집락 형성 단위 또는 CFU를 계산하는 것은 미생물학의 표준 기술이지만 느리고 많은 한천 플레이트가 필요합니다. 당사의 기술은 두 시간 한천 플레이트 모두에서 기존 CFU 계수 방법에 비해 100배의 이점을 제공합니다. 우리는 작은 동물 모델, 특히 초파리의 장내 미생물 군집을 측정하기 위해이 방법론을 적용했습니다.
이 프로토콜은 gnotobiotics 파리에서 CFU를 정량화하는 간단하고 빠르며 자동화된 방법입니다. 이 프로토콜은 CFU를 촬영하기 위한 DIY 제작 계측기와 계수를 자동화하는 맞춤형 소프트웨어를 갖춘 워크플로를 제공합니다. 이 프로토콜은 보다 효율적인 도금 및 CFU 계수 방법이 유용할 수 있는 모든 미생물학 실험에 사용할 수 있습니다.
파리를 효율적으로 다루고 판을 발견하려면 손재주가 필요하므로 연습해야합니다. 자동 계수 소프트웨어를 사용하려면 임계값에 대한 판단이 필요하므로 영수증을 수동 계수와 비교하여 실험에 가장 적합한 매개변수를 식별해야 합니다. 이 절차를 시연하는 것은 기술을 개발한 내 실험실의 연구원인 Ren Dodge가 될 것입니다. 시작하려면 0.5미크론 유리 구슬을 비드 측정 트레이에 붓습니다.
모든 우물이 가득 차고 수평이되도록 트레이에 구슬을 펼치십시오. 그런 다음 여분의 구슬을 원뿔형 튜브에 털어냅니다. 이제 세미 스커트 PCR 플레이트를 측정 트레이에 거꾸로 놓고 측정 트레이의 움푹 들어간 곳에 끼워 웰과 맞춥니다.
그런 다음 빠르게 뒤집어 구슬을 옮깁니다. PCR 플레이트 표면에서 과도한 비드를 제거합니다. 모든 우물에 구슬이 포함되어 있는지 확인하십시오.
필요한 경우 계량 스쿱을 사용하여 단일 웰에 비드를 추가하십시오. 그런 다음 알루미늄 호일과 오토 클레이브로 플레이트를 덮으십시오. 플레이트를 사용하기 전에 96채널 피펫터를 사용하여 파리를 추가하기 직전에 각 웰에 100마이크로리터의 PBS를 추가합니다.
마취 된 파리의 표면 멸균을 위해, 작은 깔때기를 사용하여 바이알에서 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 파리를 옮깁니다. 즉시 70 % 에탄올 1 밀리리터를 튜브에 뿌리고 튜브를 닫은 다음 10 초 동안 뒤집어 혼합합니다. 그런 다음 파리를 흡인하지 않고 P-1000 피펫으로 에탄올을 흡입하십시오.
최종 PBS 세척 후 튜브를 닫고 뚜껑 면이 아래로 향하도록 벤치에서 몇 번 세게 두드려 파리가 뚜껑에 들어가도록 합니다. 튜브를 연 후 집게를 사용하여 우물에 파리를 분배하고 각 우물에 파리 하나씩 놓습니다. 적재하는 동안 접시를 얼음 위에 유지하여 파리를 마취 상태로 유지하십시오.
우물 가까이에서 흩어진 구슬을 제거하면 호일 씰이 파손되어 누출이 발생할 수 있습니다. 밀봉 호일의 둔한 면이 플레이트에서 아래쪽을 향하고 반짝이는 면이 히트 실러를 향하도록 하십시오. 히트 실러를 5초 동안 단단히 누르고 핸드 어플리케이터로 광택을 내어 호일을 고정합니다.
파리를 5 분 동안 균질화하십시오. 파리가 완전히 균질화되고 용액이 착색되는지 확인하십시오. 밀봉 호일에서 액체를 제거하려면 350G의 미니 플레이트 스피너에서 비드 플레이트를 30초 동안 스핀다운하고 플라이 균질액의 물방울이 튀지 않도록 플레이트를 잡고 호일을 제거합니다.
