Name: evaluation of caspase activation to assess innate immune cell death
Uploaded: 2023-01-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death at JoVE.com

Vi takker medlemmer af Kanneganti-laboratoriet for deres kommentarer og forslag, og vi takker J. Gullett, ph.d., for videnskabelig redigeringsstøtte. Arbejdet i vores laboratorium støttes af National Institutes of Health (NIH) tilskud AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 og CA253095 (til T.-D.K.) og af de amerikanske libanesiske syriske associerede velgørenhedsorganisationer (til T.-D.K.). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health.

Dyrenes brug og procedurer blev godkendt af St. Jude Children's Research Hospital Committee on the Use and Care of Animals.
1. Forberedelse af løsningerne
<ol><li>Forbered medier med L929-kondition.<ol><li>Plade 1 × 106 L929-celler (se materialetabel) i en 182 cm2 vævskulturkolbe indeholdende 50 ml L929-dyrkningsmedier (se tabel 1 vedrørende fremstilling af medier).</li>
		<li>Cellerne dyrkes i en befugtet inkubator...

Overvågning af caspase spaltning og aktivering giver et af de mest omfattende billeder af medfødt immun PCD-aktivering som en del af det medfødte immunrespons. Protokollen beskrevet her demonstrerer en strategi til overvågning af caspaseaktivering som reaktion på IAV-, HSV1- og F. novicida-infektioner og den sterile udløser LPS + ATP, men mange andre stimuli kan inducere PCD og kan bruges i denne metode, som det er vist i flere publikationer 44,48,49,50,51,52,53,54,56<sup class="xre...

