Plasmodiophora brassicae es el patógeno biotrófico obligatorio transmitido por el suelo que ataca a las plantas de la familia Brassicaceae. Tras la infección, el patógeno desencadena el desarrollo de agallas en las partes subterráneas de la planta, de ahí el nombre de la enfermedad clubroot. El desarrollo de agallas se acompaña de una reprogramación muy compleja.
Por lo tanto, la posibilidad de rastrear los cambios internos durante la enfermedad es crucial para comprender esta interacción planta-patógeno. Nuestro protocolo mejora las imágenes de agallas complejas, gruesas y agallas. Facilita la visualización de cambios en la expresión génica, respuestas fisiológicas, equilibrio de fitohormonas, progresión de la enfermedad, distribución de esporas y lignificación local.
El protocolo preserva las proteínas fluorescentes dentro de las muestras, lo que permite el almacenamiento y procesamiento de objetos durante mucho tiempo. También permite el seguimiento de los cambios bioquímicos y estructurales que acompañan a la progresión de la enfermedad. Demostrando el procedimiento estarán Sara Blicharz, investigadora postdoctoral en nuestro grupo, Deeksha Singh, estudiante de doctorado de nuestro laboratorio, y Kornel Michalak, estudiante de doctorado del grupo de la profesora Agnieszka Bagniewska-Zadworna en la Universidad Adam Mickiewicz.
Comience por preparar el tejido vegetal. Retire cuidadosamente la suciedad de los sistemas de raíces de las plantas infectadas y no infectadas. Limpie bien con agua y recoja los hipocótilos y agallas en tubos de microcentrífuga.
Fijar las muestras en 200 a 500 microlitros de fijador de paraformaldehído durante una hora a temperatura ambiente aplicando un vacío constante de 700 milibares con una bomba de vacío. Asegúrese de que el objeto esté completamente sumergido en la solución de paraformaldehído. Use 4% agarosa para incrustar hipocótilos no infectados y agallas infectadas.
Hervir la solución para disolver la agarosa y verterla cuando se enfríe mientras aún está viscosa. Seque el objeto ligeramente sobre un pañuelo de papel durante unos segundos para eliminar el exceso de paraformaldehído. Use palillos de dientes o pinzas para incrustar y orientar el objeto vegetal en agarosa con cuidado.
Para evitar secciones oblicuas, asegúrese de que el objeto esté orientado y moldeado correctamente para que su eje sea perpendicular al plano de la hoja de vibrátomo. Para acelerar la solidificación de la agarosa, coloque una placa de Petri o multicultivo a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Con una cuchilla, corte y moldee cuidadosamente el objeto dentro de un bloque de agarosa, anotando la orientación preferida para la sección.
Pegue el bloque de agarosa o la agalla grande para montarlo correctamente en el portamuestras con cianoacrilato o pegamento instantáneo y cinta adhesiva. Ajuste el grosor para las secciones, la velocidad y la amplitud de vibración de acuerdo con el grosor y el tamaño de la agallas. Agregue agua destilada al baño de agua y comience con la sección.
Recoja cuidadosamente las secciones con pinzas o cepillo y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga que contenga un mililitro de tampón PBS 1X. Retire 1X PBS del tubo de microcentrífuga y agregue de 200 a 500 microlitros de solución de limpieza. Reemplace la solución de limpieza por la nueva si su color cambia después de algún tiempo durante el procesamiento de la muestra.
Realice la tinción de blanco de calcofluor para las paredes celulares de las células vegetales salientes preparando el 5% de tinción de blanco de calcofluor en la solución de aclaración. Luego tiñe las células en la oscuridad durante al menos cinco minutos. Teñir los lípidos con rojo del Nilo y las ligninas con tinción básica de lignina Fuchsin como se describe en el manuscrito de texto y montar las secciones despejadas en el portaobjetos de microscopía.
Luego observe las células bajo un microscopio de epifluorescencia o confocal. Utilice múltiples modos de adquisición para obtener imágenes de más de un espectro de fluorescencia simultáneamente. La dinámica de la enfermedad y la acumulación de patógenos se rastrearon en agallas colonizadas por Plasmodiophora brassicae, y se observaron células grandes con esporas en reposo de P.brassicae después de la tinción de rojo del Nilo.
Los cambios en la diferenciación del xilema sobre la infección por P.brassicae se visualizaron utilizando la tinción básica de Fuchsin. Las plantas de Arabidopsis que albergan la construcción pHCA2: erRFP se utilizaron para visualizar la expresión del gen HCA2 en el tejido del floema dentro de las agallas de la raíz club. HCA2 co-localizado con el floema en las últimas etapas del desarrollo de la agalla impulsada por P.brassicae, y la actividad del gen reflejó el mecanismo por el cual P.brassicae aumenta la complejidad del floema.
A los 16 días después de la inoculación, las respuestas diferenciales de citoquinina entre plantas infectadas y no infectadas se evaluaron verificando la expresión del marcador TCS:GFP en agallas en desarrollo. Las respuestas de citoquinina parecen estar significativamente disminuidas en las agallas infectadas, mientras que se mantuvieron fuertes, especialmente en la piscina de floema, en plantas no infectadas. Los pasos más críticos son la fijación en PFA, la incrustación y la seccionación.
Para la sección de vibratomo, es necesario optimizar y ajustar cuidadosamente los parámetros de velocidad, amplitud y grosor para obtener secciones de buena calidad. Las técnicas de seccionamiento de vibratorio y limpieza de tejidos han allanado el camino para mejorar el análisis microscópico de las respuestas fisiológicas durante las interacciones planta-microbio y los tejidos que exhiben un crecimiento secundario con anatomía celular compleja.
