto rendimento (RNA-Seq) è una tecnica utilizzata per studiare interi trascrittomi in grande dettaglio utilizzando il sequenziamento di nuova generazione (NGS)7,8,9. Recentemente, lo sviluppo di scRNA-Seq ha rivoluzionato il campo della ricerca biomedica. Rispetto al sequenziamento di massa convenzionale, scRNA-Seq analizza i profili di espressione genica e l'eterogeneità trascrizionale a livello di singola cellula 7,8. Questa tecnica promuove significativamente la ricerca della fisiopatologia cellulare di MI 9,10 identificando diversi tipi di cellule circolanti nel microambiente post-MI e scoprendo l'interazione tra cardiomiociti e non cardiomiociti. Questi risultati contribuiscono ulteriormente a scoprire nuovi bersagli terapeutici per l'insufficienza cardiaca post-infarto miocardico. In generale, l'esperimento post-MI basato su scRNA-seq comprende tre sezioni principali: (1) la creazione di un modello animale post-MI; 2) la preparazione della sospensione cellulare; e (3) sequenziamento del campione e analisi dei dati. In particolare, la preparazione della sospensione cellulare è il passo più critico nella preparazione dell'esperimento scRNA-Seq perché la qualità della sospensione cellulare determina l'accuratezza dei risultati.
Questo protocollo è progettato per estrarre una sospensione di cellule non cardiomiocitarie dal tessuto cardiaco post-MI; Significativamente, sono inclusi i dettagli specifici per mantenere la vitalità e la risoluzione delle cellule. Nel frattempo, le attrezzature utilizzate in questo protocollo, come kit chirurgici per topi, ventilatori per roditori e centrifughe, possono essere trovate nella maggior parte dei centri di sperimentazione animale e dei laboratori biomedici e, quindi, il costo dell'esperimento di questo protocollo è relativamente basso. Inoltre, se si considerano i punti temporali e i siti di infarto come variabili, questo protocollo può essere applicato per simulare una vasta gamma di scenari clinici, in particolare per le complicanze post-infarto.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Acridine Orange / Propidium Iodide Stain</td>
			<td>Logos biosystems</td>
			<td>F23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated&#160;Cell&#160;Counter</td>
			<td>Logos biosystems</td>
			<td>L20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G5001</td>
			<td>Cytoprotective effect</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Slides</td>
			<td>Logos biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Digestive enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693</td>
			<td>Digestive enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Prevent cell clumping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;40&#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>Remove cell clumps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;70&#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>Remove undigested tissue and clumps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor</td>
			<td>OU QING SI</td>
			<td>10054963976859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>FST</td>
			<td>12061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F14012-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic Scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S11036-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3702-120ml</td>
			<td>Remove red blood cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rib Retractor</td>
			<td>FST</td>
			<td>17005-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Ventilator</td>
			<td>Harvard</td>
			<td>730043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Solvent&#160;solution of enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Scissor</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S14014-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a non-cardiomyocyte cell suspension for single-cell rna sequencing from a post-myocardial infarction adult mouse heart

L'infarto miocardico (IM) è una delle malattie cardiovascolari più comuni, con un aumento della mortalità in tutto il mondo. I non cardiomiociti rappresentano oltre la metà della popolazione totale di cellule cardiache e contribuiscono alle compensazioni adattative in caso di lesioni miocardiche, comprese le risposte infiammatorie, la riparazione dei tessuti e la formazione di cicatrici. Per studiare il microambiente cardiaco post-MI, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) è ampiamente utilizzato per identificare diversi tipi di cellule cardiache e comunicazioni intercellulari. Tra le procedure di preparazione del campione di scRNA-seq, la preparazione della sospensione cellulare è uno dei passaggi più critici, perché la vitalità cellulare può influenzare la qualità dei risultati di scRNA-seq. Pertanto, abbiamo progettato un protocollo sperimentale per preparare una sospensione di cellule non cardiomiocitarie da cuori di topo post-MI con una particolare attenzione al miglioramento della vitalità cellulare scegliendo enzimi digestivi lievi, controllando il tempo di digestione e applicando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). Infine, abbiamo isolato le cellule CD45+ dalla sospensione di cellule non cardiomiocitarie ottenuta attraverso questo protocollo, e quindi abbiamo eseguito scRNA-seq.

Una sospensione unicellulare ad alta vitalità è stata ottenuta implementando la sezione 2 di questo protocollo. Tuttavia, i frammenti cellulari potevano ancora essere osservati (Figura 1A); quindi, è stata eseguita la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) per migliorare ulteriormente la qualità16. Dopo FACS, la dimensione media della cellula si riduce da 9,6 μm a 9,1 μm ( Tabella 1), il che suggerisce che la proporzione di framm...

