Name: evaluation of caspase activation to assess innate immune cell death
Uploaded: 2023-01-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death at JoVE.com

نشكر أعضاء مختبر Kanneganti على تعليقاتهم واقتراحاتهم ، ونشكر J. Gullett ، دكتوراه ، على دعم التحرير العلمي. يتم دعم العمل في مختبرنا من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) AI101935 و AI124346 و AI160179 و AR056296 و CA253095 (إلى T.-D.K.) والجمعيات الخيرية الأمريكية اللبنانية السورية (إلى T.-D.K.). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

تمت الموافقة على استخدام الحيوانات وإجراءاتها من قبل لجنة مستشفى سانت جود لأبحاث الأطفال حول استخدام الحيوانات ورعايتها.
1. إعداد الحلول
<ol><li>قم بإعداد الوسائط المكيفة L929.<ol><li>اللوحة 1 × 106 خلايا L929 (انظر جدول المواد) في دورق زراعة الأنسجة 182 سم2 ...

توفر مراقبة انقسام الكاسباز وتنشيطه واحدة من أكثر الصور شمولا لتنشيط PCD المناعي الفطري كجزء من الاستجابة المناعية الفطرية. يوضح البروتوكول الموصوف هنا استراتيجية لمراقبة تنشيط الكاسباز استجابة لعدوى IAV و HSV1 و F. novicida والزناد المعقم LPS + ATP ، ولكن العديد من المحفزات الأخرى يمكن أن تحفز PC...

