Name: evaluation of caspase activation to assess innate immune cell death
Uploaded: 2023-01-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death at JoVE.com

We bedanken leden van het Kanneganti-lab voor hun opmerkingen en suggesties, en we bedanken J. Gullett, PhD, voor wetenschappelijke bewerkingsondersteuning. Het werk in ons lab wordt ondersteund door National Institutes of Health (NIH) subsidies AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 en CA253095 (aan T.-D.K.) en door de Amerikaanse Libanese Syrian Associated Charities (aan T.-D.K.). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Het gebruik en de procedures voor dieren werden goedgekeurd door het St. Jude Children's Research Hospital Committee on the Use and Care of Animals.
1. De oplossingen voorbereiden
<ol><li>Bereid L929-geconditioneerde media voor.<ol><li>Plaat 1 × 106 L929-cellen (zie materiaaltabel) in een 182 cm 2-weefselkweekkolf met 50 ml L929-kweekmedia (zie tabel 1 voor de bereiding van de media).</li>
		<li>Kweek de cellen in een ...

Het monitoren van caspase splitsing en activering biedt een van de meest uitgebreide beelden van aangeboren immuun PCD-activering als onderdeel van de aangeboren immuunrespons. Het hier beschreven protocol demonstreert een strategie om caspase-activering te controleren als reactie op IAV-, HSV1- en F. novicida-infecties en de steriele trigger LPS + ATP, maar tal van andere stimuli kunnen PCD induceren en kunnen in deze methode worden gebruikt, zoals is aangetoond in verschillende publicaties 44,48,49,50,51,52,53...

