प्लास्मोडियोफोरा ब्रासिका मिट्टी से उत्पन्न अनिवार्य बायोट्रोफिक रोगज़नक़ है जो ब्रासिकेसी परिवार के पौधों पर हमला करता है। संक्रमण पर, रोगज़नक़ पौधे के भूमिगत भागों पर पित्ताशय के विकास को ट्रिगर करता है, इसलिए रोग क्लबरूट का नाम दिया गया है। पित्ताशय का विकास बहुत जटिल रीप्रोग्रामिंग के साथ होता है।
इसलिए, बीमारी के दौरान आंतरिक परिवर्तनों को ट्रैक करने की संभावना इस पौधे-रोगज़नक़ बातचीत को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। हमारा प्रोटोकॉल जटिल, मोटी और पित्ताशय की इमेजिंग में सुधार करता है। यह जीन अभिव्यक्ति, शारीरिक प्रतिक्रियाओं, फाइटोहार्मोन संतुलन, रोग की प्रगति, बीजाणु वितरण और स्थानीय लिग्निफिकेशन में परिवर्तन के विज़ुअलाइज़ेशन को आसान बनाता है।
प्रोटोकॉल नमूनों के भीतर फ्लोरोसेंट प्रोटीन को संरक्षित करता है, जिससे लंबे समय तक वस्तुओं के भंडारण और प्रसंस्करण की अनुमति मिलती है। यह रोग की प्रगति के साथ जैव रासायनिक और संरचनात्मक परिवर्तनों की ट्रैकिंग को भी सक्षम बनाता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन हमारे समूह में पोस्ट-डॉक्टरेट शोधकर्ता सारा ब्लिचार्ज, हमारी प्रयोगशाला से पीएचडी छात्र दीक्षा सिंह और एडम मिकीविक्ज़ विश्वविद्यालय में प्रोफेसर एग्निएस्का बागनीवस्का-जादवोर्ना समूह के पीएचडी छात्र कोर्नेल माइकलक करेंगे।
पौधे के ऊतकों को तैयार करके शुरू करें। क्लबरूट-संक्रमित और गैर-संक्रमित पौधों की जड़ प्रणालियों से मिट्टी को सावधानीपूर्वक हटा दें। पानी से अच्छी तरह से साफ करें और माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में हाइपोकोटिल और गॉल्स इकट्ठा करें।
वैक्यूम पंप का उपयोग करके 700 मिलीबार के निरंतर वैक्यूम को लागू करके कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए पैराफॉर्मलडिहाइड फिक्सेटिव के 200 से 500 माइक्रोलीटर में नमूने ठीक करें। सुनिश्चित करें कि ऑब्जेक्ट पूरी तरह से पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान में डूब गया है। गैर-संक्रमित हाइपोकोटिल और संक्रमित पित्ताशय को एम्बेड करने के लिए 4% अगारोस का उपयोग करें।
अगारोस को घोलने के लिए घोल उबालें और ठंडा होने पर इसे डालें जबकि यह अभी भी चिपचिपा है। अतिरिक्त पैराफॉर्मलडिहाइड को हटाने के लिए कुछ सेकंड के लिए एक ऊतक पर वस्तु को थोड़ा सुखाएं। पौधे की वस्तु को सावधानीपूर्वक एम्बेड करने और उन्मुख करने के लिए टूथपिक्स या फोर्स का उपयोग करें।
तिरछे वर्गों को रोकने के लिए, सुनिश्चित करें कि वस्तु उन्मुख है और सही ढंग से ढाली गई है ताकि इसकी धुरी विब्राटोम ब्लेड के विमान के लंबवत हो। एगारोस को ठोस बनाने में तेजी लाने के लिए, 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर एक पेट्री या मल्टीकल्चर प्लेट रखें। ब्लेड का उपयोग करके, सावधानीपूर्वक एक अगारोस ब्लॉक के भीतर वस्तु को काटें और ढालें, सेक्शनिंग के लिए पसंदीदा अभिविन्यास को नोट करें।