Det medfødte immunsystem fungerer som den første forsvarslinje under infektion og som reaktion på sterile stimuli, såsom vævsskade og ændringer i homeostase. Medfødte immunsensorer på celleoverfladen og i cytoplasmaet reagerer på patogen- eller skadeassocierede molekylære mønstre (henholdsvis PAMP'er eller DAMP'er) for at udløse inflammatoriske signalveje og cellulære reaktioner. En af nøgleprocesserne i det medfødte immunrespons er induktion af celledød for at fjerne inficerede eller beskadigede celler og drive yderligere medfødte og adaptive immunresponser. Programmeret celledød (PCD) er en meget bevaret proces på tværs af arter, der fremhæver dens evolutionære betydning som en medfødt immunmekanisme.
Der er flere medfødte immun-PCD-veje, der kan aktiveres i alle celletyper. Caspaser er en nøglefamilie af stærkt konserverede, intracellulære, cysteinafhængige proteaser, der er kritiske på tværs af mange PCD-veje, herunder den traditionelt ikke-inflammatoriske apoptosevej samt inflammatoriske PCD-veje såsom pyroptose, nekrotose og PANoptosis 1,2,3,4,5 . Der er 11 humane og 10 murine caspaser, der er veldefinerede, samt pseudo-caspaser, der kan være funktionelle, og de fleste udtrykkes konstitutivt som inaktive monomere eller dimeriske pro-caspaser, der kræver spaltning til aktivering 6,7. Kaspaser indeholder også vigtige domæner til rekruttering og dannelse af multiproteinkomplekser. Disse omfatter caspase aktivering og rekruttering domæne (CARD), som kan findes i caspase-1, caspase-2, caspase-4, caspase-5, caspase-9 og caspase-11, eller død effektor domæne (DED), som findes i caspase-8 og caspase-10. Gennem både deres proteolytiske aktivitet og deres evne til at danne multiproteinkomplekser er caspaser kritiske drivkræfter for medfødt immun-PCD.
Caspasernes rolle i medfødt immun-PCD blev først identificeret i apoptose, hvor initiatorcaspaserne, caspase-2, caspase-8, caspase-9 og caspase-10, aktiverer bødlekaspaserne, caspase-3, caspase-6 og caspase-7, for at drive celledød 8,9,10,11,12. Initiator-caspaser kan aktiveres af forskellige signalkaskader; Den ydre vej aktiverer caspase-8 gennem ekstracellulær ligand-induceret dødsreceptorsignalering, og den indre vej aktiverer caspase-9 gennem forstyrrelse af mitokondrieintegritet13. Aktiverede initiatorcaspaser spalter linkeren, der adskiller de store og små katalytiske underenheder af bødlekaser for at producere deres aktive former. Bødlekaserne spalter derefter deres substrater for at adskille cellen, hvilket resulterer i DNA-nedbrydning, membranblæsning, nuklear fragmentering og frigivelse af apoptotiske legemer14,15. Denne proces ender typisk i en ikke-lytisk og ikke-inflammatorisk form for celledød, når den kombineres med den øjeblikkelige clearance af de døende celler ved efferocytose16. Imidlertid kan defekter i efferocytose eller mangel på fagocytiske celler føre til akkumulering af apoptotiske celler, som derefter gennemgår lytisk og inflammatorisk celledød17,18.
De inflammatoriske caspaser, herunder caspase-1 (menneske og mus), caspase-4 og caspase-5 (menneske) og caspase-11 (mus), har vist sig at blive aktiveret under en form for inflammatorisk medfødt immun-PCD (III-PCD) kaldet pyroptose. Caspase-1-aktivering er forbundet med dannelsen af inflammasomer, som er multiproteinkomplekser indeholdende en cytosolisk medfødt immunsensor, et adaptormolekyle (apoptoseassocieret specklignende protein indeholdende et CARD [ASC]) og caspase-1. Dannelsen af dette kompleks tillader caspase-1 at gennemgå nærhedsmedieret autoproteolyse for at frigive sin aktive form, som kan spalte målsubstrater, herunder de proinflammatoriske cytokiner interleukin (IL)-1β og IL-18 og det poredannende molekyle gasdermin D (GSDMD)19,20,21,22,23 . Caspase-11, caspase-4 og caspase-5 kan også aktivere GSDMD uden opstrøms dannelse af inflammasomet efter detektering af PAMP'er såsom lipopolysaccharid (LPS)19,20. Disse caspaser gennemgår dimerisering efterfulgt af oligomerisering og selvspaltning til aktivering ved binding til cytosolisk LPS, hvilket fører til ikke-kanonisk inflammasomaktivering 24,25,26 og caspase-1-aktivering på en celle-iboende måde for at inducere IL-1β og IL-18 modning 20. Modningen og frigivelsen af disse proinflammatoriske cytokiner karakteriserer disse caspaser som "inflammatoriske". Derudover har den apoptotiske caspase-8 vist sig at lokalisere til inflammasomet, hvilket giver en forbindelse mellem apoptotiske og pyroptotiske processer. Undersøgelser har vist, at den apoptotiske caspase-8 også er kritisk for regulering af en anden form for PCD kaldet necroptosis. Tabet af caspase-8 resulterer i spontan receptor-interagerende serin-threonin kinase 3 (RIPK3)-medieret blandet afstamning kinase domæne-lignende pseudokinase (MLKL) aktivering for at drive III-PCD vejen for necroptose 27,28,29,30,31,32,33,34,35.
Mens caspaser historisk er blevet klassificeret som "apoptotisk" eller "inflammatorisk" baseret på den type celledød, de initierer, tyder voksende beviser på, at der er omfattende krydstale mellem de medfødte immun-PCD-veje gennem caspaser 3,4. For eksempel spalter den inflammatoriske caspase-1 fra inflammasomer den apoptotiske caspase-7 på sit kanoniske aktiveringssted34. Caspase-1-aktivering kan også føre til spaltning af apoptotiske substrater, såsom poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1)36. I celler, der mangler GSDMD, kan caspase-1 også spalte caspase-337,38. Derudover kan den kanonisk apoptotiske caspase-3 spalte gasdermin E (GSDME) for at inducere PCD17,18 og behandler også GSDMD i en inaktiv form40. Desuden er caspase-8 rekruttering til inflammasomkomplekset blevet observeret 39,40,41,42,43,44,45, og caspase-8 er en nøgleregulator for kanonisk og ikke-kanonisk inflammasomaktivering 39. Der er også overlappende og overflødige roller for caspase-8 og caspase-1 i mange inflammatoriske tilstande, og medfødt immun-PCD karakteriseret ved aktivering af pyroptotiske, apoptotiske og necroptotiske komponenter forekommer på tværs af sygdomsspektret 39,46,47,48,49,50.
Baseret på denne krydstale mellem inflammatoriske og apoptotiske caspaser blev der identificeret et centralt hul i den mekanistiske forståelse af medfødt immunitet og PCD, hvilket førte til opdagelsen af PANoptose. PANoptose er en unik form for III-PCD, der aktiveres som reaktion på patogener, PAMP'er, DAMP'er og ændringer i homeostase og reguleres af PANoptosomer - mangefacetterede makromolekylære komplekser, der integrerer komponenter fra andre celledødsveje 44,50,51,52,53,54,55 . Totaliteten af de biologiske virkninger i PANoptose kan ikke individuelt redegøres for ved pyroptose, apoptose eller necroptose alene 3,4,35,36,39,46,47,48, da PANoptose er karakteriseret ved aktivering af flere caspaser, herunder caspase-1, caspase-11, caspase-8, caspase-9, caspase-3 og / eller caspase-7, Afhængigt af konteksten 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptose er i stigende grad blevet impliceret i infektiøse og inflammatoriske sygdomme samt i kræft og kræftbehandlinger 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56 ,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.