يعمل جهاز المناعة الفطري كخط دفاع أول أثناء العدوى واستجابة للمثيرات العقيمة، مثل إصابة الأنسجة والتغيرات في الاتزان الداخلي. تستجيب المستشعرات المناعية الفطرية على سطح الخلية وفي السيتوبلازم للأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض أو الضرر (PAMPs أو DAMPs ، على التوالي) لتحفيز مسارات الإشارات الالتهابية والاستجابات الخلوية. تتمثل إحدى العمليات الرئيسية للاستجابة المناعية الفطرية في تحريض موت الخلايا لإزالة الخلايا المصابة أو التالفة وتحفيز المزيد من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية. موت الخلايا المبرمج (PCD) هو عملية محفوظة للغاية عبر الأنواع ، مما يسلط الضوء على أهميتها التطورية كآلية مناعية فطرية.
هناك العديد من مسارات PCD المناعية الفطرية التي يمكن تنشيطها في جميع أنواع الخلايا. Caspases هي عائلة رئيسية من البروتياز المحفوظة للغاية ، داخل الخلايا ، والتي تعتبر حاسمة عبر العديد من مسارات PCD ، بما في ذلك مسار موت الخلايا المبرمج غير الالتهابي تقليديا ، بالإضافة إلى مسارات PCD الالتهابية مثل pyroptosis و necroptosis و PANoptosis1،2،3،4،5 . هناك 11 كاسباس بشري و 10 فأر محددة جيدا ، بالإضافة إلى كاسباس زائف قد يكون وظيفيا ، ويتم التعبير عن معظمها بشكل أساسي على أنها أحادي غير نشط أو ثنائي الكاسباز المؤيد للكاسباس الذي يتطلب انقساما للتنشيط 6,7. تحتوي Caspases أيضا على مجالات مهمة لتجنيد وتشكيل مجمعات متعددة البروتينات. وتشمل هذه المجالات مجال التنشيط والتوظيف caspase (CARD) ، والذي يمكن العثور عليه في caspase-1 و caspase-2 و caspase-4 و caspase-5 و caspase-9 و caspase-11 ، أو مجال مستجيب الموت (DED) ، الموجود في caspase-8 و caspase-10. من خلال كل من نشاطها المحلل للبروتين وقدرتها على تكوين مجمعات متعددة البروتينات ، تعد الكاسباز محركات حاسمة ل PCD المناعي الفطري.
تم تحديد دور caspases في PCD المناعي الفطري لأول مرة في موت الخلايا المبرمج ، حيث يقوم caspases البادئ ، caspase-2 ، caspase-8 ، caspase-9 ، و caspase-10 ، بتنشيط caspases الجلاد ، caspase-3 ، caspase-6 ، و caspase-7 ، لدفع موت الخلايا8،9،10،11،12. يمكن تنشيط كاسباس البادئ بواسطة شلالات إشارات متنوعة ؛ ينشط المسار الخارجي Caspase-8 من خلال إشارات مستقبلات الموت التي يسببها الرباط خارج الخلية ، وينشط المسار الداخلي Caspase-9 من خلال تعطيل سلامة الميتوكوندريا13. تقوم كاسباس البادئ المنشط بشق الرابط الذي يفصل بين الوحدات الفرعية التحفيزية الكبيرة والصغيرة لكاسباس الجلاد لإنتاج أشكالها النشطة. ثم يقوم الجلاد بشق ركائزه لتفكيك الخلية ، مما يؤدي إلى تدهور الحمض النووي ، وتفجير الغشاء ، والتجزئة النووية ، وإطلاق أجسام موت الخلايا المبرمج14,15. تنتهي هذه العملية عادة بشكل غير لاتيني وغير التهابي من موت الخلايا عندما تقترن بالإزالة الفورية للخلايا الميتة عن طريق كثرة الخلايا الفعالة16. ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي العيوب في كثرة الخلايا أو نقص الخلايا البلعمية إلى تراكم الخلايا المبرمج ، والتي تخضع بعد ذلك لموت الخلايا الانحلالية والالتهابية17,18.
تم اكتشاف أن الكاسباس الالتهابي ، بما في ذلك caspase-1 (الإنسان والفأر) ، caspase-4 و caspase-5 (الإنسان) ، و caspase-11 (الفأر) ، يتم تنشيطه خلال شكل من أشكال التهاب المناعة الفطرية PCD (III-PCD) يسمى pyroptosis. يرتبط تنشيط Caspase-1 بتكوين الالتهابات ، وهي مجمعات متعددة البروتينات تحتوي على مستشعر مناعي فطري خلوي ، وجزيء محول (بروتين شبيه بالبقع مرتبط بموت الخلايا المبرمج يحتوي على CARD [ASC]) ، و caspase-1. يسمح تكوين هذا المركب للكاسباز -1 بالخضوع للتحلل الذاتي بوساطة القرب لإطلاق شكله النشط ، والذي يمكن أن يشق الركائز المستهدفة بما في ذلك السيتوكينات المؤيدة للالتهابات إنترلوكين (IL) -1β و IL-18 وجزيء Gasdermin D المكون للمسام (GSDMD) 19،20،21،22،23 . يمكن ل Caspase-11 و caspase-4 و caspase-5 أيضا تنشيط GSDMD دون تكوين المنبع للالتهابات بعد استشعار PAMPs مثل عديد السكاريد الدهني (LPS) 19,20. تخضع هذه الكاسباز للتثبيط متبوعا بقليل القلة والانقسام الذاتي للتنشيط عند الارتباط ب LPS الخلوي ، مما يؤدي إلى تنشيط التهابي غير قانوني 24،25،26 وتنشيط caspase-1 بطريقة جوهرية للخلية للحث على نضوج IL-1β و IL-1820. إن نضوج وإطلاق هذه السيتوكينات المؤيدة للالتهابات يميز هذه الكاسباس بأنها "التهابية". بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على كاسباز -8 موت الخلايا المبرمج لتوطين إلى الالتهاب ، مما يوفر صلة بين عمليات موت الخلايا المبرمج والبيروبتوبوتيك. وقد وجدت الدراسات أن موت الخلايا المبرمج caspase-8 أمر بالغ الأهمية أيضا لتنظيم شكل آخر من أشكال PCD يسمى necroptosis. يؤدي فقدان caspase-8 إلى تنشيط السودوكيناز المختلط الشبيه بمجال كيناز السلالة المختلطة (MLKL) بوساطة مستقبلات سيرين ثريونين 3 (RIPK3) لقيادة مسار III-PCD للنخر27،28،29،30،31،32،33،34،35.
