Name: preparation of a non-cardiomyocyte cell suspension for single-cell rna sequencing from a post-myocardial infarction adult mouse heart
Uploaded: 2023-02-03T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart at JoVE.com

Bu çalışma Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Fonları (LQ22H020010) tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneyler, Zhejiang Üniversitesi'ndeki laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için yönergelere uygun olarak yürütülmüş ve Zhejiang Üniversitesi'ndeki Hayvan Danışma Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Sol ön inen koroner arter ligasyonu (LAD ligasyonu) cerrahisi
NOT: Model olarak sekiz haftalık erkek C57BL/6J fareler kullanılmıştır. Sol ön inen koroner arter ligasyon cerrahisi daha önce tarif edildiği ve gös...

<ol>
	<li>Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction.">Acute myocardial infarction.</a> Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).</li><li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incident+heart+failure+in+patients+with+coronary+artery+disease+undergoing+percutaneous+coronary+intervention.">Incident heart failure in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 727727 (2021).</li><li>Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+response+in+myocardial+injury,+repair,+and+remodelling.">The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling.</a> Nature Reviews. Cardiology. 11 (5), 255-265 (2014).</li><li>Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+revisited:+Inflammation+versus+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction.">Inflammation revisited: Inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444 (2014).</li><li>Tzahor, E., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+coalition+to+heal-the+impact+of+the+cardiac+microenvironment.">A coalition to heal-the impact of the cardiac microenvironment.</a> Science. 377 (6610), 4443 (2022).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li><li>Massaia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+gene+expression+to+understand+the+dynamic+architecture+of+the+heart.">Single cell gene expression to understand the dynamic architecture of the heart.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 167 (2018).</li><li>Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+to+explore+immune+cell+heterogeneity.">Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity.</a> Nature Reviews. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).</li><li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+reveals+the+temporal+diversity+and+dynamics+of+cardiac+immunity+after+myocardial+infarction.">Single-cell RNA sequencing reveals the temporal diversity and dynamics of cardiac immunity after myocardial infarction.</a> Small Methods. 6 (3), 2100752 (2022).</li><li>Tombor, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+sequencing+reveals+endothelial+plasticity+with+transient+mesenchymal+activation+after+myocardial+infarction.">Single cell sequencing reveals endothelial plasticity with transient mesenchymal activation after myocardial infarction.</a> Nature Communications. 12 (1), 681 (2021).</li><li>Virag, J. A., Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+artery+ligation+and+intramyocardial+injection+in+a+murine+model+of+infarction.">Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2581 (2011).</li><li>Reichard, A., Asosingh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+preparing+a+single+cell+suspension+from+solid+tissues+for+flow+cytometry.">Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2018).</li><li>Gladka, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+of+the+healthy+and+diseased+heart+reveals+cytoskeleton-associated+protein+4+as+a+new+modulator+of+fibroblasts+activation.">Single-cell sequencing of the healthy and diseased heart reveals cytoskeleton-associated protein 4 as a new modulator of fibroblasts activation.</a> Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).</li><li>Garcia-Flores, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+from+the+human+placenta.">Preparation of single-cell suspensions from the human placenta.</a> Nature Protocols. , (2022).</li><li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+of+immunolabeled+cell+types+from+adult+rat+brain.">FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).</li><li>Rheinl&#228;ndera, A., Schravenab, B., Bommhardt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD45+in+human+physiology+and+clinical+medicine.">CD45 in human physiology and clinical medicine.</a> Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).</li><li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+to+dissect+the+immunological+network+of+autoimmune+myocarditis.">Single-cell RNA sequencing to dissect the immunological network of autoimmune myocarditis.</a> Circulation. 142 (4), 384-400 (2020).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14, 935-936 (2017).</li></ol>

Bu makalede, MI sonrası tek kardiyomiyosit olmayan kardiyomiyositleri fare kalplerinden izole etmek için bir protokolün tanımlanması amaçlanmıştır. Protokol, MI sonrası mikro ortamdaki farklı hücre tiplerini, bağışıklık hücreleri, endotel hücreleri ve fibroblastlar dahil olmak üzere yüksek kalitede izole etmek için uygulanabilir. Tek hücreli dizileme için yüksek kaliteli bir hücre süspansiyonu elde etmek için üç temel faktör çok önemlidir. Birincisi, enzimatik sindirimin ayarlanmasıdır....