I betragtning af den væsentlige rolle, som caspaser spiller på tværs af celledødsveje, herunder i apoptose, pyroptose, nekrotose og PANoptose, er det vigtigt at udvikle teknikker til at karakterisere deres aktivering og forstå den fulde kompleksitet af PCD-veje. Protokollen her beskriver en metode til at stimulere celler og måle den efterfølgende aktivering af caspaser (figur 1). Denne metode udnytter den proteolytiske spaltning af caspaser, som generelt er nødvendig for deres aktivering, som et middel til at studere dem. Gennem western blotting kan proteinstørrelserne bestemmes, hvilket muliggør klar visualisering og differentiering af inaktive pro-caspaser og deres aktiverede, spaltede former.
De største fordele ved denne protokol er 1) dens evne til at vurdere aktiveringen af flere caspaser parallelt fra en enkelt population af endogene celler for mere præcist at bestemme PCD-aktivering og 2) brugen af relativt enkle laboratorieteknikker, der ikke kræver omfattende træning eller dyrt udstyr. Tidligere protokoller har brugt western blotting, fluorescerende reportere eller antistoffarvning til at overvåge caspaseaktivering i kultursupernatanter, celle- og vævslysater, hele celler via mikroskopi og in vivo 67,68,69,70,71, men disse teknikker overvåger generelt kun en eller to caspaser i en prøve. Mens syntetiske peptidsubstrater indeholdende caspase spaltningssteder, der fluorescerer ved spaltning, er blevet brugt til at overvåge caspaseaktivering i celle- eller vævslysater69, kan disse substrater ofte spaltes af mere end en caspase, hvilket gør det vanskeligt at bestemme den specifikke aktivering af individuelle caspaser i dette system. Derudover giver brugen af western blotting snarere end brugen af fluorescerende reportere eller andre tagbaserede metoder forskere mulighed for at bruge endogene celler i stedet for at skabe specifikke cellelinjer med reportergener. Der er flere fordele ved at bruge endogene celler, herunder det faktum, at mange udødeliggjorte cellelinjer manglernøglecelledødsmolekyler 72,73, hvilket kan påvirke resultaterne. Derudover giver brug af endogene celler mulighed for evaluering af forskellige celletyper, såsom makrofager, epitelceller og endotelceller, snarere end en enkelt afstamning. Western blotting er også en relativt enkel og omkostningseffektiv teknik, der kan udføres i laboratorier rundt om i verden uden behov for stort, dyrt udstyr eller komplicerede opsætninger.
Denne protokol er bredt anvendelig på tværs af biologi til at forstå både celledødsafhængige og celledødsuafhængige funktioner hos caspaser, herunder deres stilladsroller og funktioner i andre inflammatoriske signalveje74. Anvendelse af denne metode giver mulighed for en samlet tilgang i undersøgelsen af medfødte immun-PCD-veje og inflammatorisk signalering på tværs af sygdomme og tilstande, og denne protokol kan bruges til at identificere kritiske reguleringsprocesser og mekanistiske forbindelser, der vil informere udviklingen af fremtidige terapeutiske strategier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCHVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12% polyacrylamide gel with 10 wells&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needle&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm tissue culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>182-cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accessory white trans tray</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0834-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-1 antibody</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-20B-0042-C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-11 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB120-10454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-3 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-7 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-8 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-9 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;cleaved caspase-3 antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;cleaved caspase-7 antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;cleaved caspase-8 antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>315-035-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-035-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>112-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;&#946;-Actin antibody (C4) HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-47778 HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-atpl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Trypticase Soy Broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead bath</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-4598-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer D30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6133000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BME</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BO126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>CellTreat Scientific Products</td>
			<td>229315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence imager (Amersham 600)&#160;</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29083461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2&#160;chamber</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>221S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eelectrophoresis apparatus&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Francisella novicida (U112 strain)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel releaser&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-043-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herpes simplex virus 1 (HF strain)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti&#8211;caspase-1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB6215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti&#8211;caspase-8 antibody</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ALX-804-242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>v1.53a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])&#160;</td>
			<td>constructed per Hoffmann et al.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-1</td>
			<td>cell line for creating L929-conditioned media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP376-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminata Forte Western HRP substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUF0500</td>
			<td>standard-sensitivity HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDCK cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td>cell line for determining IAV viral titer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dried milk powder</td>
			<td>Kroger</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>PHOSS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power source&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking shaker</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S2035-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripping buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal Femto HRP substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34580</td>
			<td>high-sensitivity HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot semi-dry system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-3pelps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td>cell line for determining HSV1 viral titer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of caspase activation to assess innate immune cell death

