Name: preparation of a non-cardiomyocyte cell suspension for single-cell rna sequencing from a post-myocardial infarction adult mouse heart
Uploaded: 2023-02-03T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelos Fundos de Ciências Naturais da Província de Zhejiang (LQ22H020010).

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes para o cuidado e uso de animais de laboratório na Universidade de Zhejiang e foram aprovados pelo Comitê Consultivo Animal da Universidade de Zhejiang.
1. Cirurgia de ligadura da artéria coronária descendente anterior (ligadura da ADA)
NOTA: Camundongos C57BL/6J machos com oito semanas de idade foram utilizados como modelos. Os corações foram colhidos 2 semanas após o IM. A ciru...

<ol>
	<li>Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction.">Acute myocardial infarction.</a> Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).</li><li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incident+heart+failure+in+patients+with+coronary+artery+disease+undergoing+percutaneous+coronary+intervention.">Incident heart failure in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 727727 (2021).</li><li>Frangogiannis, N. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li><li>Massaia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+gene+expression+to+understand+the+dynamic+architecture+of+the+heart.">Single cell gene expression to understand the dynamic architecture of the heart.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 167 (2018).</li><li>Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+to+explore+immune+cell+heterogeneity.">Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity.</a> Nature Reviews. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+of+the+healthy+and+diseased+heart+reveals+cytoskeleton-associated+protein+4+as+a+new+modulator+of+fibroblasts+activation.">Single-cell sequencing of the healthy and diseased heart reveals cytoskeleton-associated protein 4 as a new modulator of fibroblasts activation.</a> Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).</li><li>Garcia-Flores, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+from+the+human+placenta.">Preparation of single-cell suspensions from the human placenta.</a> Nature Protocols. , (2022).</li><li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+of+immunolabeled+cell+types+from+adult+rat+brain.">FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).</li><li>Rheinl&#228;ndera, A., Schravenab, B., Bommhardt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD45+in+human+physiology+and+clinical+medicine.">CD45 in human physiology and clinical medicine.</a> Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).</li><li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+to+dissect+the+immunological+network+of+autoimmune+myocarditis.">Single-cell RNA sequencing to dissect the immunological network of autoimmune myocarditis.</a> Circulation. 142 (4), 384-400 (2020).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14, 935-936 (2017).</li></ol>

O objetivo deste artigo foi descrever um protocolo para isolar cardiomiócitos únicos de corações de camundongos pós-IM. O protocolo pode ser aplicado para isolar diferentes tipos de células no microambiente pós-IM com alta qualidade, incluindo células imunes, células endoteliais e fibroblastos. Três fatores essenciais são cruciais para a obtenção de uma suspensão celular de alta qualidade para o sequenciamento de uma única célula. A primeira é a configuração da digestão enzimática. É importante cont...