뚜껑이 열린 직사각형 MRS 한천 성장 플레이트 3 개를 생물 안전 캐비닛에 넣어 최소 10 분 동안 건조시킵니다. 96-채널 피펫터를 사용하여 멸균된 96-웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 PBS를 첨가하여 2개의 희석 플레이트를 준비한다. P-20 팁 랙을 96채널 파이피터에 로드합니다.
샘플 플레이트에서 11.1 마이크로리터의 균질액을 흡인하여 1:10 희석을 만듭니다. 이제 웰당 100마이크로리터의 멸균 PBS가 들어 있는 첫 번째 희석 플레이트에 분주합니다. 희석 플레이트를 플레이트 쉐이커에서 600 RPM에서 10초 동안 유지한다.
적어도 10 번 위아래로 피펫팅하여 다시 혼합하십시오. 11.1 마이크로리터를 제1 희석 플레이트로부터 제2 희석 플레이트로 옮기고 임의의 추가 희석에 대해 혼합 단계를 반복한다. 스팟팅 플레이트의 경우 각 웰에서 2마이크로리터를 96채널 피피터에 로드합니다.
한천에 찔리지 않도록 피펫터 헤드를 플레이트 위로 천천히 내리고 모든 반점이 분배되었는지 확인합니다. 그런 다음 액체 반점이 한천에 빠르게 스며 들어 함께 흐르지 않는지 확인하십시오. 원고에 설명된 대로 나머지 희석 플레이트에 대해 도금 과정을 반복합니다.
액체가 한천에 완전히 흡수되면 플레이트를 뒤집어 식민지가 최적의 크기에 도달 할 때까지 배양합니다. 플레이트를 논리적으로 구성하고 사진을 찍는 동안 특정 순서로 유지하십시오. A1이 모든 플레이트의 왼쪽 상단 모서리에 오도록 방향을 지정합니다.
플레이트 뚜껑을 제거한 후 A1이 올바른 모서리를 향하도록 플레이트를 스테이지에 놓습니다. 접시를 이미지화합니다. 이미지를 컴퓨터로 전송하고 실험 이름, 용지 유형, 희석 계수 및 기타 관련 세부 정보를 포함하여 이름을 바꿉니다.
정량화를 위해 처리할 이미지를 폴더로 구성합니다. 플레이트를 구분하는 파일 이름은 출력 스프레드시트의 각 카운트 세트에 대한 열 제목이 됩니다. 폴더에 Cropped 및 Receipts라는 하위 폴더를 만듭니다.
이러한 폴더는 출력 파일을 수신합니다. 이제 ImageJ에서 자르기 플러그인을 시작하고 확인을 클릭하여 자르기를 시작합니다. 소스 폴더를 선택하는 대화 상자가 나타납니다.
확인을 클릭합니다. 원본 폴더를 선택하고 열기를 클릭합니다. 그런 다음 대상 디렉토리를 선택하기위한 대화 상자에서 확인을 클릭하십시오. 대상 폴더를 선택하고 열기를 누릅니다.
이미지가 이미 직선이면 스페이스바를 누르기만 하면 됩니다. 그렇지 않으면 수평이되어야하는 가장자리를 따라 선을 그려 이미지를 똑바로 펴십시오. 이미지가 똑바로 나타나지 않는 경우 필요한만큼 선을 다시 그립니다.
그런 다음 계산 영역에 대한 경계 상자를 그리고 모든 반점이 셀 내에 올 때까지 크기와 비율을 조정합니다. 커서를 경계 상자 밖으로 끌어 그리드를 새로 고칩니다. 그리드가 좋아 보이면 스페이스바를 누릅니다.
플러그인은 모든 사진이 동일하게 정렬된다고 가정하므로 다음 이미지가 첫 번째 이미지와 동일한 각도로 자동으로 회전하는지 확인하십시오. 이것이 정확하면 스페이스바를 눌러 계속합니다. 그렇지 않으면 이전과 같이 이미지를 똑바르게 합니다.