في حين تم تصنيف الكاسباس تاريخيا على أنه "غير أبوبتويتي" أو "التهابي" بناء على نوع موت الخلايا الذي يبدأه ، تشير الأدلة المتزايدة إلى وجود تداخل مكثف بين مسارات PCD المناعية الفطرية من خلال caspases 3,4. على سبيل المثال ، يشق caspase-1 الالتهابي من الالتهابات caspase-7 المبرمج في موقع التنشيط الكنسي34. يمكن أن يؤدي تنشيط Caspase-1 أيضا إلى انقسام ركائز موت الخلايا المبرمج مثل بوليميراز بوليميراز 1 (ADP-ribose) 1 (PARP1) 36. في الخلايا التي تفتقر إلى GSDMD ، يمكن أن يشق caspase-1 أيضا caspase-337,38. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ل caspase-3 المبرمج قانونا أن يشق gasdermin E (GSDME) للحث على PCD17,18 ويعالج أيضا GSDMD في شكل غير نشط40. علاوة على ذلك ، لوحظ تجنيد caspase-8 في المجمع الالتهابي 39،40،41،42،43،44،45 ، و caspase-8 هو منظم رئيسي للتنشيط الالتهابي الكنسي وغير الكنسي 39. هناك أيضا أدوار متداخلة وزائدة عن الحاجة ل caspase-8 و caspase-1 في العديد من الحالات الالتهابية ، ويحدث PCD المناعي الفطري الذي يتميز بتنشيط المكونات النارية واللافتوتيكية والميتة عبر طيف المرض39،46،47،48،49،50.
بناء على هذا الحديث المتبادل بين الكاسباس الالتهابي وموت الخلايا المبرمج ، تم تحديد فجوة رئيسية في الفهم الميكانيكي للمناعة الفطرية و PCD ، مما أدى إلى اكتشاف PANoptosis. PANoptosis هو شكل فريد من أشكال III-PCD يتم تنشيطه استجابة لمسببات الأمراض ، PAMPs ، DAMPs ، والتغيرات في التوازن ويتم تنظيمه بواسطة PANoptosomes - مجمعات جزيئية متعددة الأوجه تدمج مكونات من مسارات موت الخلايا الأخرى 44،50،51،52،53،54،55 . لا يمكن حساب مجمل التأثيرات البيولوجية في PANoptosis بشكل فردي عن طريق pyroptosis أو موت الخلايا المبرمج أو necroptosis وحده 3،4،35،36،39،46،47،48 ، حيث يتميز PANoptosis بتنشيط caspases متعددة ، بما في ذلك caspase-1 و caspase-11 و caspase-8 و caspase-9 و caspase-3 و / أو caspase-7 ، اعتمادا على السياق 44،48،49،50،51،52،53،54،56،57،58،59،60،61،62 . لقد تورط PANoptosis بشكل متزايد في الأمراض المعدية والالتهابية ، وكذلك في السرطانات وعلاجات السرطان3،4،35،36،39،44،46،47،48،49،50،51،52،53 ,54,56 ,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.
نظرا للدور الأساسي للكاسباز عبر مسارات موت الخلايا ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج ، وداء البروبتوسيس ، والتنخر ، و PANoptosis ، من المهم تطوير تقنيات لتوصيف تنشيطها وفهم التعقيد الكامل لمسارات PCD. يوضح البروتوكول هنا طريقة لتحفيز الخلايا وقياس التنشيط اللاحق للكاسباز (الشكل 1). تستفيد هذه الطريقة من الانقسام المحلل للبروتين للكاسباس ، وهو أمر مطلوب بشكل عام لتنشيطها ، كوسيلة لدراستها. من خلال النشاف الغربي ، يمكن تحديد أحجام البروتين ، مما يسمح بالتصور الواضح والتمايز بين pro-caspases غير النشطة وأشكالها المشقوقة المنشطة.
تتمثل المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول في 1) قدرته على تقييم تنشيط كاسباس متعددة بالتوازي من مجموعة واحدة من الخلايا الداخلية لتحديد تنشيط PCD بشكل أكثر دقة و 2) استخدام تقنيات معملية بسيطة نسبيا لا تتطلب تدريبا مكثفا أو معدات باهظة الثمن. استخدمت البروتوكولات السابقة النشاف الغربي ، أو مراسلي الفلورسنت ، أو تلطيخ الأجسام المضادة لمراقبة تنشيط الكاسباز في طافات الثقافة ، والخلايا والأنسجة المحللة ، والخلايا الكاملة عن طريق الفحص المجهري ، وفي الجسم الحي67،68،69،70،71 ، ولكن هذه التقنيات بشكل عام تراقب فقط واحد أو اثنين من caspases في العينة. علاوة على ذلك ، في حين تم استخدام ركائز الببتيد الاصطناعية التي تحتوي على مواقع انشقاق الكاسباز التي تتألق عند الانقسام لمراقبة تنشيط الكاسباز في الخلية أو الأنسجة المحللة69 ، يمكن في كثير من الأحيان شق هذه الركائز بأكثر من كاسباز واحد ، مما يجعل من الصعب تحديد التنشيط المحدد للكاسباز الفردي في هذا النظام. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام النشاف الغربي بدلا من استخدام مراسلي الفلورسنت أو الطرق الأخرى القائمة على العلامات يسمح للباحثين باستخدام الخلايا الداخلية بدلا من إنشاء خطوط خلايا محددة مع جينات المراسل. هناك مزايا متعددة لاستخدام الخلايا الداخلية ، بما في ذلك حقيقة أن العديد من خطوط الخلايا الخالدة تعاني من نقص في جزيئات موت الخلايا الرئيسية72,73 ، مما قد يؤثر على النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح استخدام الخلايا الداخلية بتقييم أنواع الخلايا المتنوعة ، مثل الضامة والخلايا الظهارية والخلايا البطانية ، بدلا من سلالة واحدة. النشاف الغربي هو أيضا تقنية بسيطة نسبيا وفعالة من حيث التكلفة يمكن تنفيذها في المختبرات في جميع أنحاء العالم دون الحاجة إلى معدات كبيرة ومكلفة أو إعدادات معقدة.