O infarto do miocárdio (IAM) é uma das doenças cardiovasculares mais comuns e sua mortalidade está aumentando em todo omundo1. O IM é causado por um suprimento sanguíneo insuficiente para o miocárdio circundante, que pode ser resultado de um bloqueio da artéria coronária que ocorre com a ruptura da placa aterosclerótica. Embora a intervenção coronária percutânea (ICP) tenha reduzido as taxas de mortalidade de pacientes com IAM agudo, a alta prevalência de insuficiência cardíaca pós-IAM continua sendo um problema2. A principal fisiopatologia subjacente à insuficiência cardíaca pós-IM é a resposta compensatória do organismo às lesões cardíacas, que envolve a substituição do músculo cardíaco morto por cicatrizes fibróticas não contráteis. Essas respostas adaptativas dependem significativamente da inflamação local mediada pelas interações entre múltiplos tipos celulares e células do tecido cardíaco, e essa inflamação é atualmente considerada como um potencial alvo terapêutico para reduzir a formação de cicatriz fibrótica e, assim, proteger contra a insuficiência cardíacapós-IAM3,4. Curiosamente, o microambiente no local do infarto experimenta uma transição tempo-dependente nos tipos e funções celulares infiltrantes em diferentes estágios do IM 1,5. Muitos estudos têm demonstrado que os não-cardiomiócitos (por exemplo, células imunes, fibroblastos e células endoteliais) desempenham papéis centrais na inflamação pós-infarto agudo do miocárdio e no reparo tecidual 5,6. Nos últimos anos, o sequenciamento unicelular tem sido amplamente utilizado como uma poderosa ferramenta para elucidar o envolvimento e as funções de não-cardiomiócitos no microambiente pós-IM7,8. Isso fornece informações sobre a fisiopatologia da lesão e reparo pós-IM e o desenvolvimento de terapias potenciais contra a insuficiência cardíaca pós-IAM.
O sequenciamento de RNA de alto rendimento (RNA-Seq) é uma técnica usada para estudar transcriptomas inteiros em grande detalhe usando sequenciamento de próxima geração (NGS)7,8,9. Recentemente, o desenvolvimento do scRNA-Seq revolucionou o campo da pesquisa biomédica. Em comparação com o sequenciamento convencional em massa, o scRNA-Seq analisa perfis de expressão gênica e heterogeneidade transcricional em nível unicelular 7,8. Essa técnica promove significativamente a pesquisa da fisiopatologia celular do IM 9,10 ao identificar diferentes tipos celulares circulantes no microambiente pós-IM e desvendar a interação entre cardiomiócitos e não cardiomiócitos. Esses achados contribuem ainda mais para a descoberta de novos alvos terapêuticos para a insuficiência cardíaca pós-IAM. Em geral, o experimento pós-MI baseado em scRNA-seq inclui três seções principais: (1) o estabelecimento do modelo animal pós-IM; (2) a preparação da suspensão celular; e (3) sequenciamento das amostras e análise dos dados. Notavelmente, a preparação da suspensão celular é a etapa mais crítica na preparação do experimento scRNA-Seq, pois a qualidade da suspensão celular determina a precisão dos resultados.
Este protocolo é projetado para extrair uma suspensão de células não-cardiomiócitos do tecido cardíaco pós-IM; Significativamente, os detalhes específicos para manter a viabilidade e resolução da célula são incluídos. Enquanto isso, os equipamentos utilizados nesse protocolo, como kits cirúrgicos para camundongos, ventiladores de roedores e centrífugas, podem ser encontrados na maioria dos centros de experimentação animal e laboratórios biomédicos, e, portanto, o custo do experimento desse protocolo é relativamente baixo. Além disso, se considerados os momentos e locais de infarto como variáveis, esse protocolo pode ser aplicado para simular uma ampla gama de cenários clínicos, especialmente para as complicações pós-IM.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Acridine Orange / Propidium Iodide Stain</td>
			<td>Logos biosystems</td>
			<td>F23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated&#160;Cell&#160;Counter</td>
			<td>Logos biosystems</td>
			<td>L20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G5001</td>
			<td>Cytoprotective effect</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Slides</td>
			<td>Logos biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Digestive enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693</td>
			<td>Digestive enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Prevent cell clumping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;40&#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>Remove cell clumps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;70&#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>Remove undigested tissue and clumps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor</td>
			<td>OU QING SI</td>
			<td>10054963976859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>FST</td>
			<td>12061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F14012-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic Scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S11036-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3702-120ml</td>
			<td>Remove red blood cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rib Retractor</td>
			<td>FST</td>
			<td>17005-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Ventilator</td>
			<td>Harvard</td>
			<td>730043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Solvent&#160;solution of enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Scissor</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S14014-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a non-cardiomyocyte cell suspension for single-cell rna sequencing from a post-myocardial infarction adult mouse heart