अगारोस ब्लॉक या बड़े पित्ताशय को साइनोएक्रिलेट या इंस्टेंट गोंद और मास्किंग टेप का उपयोग करके नमूना धारक पर ठीक से माउंट करने के लिए चिपकाएं। पित्ताशय की मोटाई और आकार के अनुसार अनुभागों, गति और कंपन आयाम के लिए मोटाई समायोजित करें। पानी के स्नान में आसुत जल जोड़ें और सेक्शनिंग से शुरू करें।
फोर्स या ब्रश का उपयोग करके अनुभागों को सावधानीपूर्वक इकट्ठा करें और उन्हें 1 एक्स पीबीएस बफर के एक मिलीलीटर वाले माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब से 1 एक्स पीबीएस निकालें और समाशोधन समाधान के 200 से 500 माइक्रोलीटर जोड़ें। नमूना प्रसंस्करण के दौरान कुछ समय बाद क्लियरिंग समाधान को नए के साथ बदलें।
समाशोधन समाधान में 5% कैल्कोफ्लोर-सफेद दाग तैयार करके पौधे की कोशिकाओं की कोशिका दीवारों के लिए कैल्कोफ्लोर-सफेद धुंधलापन करें। फिर कम से कम पांच मिनट के लिए अंधेरे में कोशिकाओं को दाग दें। टेक्स्ट पांडुलिपि में वर्णित के रूप में नील लाल और बेसिक फ्यूचिन लिग्निन स्टेनिंग के साथ लिग्निन के साथ लिपिड दागें और माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर साफ किए गए वर्गों को माउंट करें।
फिर एक एपिफ्लोरेसेंस या एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें। एक साथ एक से अधिक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम इमेजिंग के लिए कई अधिग्रहण मोड का उपयोग करें। प्लाज्मोडियोफोरा ब्रासिका द्वारा उपनिवेशित पित्ताशय में रोग की गतिशीलता और रोगज़नक़ संचय को ट्रैक किया गया था, और नील लाल धुंधला होने के बाद पी.ब्रासिका आराम करने वाले बीजाणुओं के साथ बड़ी कोशिकाओं को देखा गया था।
पी.ब्रासिका संक्रमण पर जाइलम भेदभाव में परिवर्तन को बेसिक फुचिन धुंधलापन का उपयोग करके देखा गया था। एराबिडोप्सिस पौधों का उपयोग क्लबरूट पित्ताशय के भीतर फ्लोएम ऊतक में एचसीए 2 जीन अभिव्यक्ति की कल्पना करने के लिए किया गया था। एचसीए 2 पी.ब्रासिका-संचालित पित्त विकास के अंतिम चरणों में फ्लोएम के साथ सह-स्थानीयकृत होता है, और जीन गतिविधि उस तंत्र को दर्शाती है जिसके द्वारा पी.ब्रासिके फ्लोएम जटिलता को बढ़ाता है।
टीकाकरण के 16 दिनों के बाद, संक्रमित और गैर-संक्रमित पौधों के बीच अंतर साइटोकिनिन प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन पित्ताशय के विकास में टीसीएस: जीएफपी मार्कर की अभिव्यक्ति की जांच करके किया गया था। संक्रमित पित्ताशय में साइटोकिनिन प्रतिक्रियाएं काफी कम हो जाती हैं, जबकि वे मजबूत बने रहते हैं, खासकर फ्लोएम पूल में, गैर-संक्रमित पौधों में। सबसे महत्वपूर्ण कदम पीएफए में निर्धारण, एम्बेडिंग और सेक्शनिंग हैं।
वाइब्रेटोम सेक्शनिंग के लिए, अच्छी गुणवत्ता वाले अनुभागों को प्राप्त करने के लिए गति, आयाम और मोटाई मापदंडों को अनुकूलित और सावधानीपूर्वक समायोजित करने की आवश्यकता होती है। विब्राटोम सेक्शनिंग और ऊतक समाशोधन तकनीकों ने पौधे-माइक्रोब इंटरैक्शन और जटिल सेलुलर शरीर रचना विज्ञान के साथ द्वितीयक विकास का प्रदर्शन करने वाले ऊतकों के दौरान शारीरिक प्रतिक्रियाओं के सूक्ष्म विश्लेषण को बढ़ाने का मार्ग प्रशस्त किया है।