هذا البروتوكول قابل للتطبيق على نطاق واسع عبر علم الأحياء لفهم كل من وظائف الكاسباس المعتمدة على موت الخلايا والمستقلة عن موت الخلايا ، بما في ذلك أدوارها ووظائفها في السقالات في مسارات الإشارات الالتهابية الأخرى74. يسمح تطبيق هذه الطريقة باتباع نهج موحد في دراسة مسارات PCD المناعية الفطرية والإشارات الالتهابية عبر الأمراض والظروف ، ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد العمليات التنظيمية الحرجة والروابط الميكانيكية التي ستفيد في تطوير الاستراتيجيات العلاجية المستقبلية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCHVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12% polyacrylamide gel with 10 wells&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needle&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm tissue culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>182-cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accessory white trans tray</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0834-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-1 antibody</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-20B-0042-C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-11 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB120-10454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-3 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-7 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-8 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-9 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;cleaved caspase-3 antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;cleaved caspase-7 antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;cleaved caspase-8 antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>315-035-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-035-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>112-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;&#946;-Actin antibody (C4) HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-47778 HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-atpl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Trypticase Soy Broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead bath</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-4598-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer D30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6133000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BME</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BO126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>CellTreat Scientific Products</td>
			<td>229315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence imager (Amersham 600)&#160;</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29083461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2&#160;chamber</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>221S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eelectrophoresis apparatus&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Francisella novicida (U112 strain)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel releaser&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-043-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herpes simplex virus 1 (HF strain)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti&#8211;caspase-1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB6215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti&#8211;caspase-8 antibody</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ALX-804-242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>v1.53a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])&#160;</td>
			<td>constructed per Hoffmann et al.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-1</td>
			<td>cell line for creating L929-conditioned media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP376-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminata Forte Western HRP substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUF0500</td>
			<td>standard-sensitivity HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDCK cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td>cell line for determining IAV viral titer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dried milk powder</td>
			<td>Kroger</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>PHOSS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power source&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking shaker</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S2035-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripping buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal Femto HRP substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34580</td>
			<td>high-sensitivity HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot semi-dry system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-3pelps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td>cell line for determining HSV1 viral titer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of caspase activation to assess innate immune cell death