O infarto do miocárdio (IAM) é uma das doenças cardiovasculares mais comuns, com mortalidade crescente em todo o mundo. Os não-cardiomiócitos representam mais da metade da população total de células cardíacas e contribuem para compensações adaptativas em caso de lesão miocárdica, incluindo respostas inflamatórias, reparo tecidual e formação de cicatrizes. Para estudar o microambiente cardíaco pós-IM, o sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) é amplamente utilizado para identificar diferentes tipos de células cardíacas e comunicações intercelulares. Dentre os procedimentos de preparação da amostra de scRNA-seq, o preparo da suspensão celular é uma das etapas mais críticas, pois a viabilidade celular pode afetar a qualidade dos resultados do scRNA-seq. Portanto, projetamos um protocolo experimental para preparar uma suspensão de células não-cardiomiócitos de corações de camundongos pós-IM com um foco extra em melhorar a viabilidade celular através da escolha de enzimas digestivas leves, controle do tempo de digestão e aplicação de classificação celular ativada por fluorescência (FACS). Finalmente, isolamos as células CD45+ da suspensão de células não-cardiomiócitos obtidas através deste protocolo e, em seguida, realizamos scRNA-seq.

Uma suspensão unicelular com alta vitalidade foi obtida com a aplicação da seção 2 deste protocolo. No entanto, fragmentos celulares ainda puderam ser observados (Figura 1A); portanto, a classificação celular ativada por fluorescência (FACS) foi realizada para melhorar ainda mais a qualidade16. Após o FACS, o tamanho médio das células diminui de 9,6 μm para 9,1 μm ( Tabela 1), o que sugere que a proporção de fragmentos celulares pode se...

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Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart

Aqui, descrevemos um protocolo para isolar uma quantidade suficiente de cardiomiócitos únicos não cardiomiócitos com alta viabilidade de um coração de camundongo pós-infarto do miocárdio (IM). Isso pode ser usado para sequenciamento subsequente de célula única, análise de citometria de fluxo e cultura de células primárias.

Preparação de uma Suspensão de Células Não-Cardiomiócitos para Sequenciamento de RNA de Célula Única de um Coração de Camundongo Adulto Pós-Infarto do Miocárdio

Myocardial infarction (MI) is one of the most common cardiovascular diseases, with increasing mortality worldwide. Non-cardiomyocytes account for more ...

