Snabb kolonibildande enhetsräkning i 96-brunnsplattformat applicerat på Drosophila-mikrobiomet

Att räkna kolonibildande enheter, eller CFU: er, är en standardteknik inom mikrobiologi, men det är långsamt och det kräver massor av agarplattor. Vår teknik ger en hundrafaldig fördel jämfört med traditionella CFU-räkningsmetoder i båda tidsagarplattorna. Vi har tillämpat metodiken för att mäta tarmmikrobiomet hos smådjursmodeller, särskilt bananflugor.

Detta protokoll är ett enkelt, snabbt och automatiserat sätt att kvantifiera CFUs i gnotobiotics flugor. Detta protokoll tillhandahåller ett arbetsflöde med DIY-tillverkad instrumentering för att fotografera CFU: erna och anpassad programvara för att automatisera räkningen av dem. Detta protokoll kan användas i alla mikrobiologiska experiment där effektivare metoder för plätering och CFU-räkning kan vara användbara.

Att hantera flugorna effektivt och upptäcka plattorna kräver manuell fingerfärdighet, så detta bör övas. Att använda den automatiska räkningsprogramvaran kräver bedömning av tröskeln, så kvitton bör jämföras med manuella räkningar för att identifiera de bästa parametrarna för ditt experiment Att demonstrera proceduren kommer att vara Ren Dodge, en forskare från mitt laboratorium som utvecklade tekniken. För att börja, häll 0,5 mikron glaspärlor på pärlmätningsbrickan.

Sprid pärlorna på brickan så att alla brunnar är fulla och jämna. Borsta sedan bort överflödiga pärlor i ett koniskt rör. Placera nu en halvkjolad PCR-platta upp och ner på mätbrickan och rikta in den mot brunnarna genom att montera den i indragningen på mätbrickan.

Vänd sedan snabbt på den för att överföra pärlorna. Ta bort överflödiga pärlor från PCR-plattans yta. Se till att alla brunnar innehåller pärlor.

Om det behövs, använd en vägskopa för att lägga pärlor till en enda brunn. Täck sedan plattan med aluminiumfolie och autoklav. Innan du använder plattan, tillsätt 100 mikroliter PBS till varje brunn omedelbart innan du lägger till flugorna med 96-kanals pipetter.

För ytsterilisering av de bedövade flugorna, överför flugor från injektionsflaskan till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör med en liten tratt. Spraya omedelbart en milliliter 70% etanol i röret, stäng röret och blanda genom inversion i 10 sekunder. Aspirera sedan etanolen med en P-1000-pipett medan du undviker att aspirera några flugor.

Efter sista PBS-tvätten, stäng röret och knacka hårt på bänken några gånger med locksidan nedåt så att flugorna går in i locket. Efter att ha öppnat röret, dispensera flugor i brunnarna med pincett och placera en fluga i varje brunn. Håll flugorna sövda genom att hålla plattan på is under lastning.

Ta bort ströpärlor nära brunnarna, eftersom dessa kan bryta folietätningen och orsaka läckage. Se till att den tråkiga sidan av tätningsfolien är orienterad ner på plattan och att den blanka sidan vetter upp mot värmeförseglaren. Tryck fast värmeförseglaren ordentligt i fem sekunder och bränn med handapplikatorn för att säkra folien.

Homogenisera flugorna i fem minuter. Se till att flugorna är helt homogeniserade och lösningen blir färgad. För att ta bort vätska från tätningsfolien, snurra ner pärlplattan i 30 sekunder i en miniplattspinnare vid 350 G.Ta bort folien medan du håller plattan för att undvika stänkande droppar av flughomogenat.

Placera tre rektangulära MRS-agartillväxtplattor med locken öppna i biosäkerhetsskåpet för att torka i minst 10 minuter. Förbered två utspädningsplattor genom att tillsätta 100 mikroliter PBS till varje brunn i en steril 96-brunnsplatta med en 96-kanals pipetter. Ladda ett rack med P-20-spetsar på 96-kanals pipetter.

Gör en utspädning på 1:10 genom att aspirera 11,1 mikroliter homogenat från provplattan. Dispensera den nu i den första utspädningsplattan som innehåller 100 mikroliter steril PBS per brunn. Håll utspädningsplattan på plattskakaren i 10 sekunder vid 600 varv / min.

Blanda igen genom att pipettera upp och ner minst 10 gånger. Överför 11,1 mikroliter från den första utspädningsplattan till den andra utspädningsplattan och upprepa blandningsstegen för eventuella ytterligare utspädningar. För spottingplattor, ladda två mikroliter från varje brunn i 96-kanals pipetter.

Sänk pipetterhuvudet långsamt på plattan, undvik att sticka in i agar och se till att alla fläckar har dispenserats. Kontrollera sedan att vätskefläckarna snabbt suger in i agar och inte går ihop. Upprepa pläteringsprocessen för de återstående utspädningsplattorna enligt beskrivningen i manuskriptet.

När vätskan har absorberats helt i agar, invertera plattorna och inkubera dem tills kolonierna har nått optimal storlek. Organisera plattorna logiskt och håll dem i en viss ordning medan du fotograferar. Orientera dem så att A1 är i det övre vänstra hörnet för alla plattor.