Medfødt immunitet giver den kritiske første forsvarslinje som reaktion på patogener og sterile fornærmelser. En vigtig mekanistisk komponent i dette respons er initieringen af medfødt immunprogrammeret celledød (PCD) for at eliminere inficerede eller beskadigede celler og udbrede immunresponser. Imidlertid er overskydende PCD forbundet med betændelse og patologi. Derfor er forståelse af aktivering og regulering af PCD et centralt aspekt ved karakterisering af medfødte immunresponser og identifikation af nye terapeutiske mål på tværs af sygdomsspektret.
Denne protokol tilvejebringer metoder til karakterisering af medfødt immun-PCD-aktivering ved overvågning af caspaser, en familie af cysteinafhængige proteaser, der ofte er forbundet med forskellige PCD-veje, herunder apoptose, pyroptose, nekrotose og PANoptose. Indledende rapporter karakteriserede caspase-2, caspase-8, caspase-9 og caspase-10 som initiator-caspaser og caspase-3, caspase-6 og caspase-7 som effektor-caspaser i apoptose, mens senere undersøgelser fandt de inflammatoriske caspaser, caspase-1, caspase-4, caspase-5 og caspase-11, drev pyroptose. Det er nu kendt, at der er omfattende krydstale mellem caspaserne og andre medfødte immun- og celledødsmolekyler på tværs af de tidligere definerede PCD-veje, hvilket identificerer et centralt videnshul i den mekanistiske forståelse af medfødt immunitet og PCD og fører til karakterisering af PANoptosis. PANoptose er en unik medfødt immuninflammatorisk PCD-vej reguleret af PANoptosome-komplekser, som integrerer komponenter, herunder caspaser, fra andre celledødsveje.
Her tilvejebringes metoder til vurdering af aktiveringen af caspaser som reaktion på forskellige stimuli. Disse metoder muliggør karakterisering af PCD-veje både in vitro og in vivo, da aktiverede caspaser gennemgår proteolytisk spaltning, der kan visualiseres ved western blotting ved anvendelse af optimale antistoffer og blottingbetingelser. Der er etableret en protokol og western blotting-arbejdsgang, der muliggør vurdering af aktiveringen af flere caspaser fra den samme cellulære population, hvilket giver en omfattende karakterisering af PCD-processerne. Denne metode kan anvendes på tværs af forskningsområder inden for udvikling, homeostase, infektion, inflammation og kræft til at evaluere PCD-veje gennem cellulære processer inden for sundhed og sygdom.