Miyokard enfarktüsü (MI) en sık görülen kardiyovasküler hastalıklardan biridir ve mortalitesi tüm dünyada artmaktadır1. MI, aterosklerotik plak rüptürü ile ortaya çıkan koroner arter tıkanıklığının bir sonucu olabilen çevredeki miyokarda yetersiz kan akışından kaynaklanır. Perkütan koroner girişim (PKG) akut MI hastalarının mortalite oranlarını azaltmış olsa da, MI sonrası kalp yetmezliği prevalansının yüksek olması bir sorun olmaya devam etmektedir2. MI sonrası kalp yetmezliğinin altında yatan anahtar patofizyoloji, ölü kalp kasının kontraktil olmayan fibrotik yara izleriyle değiştirilmesini içeren vücudun kalp yaralanmalarına telafi edici tepkisidir. Bu adaptif yanıtlar önemli ölçüde çoklu hücre tipleri ve kalp dokusu hücreleri arasındaki etkileşimlerin aracılık ettiği lokal inflamasyona dayanır ve bu inflamasyon şimdi fibrotik skar oluşumunu azaltmak ve böylece MI sonrası kalp yetmezliğine karşı korunmak için potansiyel bir terapötik hedef olarak kabul edilmektedir 3,4. İlginçtir ki, enfarktüs bölgesindeki mikro çevre, MI 1,5'in farklı aşamalarında sızan hücre tiplerinde ve işlevlerinde zamana bağlı bir geçiş yaşar. Birçok çalışma, kardiyomiyosit olmayanların (örneğin, bağışıklık hücreleri, fibroblastlar ve endotel hücreleri) MI sonrası inflamasyon ve doku onarımında merkezi rol oynadığını göstermiştir 5,6. Son yıllarda, tek hücreli dizileme, MI sonrası mikroençevre 7,8'de kardiyomiyosit olmayanların tutulumlarını ve fonksiyonlarını aydınlatmak için güçlü bir araç olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu, post-MI yaralanma ve onarımının patofizyolojisi ve post-MI kalp yetmezliğine karşı potansiyel tedavilerin geliştirilmesi hakkında fikir verir.
Yüksek verimli RNA dizilimi (RNA-Seq), yeni nesil dizileme (NGS)7,8,9 kullanarak tüm transkriptomları ayrıntılı olarak incelemek için kullanılan bir tekniktir. Son zamanlarda, scRNA-Seq'in geliştirilmesi biyomedikal araştırma alanında devrim yarattı. Geleneksel yığın dizilemesi ile karşılaştırıldığında, scRNA-Seq, gen ekspresyon profillerini ve transkripsiyonel heterojeniteyi tek hücreli seviye 7,8'de analiz eder. Bu teknik, MI sonrası mikro ortamda farklı dolaşımdaki hücre tiplerini tanımlayarak ve kardiyomiyositler ile kardiyomiyosit olmayanlar arasındaki etkileşimi ortaya çıkararak MI 9,10'un hücresel patofizyolojisinin araştırılmasını önemli ölçüde desteklemektedir. Bu bulgular ayrıca MI sonrası kalp yetmezliği için yeni terapötik hedeflerin ortaya çıkarılmasına katkıda bulunmaktadır. Genel olarak, scRNA-seq tabanlı post-MI deneyi üç ana bölümden oluşur: (1) post-MI hayvan modelinin kurulması; (2) hücre süspansiyonunun hazırlanması; ve (3) örnek sıralama ve veri analizi. Dikkat çekici bir şekilde, hücre süspansiyonunun hazırlanması, scRNA-Seq deneyinin hazırlanmasında en kritik adımdır, çünkü hücre süspansiyonunun kalitesi, sonuçların doğruluğunu belirler.
Bu protokol, MI sonrası kalp dokusundan kardiyomiyosit olmayan bir hücre süspansiyonu çıkarmak için tasarlanmıştır; Önemli ölçüde, hücre canlılığını ve çözünürlüğünü korumak için spesifik detaylar dahil edilmiştir. Bu arada, fareler için cerrahi kitler, kemirgen vantilatörleri ve santrifüjler gibi bu protokolde kullanılan ekipmanlar çoğu hayvan deney merkezinde ve biyomedikal laboratuvarda bulunabilir ve bu nedenle bu protokolün deney maliyeti nispeten düşüktür. Ayrıca, zaman noktaları ve enfarktüs bölgelerini değişkenler olarak düşünürsek, bu protokol, özellikle MI sonrası komplikasyonlar için çok çeşitli klinik senaryoları simüle etmek için uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acridine Orange / Propidium Iodide Stain</td>
			<td>Logos biosystems</td>
			<td>F23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated&#160;Cell&#160;Counter</td>
			<td>Logos biosystems</td>
			<td>L20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G5001</td>
			<td>Cytoprotective effect</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Slides</td>
			<td>Logos biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Digestive enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693</td>
			<td>Digestive enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Prevent cell clumping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;40&#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>Remove cell clumps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;70&#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>Remove undigested tissue and clumps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor</td>
			<td>OU QING SI</td>
			<td>10054963976859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>FST</td>
			<td>12061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F14012-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic Scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S11036-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3702-120ml</td>
			<td>Remove red blood cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rib Retractor</td>
			<td>FST</td>
			<td>17005-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Ventilator</td>
			<td>Harvard</td>
			<td>730043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Solvent&#160;solution of enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Scissor</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S14014-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a non-cardiomyocyte cell suspension for single-cell rna sequencing from a post-myocardial infarction adult mouse heart