그리드는 또한 이전 이미지와 동일한 위치를 호출합니다. 필요한 경우 조정하고 스페이스바를 누릅니다. 카운트 온 잇을 실행하고 그리드 아이언을 선택하십시오.
임계값 콜로니 강도를 상위 및 하위 픽셀 강도 값을 기준으로 설정합니다. 임계 값을 가능한 한 엄격하게 유지하면서 모든 식민지를 선택하십시오. 임계값이 만족스러우면 작업 필요 대화 상자에서 확인을 클릭하고 확인을 클릭하여 계속합니다.
첫 번째 이미지에서는 계속 진행하거나 설정 메뉴로 돌아갈 수 있는 옵션이 제공됩니다. 일괄 처리를 계속하려면 확인을 클릭합니다. 그런 다음 영수증 및 결과 테이블을 보관할 폴더를 선택합니다. 이전에 만든 영수증 폴더를 사용합니다.
첫 번째 이미지 다음에 다음 이미지는 기본적으로 이전 설정과 동일한 임계값으로 설정됩니다. 확인을 클릭하여 이러한 설정을 사용하거나 설정을 조정합니다. 소프트웨어에서 생성된 카운트 영수증을 검토하고 카운트 오류를 수동으로 수정합니다.
ImageJ 플러그인은 통계적으로 정확하지만 오류가 발생합니다. 영수증을 증명하여 이상값을 조사하고 잘못된 계산을 식별합니다. 소프트웨어는 CFU 데이터를 영수증과 동일한 폴더에 CSV 파일로 저장합니다.
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)으로 서식한 파리의 경우, 매일 멸균 식품으로 옮기거나, 매일 옮기거나, 분석 4시간 전에 멸균 식품에 보관하거나, 매일 옮겨서 분석 4시간 전에 멸균 한천에 보관한 파리의 박테리아가 현저히 감소했습니다. Acetobacter indonesiensis를 먹인 파리에서도 유사한 결과가 관찰되었는데, 옮겨진 파리, 사후 옮겨진 파리, 제거 된 파리는 CFU가 크게 감소한 것으로 나타 났지만 세척은 측정 가능한 효과가 없었으며, 이는 CFU의 감소가 큐티클이 아닌 장에서 박테리아가 제거되었기 때문임을 시사합니다. 스팟 당 2-25 개의 콜로니가있는 스팟의 CFU 수는 기존 방법과 비교하여 차이가 없었습니다.
평균 35개의 콜로니를 가진 반점은 대조군 확산판보다 낮은 CFU를 보였다. 이러한 감소는 빽빽한 지점에서 겹치는 식민지 때문일 수 있습니다. 플레이트 사진에서 식민지 강도는 배경보다 300 % 높았습니다.
락토바실러스 플란타룸 m체리 양성 콜로니는 m체리 음성 콜로니보다 1, 000% 더 높은 적색 강도를 나타냈다. 아세토박터 인도네시아 GFP 양성 콜로니는 GFP 음성 콜로니보다 200% 더 높은 녹색 강도를 보였습니다. ImageJ 용 카운트 온 잇 플러그인은 플레이트 사진에서 CFU 카운팅을 자동화합니다.
콜로니는 수동 계수와 비슷한 수로 정확하게 감지됩니다. 카운트 영수증은 잘못된 카운트를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 크기 임계값과 형광 파장을 변경하면 서로 다른 콜로니 형태를 별도로 계산할 수 있습니다.
비드 비즈 전에 플레이트가 잘 밀봉되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 측정값을 교정하기 위해 포지티브 컨트롤을 설계하는 것도 중요합니다. 또한 이 기술을 사용하여 96웰 플레이트에서 박테리아의 시험관 내 개체군을 연구하여 혼합 박테리아 군집을 연구할 수 있습니다.
이 기술은 고처리량 스크리닝 접근법을 통해 장내 집락화와 집락화의 생물학적 변이를 측정할 수 있습니다.