توفر المناعة الفطرية خط الدفاع الأول الحاسم استجابة لمسببات الأمراض والإهانات العقيمة. أحد المكونات الميكانيكية الرئيسية لهذه الاستجابة هو بدء موت الخلايا المبرمج المناعي الفطري (PCD) للقضاء على الخلايا المصابة أو التالفة ونشر الاستجابات المناعية. ومع ذلك ، يرتبط PCD الزائد بالالتهاب وعلم الأمراض. لذلك ، فإن فهم تنشيط وتنظيم PCD هو جانب مركزي لتوصيف الاستجابات المناعية الفطرية وتحديد أهداف علاجية جديدة عبر طيف المرض.
يوفر هذا البروتوكول طرقا لتوصيف تنشيط PCD المناعي الفطري من خلال مراقبة caspases ، وهي عائلة من البروتياز المعتمد على السيستين والتي غالبا ما ترتبط بمسارات PCD المتنوعة ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج ، pyroptosis ، necroptosis ، و PANoptosis. وصفت التقارير الأولية caspase-2 و caspase-8 و caspase-9 و caspase-10 على أنها كاسباس بادئ و caspase-3 و caspase-6 و caspase-7 ككاسباز مستجيب في موت الخلايا المبرمج ، بينما وجدت الدراسات اللاحقة أن caspases الالتهابية ، caspase-1 ، caspase-4 ، caspase-5 ، و caspase-11 ، تدفع pyroptosis. من المعروف الآن أن هناك تقاطعا مكثفا بين الكاسباس وجزيئات المناعة وموت الخلايا الفطرية الأخرى عبر مسارات PCD المحددة سابقا ، مما يحدد فجوة معرفية رئيسية في الفهم الميكانيكي للمناعة الفطرية و PCD ويؤدي إلى توصيف PANoptosis. PANoptosis هو مسار التهابي فطري فريد من نوعه ينظمه مجمعات PANoptosome ، والتي تدمج المكونات ، بما في ذلك caspases ، من مسارات موت الخلايا الأخرى.
هنا ، يتم توفير طرق لتقييم تنشيط caspases استجابة للمنبهات المختلفة. تسمح هذه الطرق بتوصيف مسارات PCD في كل من المختبر والجسم الحي ، حيث تخضع الكاسباز المنشطة لانقسام بروتيني يمكن تصوره عن طريق النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة المثلى وظروف النشاف. تم إنشاء بروتوكول وتدفق عمل النشاف الغربي الذي يسمح بتقييم تنشيط كاسباز متعددة من نفس المجموعة الخلوية ، مما يوفر توصيفا شاملا لعمليات PCD. يمكن تطبيق هذه الطريقة عبر مجالات البحث في التنمية ، والتوازن ، والعدوى ، والالتهابات ، والسرطان لتقييم مسارات PCD عبر العمليات الخلوية في الصحة والمرض.