Miyokard enfarktüsü (MI), tüm dünyada mortalitesi giderek artan en yaygın kardiyovasküler hastalıklardan biridir. Non-kardiyomiyositler toplam kardiyak hücre popülasyonunun yarısından fazlasını oluşturur ve enflamatuar yanıtlar, doku onarımı ve skar oluşumu dahil olmak üzere miyokard hasarı üzerine adaptif kompanzasyonlara katkıda bulunurlar. MI sonrası kardiyak mikroçevreyi incelemek için, tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq), farklı kardiyak hücre tiplerini ve hücreler arası iletişimi tanımlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. ScRNA-seq numune hazırlama prosedürleri arasında, hücre süspansiyonunun hazırlanması en kritik adımlardan biridir, çünkü hücre canlılığı scRNA-seq sonuçlarının kalitesini etkileyebilir. Bu nedenle, hafif sindirim enzimlerini seçerek, sindirim süresini kontrol ederek ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) uygulayarak hücre canlılığını iyileştirmeye odaklanarak, MI sonrası fare kalplerinden kardiyomiyosit olmayan bir hücre süspansiyonu hazırlamak için deneysel bir protokol tasarladık. Son olarak, CD45+ hücrelerini bu protokol ile elde edilen kardiyomiyosit olmayan hücre süspansiyonundan izole ettik ve daha sonra scRNA-seq uyguladık.

Bu protokolün 2. bölümü uygulanarak yüksek canlılığa sahip tek hücreli bir süspansiyon elde edildi. Bununla birlikte, hücre parçaları hala gözlenebilir (Şekil 1A); Bu nedenle, kaliteyi daha da artırmak için floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) yapılmıştır16. FACS'den sonra, ortalama hücre boyutu 9.6 μm'den 9.1 μm'ye düşer ( Tablo 1), bu da hücre parçalarının oranının FACS tarafından hücre süspansiyonu...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart at JoVE.com

Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart

Burada, miyokard enfarktüsü sonrası (MI) fare kalbinden yüksek canlılığa sahip yeterli miktarda tek kardiyomiyosit olmayan izole etmek için bir protokol açıklanmaktadır. Bu, sonraki tek hücreli dizileme, akış sitometri analizi ve birincil hücre kültürü için kullanılabilir.

Miyokard Enfarktüsü Sonrası Yetişkin Fare Kalbinden Tek Hücreli RNA Dizilimi için Kardiyomiyosit Olmayan Hücre Süspansiyonunun Hazırlanması

Myocardial infarction (MI) is one of the most common cardiovascular diseases, with increasing mortality worldwide. Non-cardiomyocytes account for more ...