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Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart

Qui, descriviamo un protocollo per isolare una quantità sufficiente di singoli non cardiomiociti con elevata vitalità da un cuore di topo post-infarto miocardico (MI). Questo può essere utilizzato per il successivo sequenziamento di singole cellule, l'analisi della citometria a flusso e la coltura cellulare primaria.

Preparazione di una sospensione di cellule non cardiomiocitarie per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula da un cuore di topo adulto post-infarto miocardico

Myocardial infarction (MI) is one of the most common cardiovascular diseases, with increasing mortality worldwide. Non-cardiomyocytes account for more ...

Il nostro protocollo garantisce sia la vitalità della cella che l'efficienza di isolamento della sospensione a singola cellula a costi relativamente bassi. I costi relativamente bassi e i requisiti per le attrezzature di laboratorio sono i principali vantaggi di questa tecnica. Il sequenziamento a singola cellula rivela l'eterogeneità dei non cardiomiociti nella fisiopatologia cardiaca e fornisce anche idee per studi di base e clinici per le malattie cardiache.Questo protocollo può essere utilizzato in questi studi sull'ambiente cardiovascolare post-MI come il coinvolgimento delle cellule immunitarie. Per i preparativi per la prima volta, suggerisco di prestare particolare attenzione alla pepsina campione e al tempo di digestione. Una volta che i tamponi e le soluzioni sono stati preparati come descritto nel manoscritto, posizionare un topo eutanasia che ha avuto un infarto miocardico due settimane prima in posizione supina sul tavolo chirurgico.Fissare gli arti posteriori con del nastro adesivo. Per asportare il cuore, spruzzare il corpo con etanolo al 70%. Fai un'incisione verticale attraverso la pelle addominale e i muscoli evitando il fegato.Senza perforare il cuore, aprire con attenzione il torace e abbondante ventricolo sinistro con una soluzione PBS pre-fredda fino a quando il fluido di perfusione non diventa incolore. Usando una pinza, sollevare delicatamente il cuore e tagliare via i tessuti in eccesso attaccati al suo esterno con forbici oftalmiche. Posizionare il cuore in un millilitro di PBS pre-raffreddato in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri.Trasferire il cuore in un pozzo di una piastra da 24 pozzetti posta sul ghiaccio. Pipet 150 microlitri del tampone di dissociazione cardiaca nel pozzo e tagliare il cuore in pezzi di dimensioni millimetriche usando le forbici. Trasferire il tessuto cardiaco tritato in una provetta da centrifuga da 15 millilitri contenente cinque millilitri del tampone di dissociazione tissutale.Posizionare il tubo in uno shaker alternativo termostatico. Pipet la sospensione su e giù 10 volte ogni 20 minuti. Per rimuovere grumi e tessuto non digerito, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri utilizzando 25 millilitri di tampone di lavaggio cellulare.Risciacquare il tubo della centrifuga e il filtro cellulare. Quindi, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri per rimuovere ulteriori grumi di cellule. Centrifugare la sospensione cellulare filtrata a 300 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Risospendere il campione cellulare in cinque volumi di tampone di lisi dei globuli rossi e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Ora, aggiungere quattro volumi del tampone di lavaggio cellulare nella sospensione cellulare e centrifugare come dimostrato in precedenza. Dopo aver eliminato il surnatante, risospendere le cellule in 10 millilitri del tampone di lavaggio cellulare e centrifugare nuovamente.Al termine della centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di tampone di lavaggio cellulare. Prendere 18 microlitri della sospensione in un altro tubo da centrifuga e aggiungere due microlitri di soluzione colorante di ioduro di acridina arancione propidio. Aggiungere 10 microlitri di questa soluzione macchiata in un vetrino della camera di conteggio.Valutare il numero di celle e la vitalità utilizzando un contatore automatico delle celle. Sono stati osservati frammenti cellulari nella sospensione cardiaca monocellulare. La selezione cellulare attivata dalla fluorescenza ha ridotto efficacemente la proporzione dei frammenti cellulari e l'aggregazione cellulare con conseguente diminuzione delle dimensioni medie delle cellule.Il sequenziamento dell'RNA ha dimostrato un'ovvia separazione di sette tipi di cellule immunitarie, come dimostrato dal clustering non supervisionato e dall'incorporazione stocastica ridotta del vicino distribuito a T. Ogni cellula immunitaria ha mostrato un'alta espressione di marcatori classici. Il tessuto cardiaco deve essere tagliato abbastanza piccolo da evitare una digestione incompleta, che porta a molti grumi cellulari nella sospensione cellulare.La sospensione monocellulare ottenuta da questo protocollo può essere ulteriormente applicata nell'analisi del flusso di colture cellulari primarie. Questo protocollo avvantaggia gli studi sul microambiente dell'infezione miocardica, che possono aiutare i ricercatori a guardare oltre i tessuti cardiaci e considerare l'infezione miocardica come un problema sistematico.

Research

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