När du har tagit bort plattlocket, placera plattan på scenen med A1 orienterad i rätt hörn. Avbilda plattorna. Överför bilderna till en dator och byt namn på dem, inklusive experimentnamnet, medietypen, utspädningsfaktorn och andra relevanta detaljer.

Organisera bilderna som ska bearbetas för kvantifiering i en mapp. Filnamnen som särskiljer plåtarna blir kolumnrubriker för varje uppsättning räkningar i utdatakalkylarket. Gör undermappar med namnet Beskuren och Kvitton i mappen.

Dessa mappar tar emot utdatafilerna. Starta nu Croptacular plugin från ImageJ och klicka på OK för att börja beskära. En dialogruta för att välja källmapp dyker upp.

Klicka på OK. Välj källmappen och klicka på Öppna. Klicka sedan OK i dialogrutan för att välja destinationskatalog. Välj målmapp och tryck på Öppna.

Om bilden redan är rak trycker du bara på Mellanslag. Annars rätar du ut bilden genom att rita en linje längs en kant som ska bli horisontell. Rita om linjen så många gånger som behövs om bilden inte ser rak ut.

Rita sedan en gränsruta för räkningsområdet och justera dess storlek och proportion tills alla fläckar finns i deras celler. Dra markören utanför gränsrutan för att uppdatera rutnätet. När rutnätet ser bra ut trycker du på Mellanslag.

Eftersom plugin förutsätter att alla foton ska justeras identiskt, se till att nästa bild automatiskt roterar till samma vinkel som den första. Om detta är korrekt trycker du på Mellanslag för att fortsätta. Annars räta ut bilden som tidigare.

Rutnätet påminner också om samma position som föregående bild. Justera vid behov och tryck på Mellanslag. Starta Count-On-It och välj Gridiron.

Ange tröskelvärdets koloniintensitet baserat på ett övre och ett lägre pixelintensitetsvärde. Gör tröskeln så strikt som möjligt, samtidigt som du väljer alla kolonier. Klicka på OK i dialogrutan Åtgärd krävs när tröskelvärdet är tillfredsställande och klicka sedan på OK för att fortsätta.

På den första bilden ges alternativet att fortsätta eller återgå till inställningsmenyn. Om du vill fortsätta med batchprocessen klickar du på OK. Välj sedan en mapp för att behålla kvitton och resultattabellen. Använd mappen Kvitton som skapades tidigare.

Efter den första bilden kommer följande bilder som standard att ha samma tröskelvärde som de tidigare inställningarna. Klicka på OK för att använda dessa inställningar eller justera inställningarna. Granska antalet kvitton som produceras av programvaran och korrigera eventuella räknefel manuellt.

ImageJ-plugin är statistiskt korrekt, men fel uppstår. Bevisa kvitton för att undersöka avvikande värden och identifiera felräkningar. Programvaran sparar CFU-data som en CSV-fil i samma mapp som kvitton.

För flugor koloniserade med Lactobacillus plantarum, Det fanns en signifikant minskning av bakterier för flugor som antingen överfördes dagligen till steril mat, överfördes dagligen, hölls på steril mat fyra timmar före analys, eller överfördes dagligen och hålls på steril agar fyra timmar före analys jämfört med flugor som aldrig överfördes till steril mat efter ympning. Liknande resultat observerades hos Acetobacter indonesiensis-matade flugor, där överförda, efteröverförda och rensade flugor visade en signifikant minskning av CFUs, men tvättning hade ingen mätbar effekt, vilket tyder på att minskningen av CFUs berodde på clearance av bakterier från tarmen snarare än nagelbandet. CFU-räkningen i fläckar med 2 till 25 kolonier per plats visade ingen skillnad jämfört med den traditionella metoden.

Fläckar i genomsnitt 35 kolonier visade lägre CFUs än kontrollspridningsplattorna. Denna minskning kan bero på att kolonier överlappar varandra på täta platser. På plattfoton var koloniintensiteten 300% högre än bakgrunden.

Den Lactobacillus plantarum mCherry-positiva kolonier visade 1.000% högre röd intensitet än mCherry-negativa kolonier. Acetobacter indonesiensis GFP-positiva kolonier visade 200% högre grön intensitet än GFP-negativa kolonier. Count-On-It-plugin för ImageJ automatiserar CFU-räkning från plattfoton.

Kolonier detekteras exakt, med jämförbara räkningar med manuell räkning. Räkna kvitton kan användas för att identifiera felräkningar. Genom att ändra storlekströsklar och fluorescensvåglängder kan olika kolonimorfologier räknas separat.

Det är viktigt att se till att plattan är väl förseglad innan pärlpärlor. Det är också viktigt att utforma positiva kontroller för att kalibrera dina mätningar. Vi använder också denna teknik för att studera in vitro-populationer av bakterier i 96-brunnsplattor, vilket låter oss studera blandade samhällen av bakterier.

Denna teknik möjliggör screeningmetoder med hög genomströmning för att mäta tarmkolonisering såväl som biologisk variation i kolonisering.