Protokolümüz, nispeten düşük maliyetlerle tek hücreli süspansiyonun hem hücre canlılığını hem de izolasyon verimliliğini sağlar. Laboratuvar ekipmanı için nispeten düşük maliyetler ve gereksinimler bu tekniğin temel avantajlarıdır. Tek hücre dizilimi, kardiyak patofizyolojide kardiyomiyosit olmayanların heterojenliğini ortaya koymakta ve ayrıca kalp hastalığı için temel ve klinik çalışmalar için fikir vermektedir.Bu protokol, bağışıklık hücrelerinin tutulumu gibi MI sonrası kardiyovasküler çevre üzerine yapılan bu çalışmalarda kullanılabilir. İlk kez hazırlıklar için, örnek pepsin ve sindirim süresine ekstra dikkat gösterilmesini öneririm. Tamponlar ve çözeltiler makalede açıklandığı gibi hazırlandıktan sonra, iki hafta önce miyokard enfarktüsü olan ötenazi yapılmış bir fareyi cerrahi masaya sırtüstü pozisyonda yerleştirin.Arka bacaklarını yapışkan bant kullanarak sabitleyin. Kalbi tüketmek için, vücudunuza% 70 etanol püskürtün. Karaciğerden kaçınırken karın derisi ve kaslardan dikey bir kesi yapın.Kalbi delmeden, göğüs kafesini dikkatlice açın ve perfüzyon sıvısı renksiz çalışana kadar sol ventrikülü önceden soğutulmuş PBS çözeltisi ile doldurun. Forseps kullanarak, kalbi yavaşça kaldırın ve dış kısmına tutturulmuş fazla dokuları oftalmik makasla kesin. Kalbi, 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde bir mililitre önceden soğutulmuş PBS'ye yerleştirin.Kalbi buz üzerine yerleştirilmiş 24 kuyucuklu bir plakanın kuyusuna aktarın. Kardiyak ayrışma tamponunun 150 mikrolitresini kuyuya pipet edin ve makas kullanarak kalbi bir milimetre büyüklüğünde parçalara ayırın. Kıyılmış kalp dokusunu, beş mililitre doku ayrışma tamponu içeren 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.Tüpü termostatik pistonlu bir çalkalayıcıya yerleştirin. Süspansiyonu her 20 dakikada bir 10 kez yukarı ve aşağı doğru borulayın. Kümeleri ve sindirilmemiş dokuyu çıkarmak için, hücre süspansiyonunu 25 mililitre hücre yıkama tamponu kullanarak 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin.Santrifüj tüpünü ve hücre süzgecini durulayın. Ardından, daha fazla hücre kümesini çıkarmak için hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin. Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 300 x g'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin.Hücre örneğini beş hacim RBC lizis tamponunda tekrar askıya alın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Şimdi, daha önce gösterildiği gibi hücre süspansiyonuna ve santrifüje dört hacim hücre yıkama tamponu ekleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri hücre yıkama tamponunun 10 mililitresinde yeniden askıya alın ve bir kez daha santrifüj yapın.Santrifüjlemenin sonunda, süpernatantı atın ve peleti bir mililitre hücre yıkama tamponunda yeniden askıya alın. Başka bir santrifüj tüpünde süspansiyonun 18 mikrolitresini alın ve iki mikrolitre akridin turuncu propidyum iyodür boyama çözeltisi ekleyin. Bu lekeli çözeltinin 10 mikrolitresini bir sayım odası slaytına ekleyin.Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayılarını ve canlılığını değerlendirin. Tek hücreli kardiyak süspansiyonda hücre fragmanları gözlendi. Floresan aktive hücre sıralama, hücre parçalarının oranını ve hücre kümelenmesini etkili bir şekilde azalttı ve ortalama hücre boyutunun azalmasına neden oldu.RNA dizilimi, denetimsiz kümeleme ve azaltılmış T-dağılmış stokastik komşu gömme ile gösterildiği gibi yedi tip bağışıklık hücresinin belirgin bir şekilde ayrıldığını kanıtladı. Her bağışıklık hücresi, klasik belirteçlerin yüksek bir ekspresyonunu gösterdi. Kalp dokusunun eksik sindirimi önlemek için yeterince küçük kesilmesi gerekir, bu da hücre süspansiyonunda çok sayıda hücre topaklanmasına neden olur.Bu protokol ile elde edilen tek hücreli süspansiyon, birincil hücre kültürünün akış analizinde daha fazla uygulanabilir. Bu protokol, araştırmacıların kalp dokularının ötesine bakmalarına ve miyokard enfeksiyonunu sistematik bir problem olarak görmelerine yardımcı olabilecek miyokard enfeksiyonunun mikro ortamı üzerine yapılan çalışmalara fayda sağlar.

Research

JoVE Journal

Medicine

Myocardial Infarction and Functional Outcome Assessment in Pigs

Domuzlar miyokard enfarktüsü ve Fonksiyonel Sonuç Değerlendirmesi

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One ...

Tıp

A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion

Heterotopik Fare Kalp NAKLİ için Modifiye Yöntem

Mice are often used as heart transplant donors and recipients in studies of transplant immunology due to the wide range of transgenic mice and reagents ...

An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

Büyük Hayvan Modelleri için bir İzole Çalışma Kalp Sistemi

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

Farelerde Sol Ön İnen Koroner Arter Daimi ligasyonu: Post-miyokard Enfarktüs Remodelling ve Kalp Yetmezliği Bir Model

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Klinik Örneklerden RNA Virüs tarafsız Derin Sıralama

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Yetişkin sıçan böbrek üzerinden olduğu gibi Glomeruli yalıtmak için verimli bir eleme yöntemi

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Yetişkin fareler atriyal Miyoksit izolasyonu

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

Farede Miyokard Enfarktüsü Çalışması İçin Kriyoyaralanma Modeli

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

Establishing a Swine Model of Post-myocardial Infarction Heart Failure for Stem Cell Treatment

Kök Hücre Tedavisi Için Post-miyokard Enfarktüsü Kalp Yetmezliği Domuz Modeli Oluşturma

Although advances have been achieved in the treatment of heart failure (HF) following myocardial infarction (MI), HF following MI remains one of the major ...

Post-Myocardial Infarction Heart Failure in Closed-chest Coronary Occlusion/Reperfusion Model in G&#246;ttingen Minipigs and Landrace Pigs

Göttingen Minipigs ve Landrace Domuzlarında Kapalı Göğüs Koroner Oklüzyon/Reperfüzyon Modelinde Miyokard Sonrası Enfarktüs Kalp Yetmezliği

The development of heart failure is the most powerful predictor of long-term mortality in patients surviving acute myocardial infarction (MI). There is an ...