PANoptose er blevet observeret som reaktion på talrige bakterielle, virale og svampeinfektioner og andre inflammatoriske stimuli såvel som i kræftceller 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 ...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death at JoVE.com

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Denne protokol beskriver en omfattende metode til vurdering af caspaseaktivering (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 og caspase-11) som reaktion på både in vitro og in vivo (hos mus) modeller for infektion, sterile fornærmelser og kræft for at bestemme initieringen af celledødsveje, såsom pyroptose, apoptose, nekrotose og PANoptose.

Evaluering af caspaseaktivering for at vurdere medfødt immuncelledød

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Denne protokol giver en mangesidet forståelse af aktiveringen af celledødsprocesser, som kan give kritisk indsigt i sygdomsmekanismer og informere terapeutiske strategier. Denne protokol er afhængig af brugen af en enklere teknik og for at få adgang til aktiveringen af flere caspaser, der er bydende nødvendige fra en enkelt population af endogene celler for i høj grad at bestemme aktivering. Medfødt immuncelledød har været impliceret på tværs af sygdomsspektret, fra infektioner til inflammatoriske sygdomme til kræft.Forståelse af de molekylære mekanismer for celledød gennem caspaseaktivering kan give kritisk indsigt i sygdomsprocesser. Dr.Julieann, en postdoktoral forskningsassistent fra et laboratorium, vil demonstrere proceduren. Efter isolering af knoglemarven og differentiering af BMDM'erne inficeres cellerne med influenza A-virus.Beregn det nødvendige virusvolumen ved en mangfoldighed af infektion på 20 plakdannende enheder. Fjern mediet fra BMDM'erne og vask cellerne en gang med 500 mikroliter PBS. Tilsæt 450 mikroliter influenza A-virus i DMEM med høj glukose uden varmeinaktiveret FBS til hver brønd, og inkuber pladerne ved 37 grader Celsius i en time i en befugtet inkubator for at tillade absorption.Ved afslutningen af en times inkubation tilsættes 50 mikroliter varmeinaktiveret FBS og returnerer pladerne til inkubatoren ved 37 grader Celsius i alt 12 timer. Efter 12 timers inkubation fjernes pladen fra inkubatoren. Der suges 150 mikroliter supernatant, og dette kasseres eller gemmes til supernatantanalyse.De resterende supernatanter må ikke fjernes. Opret nu proteinopsamlingsløsningen ved at kombinere 50 mikroliter caspase lysisbuffer og 100 mikroliter fire XSDS-buffer pr. Brønd. Derefter tilsættes 150 mikroliter af blandingen til hver brønd.For hvert hul pipetteres blandingen for at opsamle de lyserede celler og supernatanten. Under pipettering skraber du bunden af brønden med pipettespidsen for at forstyrre cellerne. Efter skrabning og pipettering samles proteinlysatet i mærkede 1,5 ml rør.Brug en varmeblok til at opvarme alle rørene til 100 grader Celsius i 12 minutter. Fjern rørene fra varmeblokken og centrifuger ved 14.500 G i 30 sekunder ved stuetemperatur for at pelletere eventuelle uopløselige komponenter. Forbered elektroforeseapparatet med en 12% polyacrylamidgel med 10 huller.Fyld elektroforeseapparatet med løbende buffer og fjern gelkammen. Opvarm derefter prøverne ved 100 grader Celsius i fem minutter. Centrifuger prøverne ved 14.500 G i 30 sekunder ved stuetemperatur før ilægning.Derefter lægges langsomt 30 mikroliter af prøven i hver brønd. Der anvendes kombineret supernatant- og proteinlysat- og caspaselysebuffer eller vævshomogenatet til caspase 1, 3, 7 og 8 blots, og der anvendes proteinlysatbufferen DN RIPA som beskrevet i protokollen eller vævshomogenatet til caspase 11 og 9. For at evaluere alle seks caspaser på én gang skal du bruge den samme procedure til at indlæse de samme prøver i hver af de seks geler.Tilslut elektroforeseapparatet til strømkilden, og indstil strømmen til 80 volt i 20 minutter for at starte gelkørslen. Efter de første 20 minutter skal du justere effekten til 100 volt i 45 til 60 minutter. Overhold farvefronten.Når farvestoffronten når bunden af gelen, skal du slukke for strømmen. Mens gelen løber, klargøres overførselsbufferen som beskrevet i manuskriptet. Gør opløsningen frisk hver gang.Fjern gelen fra elektroforeseapparatet ved hjælp af geludløseren. For at opsætte overførselsstakken til gelen skal du aktivere en PVDF-membran ved at lægge den i blød i methanol i et minut. Forvåd to stykker filterpapir, gelen og PVDF-membranen og overfør bufferen i fem minutter.Opbevar PVDF-membranen og gelen i separate beholdere under denne fem minutters inkubation. Begynd at samle overførselsstakken på det halvtørre system. På den nederste platin nano-side skal du placere