Plasmodiophora brassicae er det jordbårne obligatoriske biotrofiske patogen, der angriber planter fra familien Brassicaceae. Ved infektion udløser patogen udviklingen af galler på de underjordiske dele af planten, dermed navnet på sygdomsklubroden. Udviklingen af galler ledsages af meget kompleks omprogrammering.
Derfor er muligheden for at spore interne ændringer under sygdom afgørende for at forstå denne plantepatogeninteraktion. Vores protokol forbedrer billeddannelsen af komplekse, tykke og galler. Det letter visualisering af ændringer i genekspression, fysiologiske reaktioner, phytohormonbalance, sygdomsprogression, sporefordeling og lokal lignificering.
Protokollen bevarer fluorescerende proteiner i prøver, hvilket muliggør opbevaring og behandling af genstande over lang tid. Det gør det også muligt at spore biokemiske og strukturelle ændringer, der ledsager sygdomsprogression. Demonstrerer proceduren vil være Sara Blicharz, postdoktorale forsker i vores gruppe, Deeksha Singh, ph.d.-studerende fra vores laboratorium, og Kornel Michalak, ph.d.-studerende fra professor Agnieszka Bagniewska-Zadworna-gruppen ved Adam Mickiewicz University.
Begynd med at forberede plantevævet. Fjern forsigtigt jord fra rodsystemerne af clubroot-inficerede og ikke-inficerede planter. Rengør grundigt med vand og saml hypocotyler og galler i mikrocentrifugerør.
Fix prøverne i 200 til 500 mikroliter paraformaldehydfikseringsmiddel i en time ved stuetemperatur ved at anvende et konstant vakuum på 700 millibar ved hjælp af en vakuumpumpe. Sørg for, at objektet er helt nedsænket i paraformaldehydopløsningen. Brug 4% agarose til indlejring af ikke-inficerede hypocotyler og inficerede galler.
Kog opløsningen for at opløse agarose og hæld den, når den køler ned, mens den stadig er tyktflydende. Tør genstanden lidt på et væv i et par sekunder for at fjerne overskydende paraformaldehyd. Brug tandstikkere eller tang til at indlejre og orientere planteobjektet i agarose omhyggeligt.
For at forhindre skrå sektioner skal du sikre dig, at objektet er orienteret og støbt korrekt, så dets akse er vinkelret på vibrationsbladets plan. For at fremskynde agarosestørkningen skal du placere en petri- eller multikulturplade ved fire grader Celsius i 10 minutter. Brug et blad til omhyggeligt at skære og forme objektet i en agaroseblok og notere den foretrukne orientering til sektionering.
Sæt agaroseblokken eller den store galde fast for at montere den korrekt på prøveholderen ved hjælp af cyanoacrylat eller instant lim og maskeringstape. Juster tykkelsen for sektioner, hastighed og vibrationsamplitude i henhold til galdens tykkelse og størrelse. Tilsæt destilleret vand til vandbadet og begynd med sektionering.
Saml forsigtigt sektioner ved hjælp af tang eller børste og overfør dem til et mikrocentrifugerør indeholdende en milliliter 1X PBS-buffer. Fjern 1X PBS fra mikrocentrifugerøret, og tilsæt 200 til 500 mikroliter rydningsopløsning. Udskift rydningsopløsningen med den nye, hvis farven ændres efter nogen tid under prøvebehandlingen.
Udfør calcofluor-hvid farvning for cellevæggene i de udlæggende planteceller ved at forberede 5% calcofluor-hvid plet i rydningsopløsningen. Plet derefter cellerne i mørket i mindst fem minutter. Pletlipider med Nilrød og ligniner med Basic Fuchsin ligninfarvning som beskrevet i tekstmanuskriptet og monter de ryddede sektioner på mikroskopiglasset.
Derefter observeres cellerne under en epifluorescens eller et konfokalmikroskop. Brug flere anskaffelsestilstande til billeddannelse af mere end et fluorescensspektrum samtidigt. Sygdomsdynamik og patogenakkumulering blev sporet i galler koloniseret af Plasmodiophora brassicae, og store celler med P.brassicae hvilesporer blev observeret efter Nilens røde farvning.
Ændringer i xylemdifferentiering ved P.brassicae-infektion blev visualiseret ved hjælp af Basic Fuchsin-farvning. Arabidopsis-planterne, der huser pHCA2: erRFP-konstruktion, blev brugt til at visualisere HCA2-genekspression i phloemvæv inden for clubroot galls. HCA2 co-lokaliserede med phloem i de sene stadier af P.brassicae-drevet galdeudvikling, og genaktiviteten afspejlede den mekanisme, hvormed P.brassicae øger phloem kompleksitet.
Ved 16 dage efter podning blev differentielle cytokininresponser mellem inficerede og ikke-inficerede planter vurderet ved at kontrollere ekspressionen af TCS: GFP-markøren ved udvikling af galler. Cytokininresponset ser ud til at være signifikant formindsket i inficerede galler, mens de forblev stærke, især i phloem-poolen, i ikke-inficerede planter. De mest kritiske trin er fiksering i PFA, indlejring og sektionering.
Til vibratomsektionering skal man optimere og omhyggeligt justere hastigheds-, amplitude- og tykkelsesparametre for at opnå sektioner af god kvalitet. Vibratome sektionering og vævsrensningsteknikker har banet vejen for at forbedre mikroskopisk analyse af fysiologiske reaktioner under plante-mikrobe-interaktioner og væv, der udviser sekundær vækst med kompleks cellulær anatomi.