Nosso protocolo garante a viabilidade celular e a eficiência de isolamento da suspensão de célula única a custos relativamente baixos. Os custos relativamente baixos e a exigência de equipamentos laboratoriais são as principais vantagens dessa técnica. O sequenciamento unicelular revela a heterogeneidade dos não cardiomiócitos na fisiopatologia cardíaca, além de fornecer ideias para estudos básicos e clínicos para doenças cardíacas.Esse protocolo pode ser utilizado nesses estudos sobre o ambiente cardiovascular pós-IAM, como o envolvimento de células imunes. Para preparações de primeira vez, sugiro que atenção extra deve ser dada à amostra de pepsina e tempo de digestão. Uma vez preparados os tampões e as soluções conforme descrito no manuscrito, colocar um camundongo eutanasiado que teve um infarto do miocárdio duas semanas antes em posição supina sobre a mesa cirúrgica.Fixe os membros posteriores com fita adesiva. Para excisar o coração, borrife o corpo com etanol 70%. Faça uma incisão vertical através da pele e músculos abdominais, evitando o fígado.Sem puncionar o coração, abra cuidadosamente o tórax e profuse o ventrículo esquerdo com solução PBS pré-resfriante até que o fluido de perfusão fique incolor. Usando pinças, levante suavemente o coração e corte o excesso de tecidos presos ao seu exterior com tesouras oftálmicas. Coloque o coração em um mililitro de PBS pré-resfriado em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Transfira o coração para um poço de uma placa de 24 poços colocada no gelo. Pipetar 150 microlitros do tampão de dissociação cardíaca no poço e cortar o coração em pedaços de um milímetro usando tesoura. Transfira o tecido cardíaco picado para um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo cinco mililitros do tampão de dissociação do tecido.Coloque o tubo em um agitador alternativo termostático. Pipetar a suspensão para cima e para baixo 10 vezes a cada 20 minutos. Para remover aglomerados e tecido não digerido, filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 70 micrômetros usando 25 mililitros de tampão de lavagem celular.Enxágue o tubo da centrífuga e o filtro celular. Em seguida, filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 40 micrômetros para remover mais aglomerados celulares. Centrifugar a suspensão da célula filtrada a 300 x g durante cinco minutos a quatro graus Celsius.Ressuspender a amostra celular em cinco volumes de tampão de lise eritrocitária e incubar por cinco minutos à temperatura ambiente. Agora, adicione quatro volumes do tampão de lavagem celular em suspensão e centrífuga celular, conforme demonstrado anteriormente. Após descartar o sobrenadante, ressuspenda as células em 10 mililitros do tampão de lavagem celular e centrífuga novamente.Ao final da centrifugação, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão de lavagem celular. Pegue 18 microlitros da suspensão em outro tubo de centrífuga e adicione dois microlitros de solução corante de iodeto de propídio laranja acridina. Adicione 10 microlitros desta solução corada a uma lâmina da câmara de contagem.Avalie o número de células e a viabilidade usando um contador automático de células. Fragmentos celulares foram observados na suspensão cardíaca unicelular. A classificação celular ativada por fluorescência efetivamente reduziu a proporção de fragmentos celulares e aglomeração celular, resultando na diminuição do tamanho médio das células.O sequenciamento de RNA provou uma separação óbvia de sete tipos de células imunes, como demonstrado pelo agrupamento não supervisionado e pela incorporação reduzida de vizinhos estocásticos distribuídos por T. Cada célula imune apresentou alta expressão de marcadores clássicos. O tecido cardíaco precisa ser cortado pequeno o suficiente para evitar a digestão incompleta, o que leva a muitos nódulos celulares na suspensão celular.A suspensão unicelular obtida por este protocolo pode ser posteriormente aplicada na análise de fluxo de cultura celular primária. Esse protocolo beneficia os estudos sobre o microambiente da infecção miocárdica, o que pode ajudar os pesquisadores a olhar além dos tecidos cardíacos e considerar a infecção miocárdica como um problema sistemático.

Research

JoVE Journal

Medicine

Myocardial Infarction and Functional Outcome Assessment in Pigs

Infarto do Miocárdio e Avaliação de Resultados Funcional em porcos

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One ...

Medicina

A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion

Um método modificado para heterotópico Rato coração transplante

Mice are often used as heart transplant donors and recipients in studies of transplant immunology due to the wide range of transgenic mice and reagents ...

An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

Um Sistema de coração isolado para Grandes Modelos Animais

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

A ligação permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda em Ratos: Um Modelo de Remodelação pós-infarto do miocárdio e insuficiência cardíaca

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Sequenciamento profundo imparcial de Vírus RNA de amostras clínicas

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Um método eficiente de crivagem para isolar intactos glomérulos do rim de rato adulto

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Isolamento de miócitos atriais de camundongos adultos

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

Um modelo Crioferimento para estudar infarto do miocárdio no mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

Establishing a Swine Model of Post-myocardial Infarction Heart Failure for Stem Cell Treatment

Estabelecendo um modelo suíno de insuficiência cardíaca pós-miocárdio para tratamento de células-tronco

Although advances have been achieved in the treatment of heart failure (HF) following myocardial infarction (MI), HF following MI remains one of the major ...

Post-Myocardial Infarction Heart Failure in Closed-chest Coronary Occlusion/Reperfusion Model in G&#246;ttingen Minipigs and Landrace Pigs

Insuficiência cardíaca pós-miocárdio em oclusão coronariana de peito fechado/modelo de reperfusão em Miniporcos de Göttingen e Poros landrace

The development of heart failure is the most powerful predictor of long-term mortality in patients surviving acute myocardial infarction (MI). There is an ...