لوحظ PANoptosis استجابة للعديد من الالتهابات البكتيرية والفيروسية والفطرية والمحفزات الالتهابية الأخرى ، وكذلك في الخلايا السرطانية 44،48،49،50،51،52،53،54،56،57،58،60،<...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death at JoVE.com

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

يصف هذا البروتوكول طريقة شاملة لتقييم تنشيط الكاسباز (caspase-1 و caspase-3 و caspase-7 و caspase-8 و caspase-9 و caspase-11) استجابة لكل من النماذج في المختبر وفي الجسم الحي (في الفئران) للعدوى والشتائم العقيمة والسرطان لتحديد بدء مسارات موت الخلايا ، مثل pyroptosis ، موت الخلايا المبرمج ، necroptosis ، و PANoptosis.

تقييم تنشيط الكاسباز لتقييم موت الخلايا المناعية الفطرية

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

يوفر هذا البروتوكول فهما متعدد الأوجه لتنشيط عمليات موت الخلايا ، والتي يمكن أن توفر رؤى نقدية حول آليات المرض وإبلاغ الاستراتيجيات العلاجية. يعتمد هذا البروتوكول على استخدام تقنية أبسط والوصول إلى تنشيط caspases متعددة حتمية من مجموعة واحدة من الخلايا الداخلية لتحديد التنشيط بشكل كبير. وقد تورط موت الخلايا المناعية الفطرية عبر طيف المرض ، من العدوى إلى الأمراض الالتهابية إلى السرطانات.يمكن أن يوفر فهم الآليات الجزيئية لموت الخلايا من خلال تنشيط الكاسباز رؤى مهمة لعمليات المرض. سيقوم الدكتور جوليان ، وهو باحث مشارك في مرحلة ما بعد الدكتوراه من أحد المختبرات ، بتوضيح الإجراء. بعد عزل نخاع العظم والتمييز بين BMDMs ، تصيب الخلايا بفيروس الأنفلونزا A.احسب حجم الفيروس المطلوب عند تعدد العدوى من 20 وحدة تشكيل البلاك. قم بإزالة الوسائط من BMDMs واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 500 ميكرولتر من PBS. أضف 450 ميكرولترا من فيروس الأنفلونزا A في DMEM عالي الجلوكوز بدون FBS المعطل بالحرارة إلى كل بئر ، واحتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في حاضنة مرطبة للسماح بالامتصاص.في نهاية الحضانة لمدة ساعة واحدة ، أضف 50 ميكرولترا من FBS المعطل بالحرارة وأعد الألواح إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. بعد 12 ساعة من الحضانة ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة. نضح 150 ميكرولتر من المادة الطافية وتجاهل أو احفظها لتحليل الطاف.لا تقم بإزالة المادة الطافية المتبقية. الآن ، قم بإنشاء محلول جمع البروتين من خلال الجمع بين 50 ميكرولترا من محلول تحلل الكاسباز و 100 ميكرولتر من أربعة مخزن مؤقت XSDS لكل بئر. ثم أضف 150 ميكرولترا من المزيج إلى كل بئر.لكل بئر ، ماصة الخليط لجمع الخلايا المحللة والطاف. أثناء السحب ، اكشط قاع البئر بطرف الماصة لتعطيل الخلايا. بعد الكشط والماصة ، اجمع البروتين المحللي في أنابيب 1.5 ملليلتر.باستخدام كتلة حرارية ، قم بتسخين جميع الأنابيب إلى 100 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة. قم بإزالة الأنابيب من كتلة الحرارة وأجهزة الطرد المركزي عند 14،500 جم لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة لحبيبات أي مكونات غير قابلة للذوبان. تحضير جهاز الكهربائي مع هلام بولي أكريلاميد 12 ٪ مع 10 آبار.املأ جهاز الرحلان الكهربائي بمخزن مؤقت للتشغيل وقم بإزالة مشط الهلام. ثم سخني العينات على حرارة 100 درجة سلزية لمدة خمس دقائق. أجهزة الطرد المركزي العينات في 14،500 G لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة قبل التحميل.ثم قم بتحميل 30 ميكرولترا من العينة ببطء في كل بئر. استخدم محلول تحلل البروتين والبروتين المضاف أو متجانسة الأنسجة لبقع الكاسباز 1 و 3 و 7 و 8 ، واستخدم محلول تحلل البروتين DN RIPA الموصوف في البروتوكول أو متجانسة الأنسجة للكاسباز 11 و 9. لتقييم جميع caspases الستة في وقت واحد ، استخدم نفس الإجراء لتحميل نفس العينات في كل من المواد الهلامية الستة.قم بتوصيل جهاز الرحلان الكهربائي بمصدر الطاقة واضبط الطاقة على 80 فولت لمدة 20 دقيقة لبدء تشغيل الهلام. بعد أول 20 دقيقة ، اضبط الطاقة على 100 فولت لمدة 45 إلى 60 دقيقة. مراقبة الجبهة صبغة.بمجرد وصول مقدمة الصبغة إلى قاع الجل ، قم بإيقاف تشغيل الطاقة. أثناء تشغيل الجل ، قم بإعداد المخزن المؤقت للنقل كما هو موضح في المخطوطة. اجعل الحل جديدا في كل مرة.قم بإزالة الجل من جهاز الرحلان الكهربائي باستخدام محرر الجل. لإعداد مكدس النقل للهلام ، قم بتنشيط غشاء PVDF عن طريق نقعه في الميثانول لمدة دقيقة واحدة. بلل قطعتين من ورق الترشيح والهلام وغشاء PVDF وانقل المخزن المؤقت لمدة خمس دقائق.احتفظ بغشاء PVDF والهلام في حاويات منفصلة خلال هذه الحضانة التي تستغرق خمس دقائق. ابدأ في تجميع مكدس النقل على النظام شبه الجاف. على الجانب السفلي من البلاتين نانو ، ضع قطعة واحدة من ورق الترشيح ، وغشاء PVDF ، والهلام ، وأخيرا قطعة واحدة من ورق الترشيح.قم بتدوير فقاعات الهواء برفق أو الضغط عليها بين الطبقات وأغلق الجزء العلوي من النظام. الآن ، اتصل بمصدر الطاقة. اضبط الطاقة على 25 فولت لمدة 40 دقيقة.بعد النقل ، قم بتفكيك مكدس النقل ، وجمع الغشاء ، ووضعه في طبق بتري مربع. بعد ذلك ، قم بإجراء حجب الغشاء عن طريق إضافة 15 ملليلتر من محلول الحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ واحتضان الغشاء على شاكر هزاز عند 50 إلى 70 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول الحجب ، وأضف 10 ملليلتر من محلول الأجسام المضادة المخفف ، واحتضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو أربع درجات مئوية طوال الليل على شاكر هزاز ، كما هو موضح سابقا.بعد ذلك ، اجمع محلول الأجسام المضادة واغسل الغشاء بإضافة 15 مل من TBST إلى الغشاء على شاكر هزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. تجاهل TBST. كرر الغسيل مع 15 ملليلتر من TBST ثلاث مرات.أضف 10 ملليلتر من محلول الأجسام المضادة المترافق HRP الثانوي المخفف. احتضان على شاكر هزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة ، بمجرد إزالة محلول الأجسام المضادة ، اغسل الغشاء بإضافة 15 مل من TBST على شاكر هزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.بعد الانتهاء من خطوات الغسيل وإزالة TBST ، أضف 10 ملليلتر من ركيزة HRP عالية الحساسية. اتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. إزالة الغشاء من الركيزة.انتقل مباشرة إلى التصوير باستخدام جهاز تصوير التلألؤ الكيميائي مع إدخال درج الترانس الأبيض الملحق في الموضع السفلي. فضح الغشاء باستخدام وضع التعرض التلقائي. يتم تحليل الكاسباز المؤيد والمنشط 1 و 11 و 3 و 7 و 8 و 9 في النوع البري وطفرة ZBP1 بعد عدوى فيروس الأنفلونزا A ، والنوع البري و AIM2 المتحور بعد عدوى HSV1 ، وعدوى Francisella novicida ، أو النوع البري و NLRP3 المتحور BDMs بعد تحفيز عديد السكاريد الدهني وتحفيز ATP.لا تخضع الخلايا التي تفتقر إلى مستشعرات PANoptosis الأولية لموت الخلايا القوي استجابة للمحفزات المشابهة ل PANoptosis. تؤدي عدوى فيروس الأنفلونزا A إلى تكوين ZBP1-PANoptosome ويتم حماية الخلايا الناقصة ZBP1 بشكل كبير من موت الخلايا أثناء عدوى فيروس الأنفلونزا A. وبالمثل ، فإن عدوى HSV1 و Francisella novicida تحفز تكوين AIM2 PANoptosome ، وتفشل الخلايا الناقصة AIM2 في الخضوع لموت الخلايا القوي استجابة لهذه العدوى.تتم حماية الخلايا التي تفتقر إلى أجهزة الاستشعار الالتهابية في المنبع من موت الخلايا استجابة للمحفزات الخاصة بها ، ولا تخضع الخلايا الناقصة NLRP3 لموت الخلايا استجابة لعديد السكاريد الدهني و ATP. من المهم أن تتذكر تحضير خليط من كل من محللات الخلايا لتحديد كاسباز معين. بعد تحميل النفاثة ، يجب تخزين العينة المضيئة ناقص 20 درجة للحفاظ على سلامة أهداف الكاسباز للمتابعة بالاقتران مع هذا البروتوكول ، يمكن استخدام تصوير موت الخلايا في الوقت الفعلي أو مقايسات LDH لمراقبة تنفيذ موت الخلايا ، ويمكن استخدام ELIZAs للتحقق من إطلاق السيتوكينات أو DAMPs من الخلايا التي تمر بأنواع مختلفة من موت الخلايا.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