et stykke filterpapir, PVDF-membranen, gelen og til sidst et stykke filterpapir.Rul forsigtigt ud eller tryk luftbobler ud mellem lagene, og luk toppen af systemet. Tilslut nu til strømkilden. Indstil strømmen til 25 volt i 40 minutter.Efter overførslen skal du adskille overførselsstakken, samle membranen og placere den i en firkantet petriskål. Udfør derefter membranblokering ved at tilsætte 15 ml af en 5% skummetmælksopløsning og inkubere membranen på en gyngeryster ved 50 til 70 RPM ved stuetemperatur i en time. Efter inkubation fjernes blokeringsopløsningen, tilsættes 10 ml af den fortyndede antistofopløsning og inkuberes i to timer ved stuetemperatur eller fire grader Celsius natten over på en gyngeryster, som tidligere vist.Derefter samles antistofopløsningen og vaskes membranen ved at tilsætte 15 ml TBST til membranen på en gyngeryster ved stuetemperatur i 10 minutter. Kassér TBST. Gentag vasken med 15 ml TBST tre gange.Tilsæt 10 ml af den fortyndede sekundære HRP-konjugerede antistofopløsning. Inkuber på en gyngeryster ved stuetemperatur i en time. Ved afslutningen af inkubationen, når antistofopløsningen er fjernet, vaskes membranen ved at tilsætte 15 ml TBST på en gyngeryster ved stuetemperatur i 10 minutter.Efter afslutning af vasketrinnene og fjernelse af TBST tilsættes 10 ml af det højfølsomme HRP-substrat. Lad det sidde ved stuetemperatur i et minut. Fjern membranen fra underlaget.Fortsæt direkte til billeddannelsen ved hjælp af et kemiluminescenskamera med tilbehørets hvide transbakke indsat i den nederste position. Udsæt membranen ved hjælp af automatisk eksponeringstilstand. Pro og aktiveret caspase 1, 11, 3, 7, 8 og 9 i vildtype og ZBP1-mutant efter influenza A-virusinfektion, vildtype og AIM2-mutant efter HSV1-infektion og Francisella novicida-infektion eller vildtype og NLRP3-mutant BDM'er efter lipopolysaccharid og ATP-stimulering analyseres.Celler, der mangler opstrøms PANoptose-sensorer, gennemgår ikke robust celledød som reaktion på de beslægtede PANoptose-inducerende stimuli. Influenza A-virusinfektion inducerer dannelsen af ZBP1-PANoptosomet, og cellerne med ZBP1-mangel er signifikant beskyttet mod celledød under influenza A-virusinfektion. På samme måde inducerer HSV1- og Francisella novicida-infektioner dannelsen af AIM2 PANoptosomet, og AIM2-mangelfulde celler undlader at gennemgå robust celledød som reaktion på disse infektioner.Celler, der mangler opstrøms inflammasomsensorer, er beskyttet mod celledød som reaktion på deres respektive stimuli, og NLRP3-mangelfulde celler gennemgår ikke celledød som reaktion på lipopolysaccharid og ATP. Det er vigtigt at huske at forberede en blanding af begge cellelysat for at bestemme en specifik caspase. Efter ilægning af strålen skal lysprøven opbevares minus 20 grader for at opretholde integriteten af målene for caspase til opfølgning I forbindelse med denne protokol kan realtidsbilleddannelse af celledød eller LDH-assays bruges til at overvåge udførelsen af celledød, og ELIZA'er kan bruges til at kontrollere frigivelsen af cytokiner eller DAMP'er fra celler, der gennemgår forskellige typer celledød.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Kvantificering af den Respiratory burstrespons som en indikator for medfødte immunforsvar Sundhed i zebrafisk

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Dissekere medfødte immunforsvar signalering i Viral Evasion af cytokinproduktion

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Brug af RNA-interferens Undersøge Innate immunresponset i musemakrofager

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Ikke-invasiv billeddannelse af Innate immunrespons i en zebrafisk Larve Model af<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infektion

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Mættede fedtsyrer fremkalde ceramid-associerede makrofag celledød

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling TUNEL and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

Ved hjælp af Terminal-Transferase-medieret dUTP Nick ende-mærkning (TUNEL) og Caspase 3/7-undersøgelser til foranstaltning Epidermal celledød i frøer med Chytridiomycosis

Amphibians are experiencing a great loss in biodiversity globally and one of the major causes is the infectious disease chytridiomycosis. This disease is ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Påvisning af Inflammasome aktivering og Pyroptotic celledød i Murine knoglemarv-afledte makrofager

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

Immunstimulerende middel evaluering: Lymfoide væv udvinding og injektion rute-afhængige dendritiske celle aktivering

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...