سبع خطوات لخلايا النجمية

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

طرق لتقييم موت الخلايا بيتا وساطة من قبل الخلايا اللمفاوية التائية السامة

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

الكمي للاستجابة انفجر الجهاز التنفسي باعتبارها مؤشر الفطري المناعي الصحة في الزرد

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

تشريح الفطري اشارة المناعة في التهرب الفيروسية من الإنتاج خلوى

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

باستخدام الحمض النووي الريبي التدخل للتحقيق في الاستجابة المناعية الفطرية في الفأر الضامة

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

التصوير غير الغازية من الاستجابة المناعية الفطرية في نموذج الزرد يرقات<em&gt; العقدية iniae</em&gt; العدوى

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

الأحماض الدهنية المشبعة الحث على موت الخلايا المرتبطة السيراميد بلعم

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling TUNEL and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

استخدام "المحطة الطرفية ترانسفيراز" بوساطة dUTP نك نهاية الوسم (TUNEL) و Caspase 3/7 فحوصات "تدبير موت الخلايا البشرة" في الضفادع مع تشيتريديوميكوسيس

Amphibians are experiencing a great loss in biodiversity globally and one of the major causes is the infectious disease chytridiomycosis. This disease is ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

الكشف عن التنشيط إينفلاماسومي وموت الخلايا بيروبتوتيك في مورين الضامة المشتقة من نخاع العظام

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

تقييم عامل إيمونوستيمولاتوري: اللمفاوية استخراج الأنسجة وحقن تنشيط الخلية الجذعية تعتمد على الطريق

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...