Het aangeboren immuunsysteem fungeert als de eerste verdedigingslinie tijdens infectie en als reactie op steriele stimuli, zoals weefselbeschadiging en veranderingen in homeostase. Aangeboren immuunsensoren op het celoppervlak en in het cytoplasma reageren op pathogene of schade-geassocieerde moleculaire patronen (respectievelijk PAMPs of DAMPs) om ontstekingssignaleringsroutes en cellulaire reacties te activeren. Een van de belangrijkste processen van de aangeboren immuunrespons is de inductie van celdood om geïnfecteerde of beschadigde cellen te verwijderen en verdere aangeboren en adaptieve immuunresponsen te stimuleren. Geprogrammeerde celdood (PCD) is een zeer geconserveerd proces tussen soorten, wat het evolutionaire belang ervan als een aangeboren immuunmechanisme benadrukt.
Er zijn verschillende aangeboren immuun PCD-routes die in alle celtypen kunnen worden geactiveerd. Caspasen zijn een belangrijke familie van sterk geconserveerde, intracellulaire, cysteïne-afhankelijke proteasen die van cruciaal belang zijn voor veel PCD-routes, waaronder de traditioneel niet-inflammatoire apoptoseroute, evenals inflammatoire PCD-routes zoals pyroptose, necroptose en PANoptose 1,2,3,4,5 . Er zijn 11 menselijke en 10 muriene caspasen die goed gedefinieerd zijn, evenals pseudo-caspasen die functioneel kunnen zijn, en de meeste worden constitutief uitgedrukt als inactieve monomere of dimerische pro-caspasen die decolleté vereisen voor activering 6,7. Caspasen bevatten ook belangrijke domeinen voor de rekrutering en vorming van multiproteïnecomplexen. Deze omvatten het caspase-activerings- en rekruteringsdomein (CARD), dat te vinden is in caspase-1, caspase-2, caspase-4, caspase-5, caspase-9 en caspase-11, of het death effector-domein (DED), dat wordt gevonden in caspase-8 en caspase-10. Door zowel hun proteolytische activiteit als hun vermogen om multiproteïnecomplexen te vormen, zijn caspasen kritieke aanjagers van aangeboren immuun-PCD.
De rol van caspasen in aangeboren immuun-PCD werd voor het eerst geïdentificeerd in apoptose, waarbij de initiator caspases, caspase-2, caspase-8, caspase-9 en caspase-10, de beul caspases, caspase-3, caspase-6 en caspase-7 activeren om celdood 8,9,10,11,12 te veroorzaken. Initiator caspasen kunnen worden geactiveerd door diverse signaalcascades; De extrinsieke route activeert caspase-8 door extracellulaire ligand-geïnduceerde doodsreceptorsignalering en de intrinsieke route activeert caspase-9 door de verstoring van mitochondriale integriteit13. Geactiveerde initiator caspasen splitsen de linker en scheiden de grote en kleine katalytische subeenheden van beul caspasen om hun actieve vormen te produceren. De caspasen van de beul splitsen vervolgens hun substraten om de cel te demonteren, wat resulteert in DNA-degradatie, membraanblebbing, nucleaire fragmentatie en het vrijkomen van apoptotische lichamen14,15. Dit proces eindigt meestal in een niet-lytische en niet-inflammatoire vorm van celdood in combinatie met de onmiddellijke klaring van de stervende cellen door efferocytose16. Defecten in efferocytose of een gebrek aan fagocytische cellen kunnen echter leiden tot de accumulatie van apoptotische cellen, die vervolgens lytische en inflammatoire celdood ondergaan17,18.
De inflammatoire caspasen, waaronder caspase-1 (mens en muis), caspase-4 en caspase-5 (menselijk) en caspase-11 (muis), zijn ontdekt te worden geactiveerd tijdens een vorm van inflammatoir aangeboren immuun PCD (III-PCD) genaamd pyroptose. Caspase-1-activering is geassocieerd met de vorming van inflammasomen, multiproteïnecomplexen die een cytosolische aangeboren immuunsensor, een adaptermolecuul (apoptose-geassocieerd speck-achtig eiwit met een CARD [ASC]) en caspase-1 bevatten. De vorming van dit complex stelt caspase-1 in staat om nabijheidsgemedieerde autoproteolyse te ondergaan om zijn actieve vorm vrij te geven, die doelsubstraten kan splitsen, waaronder de pro-inflammatoire cytokines interleukine (IL) -1β en IL-18 en het porievormende molecuul gasdermine D (GSDMD)19,20,21,22,23 . Caspase-11, caspase-4 en caspase-5 kunnen GSDMD ook activeren zonder de stroomopwaartse vorming van het inflammasoom na het detecteren van PAMP's zoals lipopolysaccharide (LPS)19,20. Deze caspasen ondergaan dimerisatie gevolgd door oligomerisatie en zelfsplitsing voor activering na binding aan cytosolisch LPS, wat leidt tot niet-canonieke inflammasoomactivering24,25,26 en caspase-1 activering op een celintrinsieke manier om IL-1β en IL-18 rijping20 te induceren. De rijping en afgifte van deze pro-inflammatoire cytokines karakteriseren deze caspasen als 'inflammatoir'. Bovendien is gebleken dat de apoptotische caspase-8 zich lokaliseert naar het inflammasoom, waardoor een verband wordt gelegd tussen apoptotische en pyroptotische processen. Studies hebben aangetoond dat de apoptotische caspase-8 ook van cruciaal belang is voor het reguleren van een andere vorm van PCD genaamd necroptose. Het verlies van caspase-8 resulteert in spontane receptor-interagerende serine-threonine kinase 3 (RIPK3)-gemedieerde gemengde lineage kinase domein-like pseudokinase (MLKL) activering om de III-PCD route van necroptose 27,28,29,30,31,32,33,34,35 aan te sturen.
Hoewel caspasen historisch zijn geclassificeerd als "apoptotisch" of "inflammatoir" op basis van het type celdood dat ze initiëren, suggereert groeiend bewijs dat er uitgebreide overspraak is tussen de aangeboren immuun-PCD-routes door caspasen 3,4. Bijvoorbeeld, de inflammatoire caspase-1 van inflammasomen splitst de apoptotische caspase-7 op zijn canonieke activeringsplaats34. Caspase-1 activering kan ook leiden tot de splitsing van apoptotische substraten zoals poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1)36. In cellen zonder GSDMD kan caspase-1 ook caspase-337,38 splijten. Bovendien kan de canoniek apoptotische caspase-3 gasdermin E (GSDME) splitsen om PCD17,18 te induceren en verwerkt ook GSDMD in een inactieve vorm40. Verder is caspase-8 rekrutering voor het inflammasoomcomplex waargenomen 39,40,41,42,43,44,45, en caspase-8 is een belangrijke regulator van canonieke en niet-canonieke inflammasoomactivatie 39. Er zijn ook overlappende en redundante rollen voor caspase-8 en caspase-1 in veel ontstekingsaandoeningen, en aangeboren immuun-PCD gekenmerkt door de activering van pyroptotische, apoptotische en necroptotische componenten komt voor in het ziektespectrum 39,46,47,48,49,50.
Op basis van deze overspraak tussen inflammatoire en apoptotische caspasen werd een belangrijke kloof in het mechanistische begrip van aangeboren immuniteit en PCD geïdentificeerd, wat leidde tot de ontdekking van PANoptose. PANoptose is een unieke vorm van III-PCD die wordt geactiveerd als reactie op pathogenen, PAMP's, DAMP's en veranderingen in homeostase en wordt gereguleerd door PANoptosomen - veelzijdige macromoleculaire complexen die componenten van andere celdoodroutes integreren 44,50,51,52,53,54,55 . De totaliteit van de biologische effecten in PANoptose kan niet individueel worden verklaard door pyroptose, apoptose of necroptose alleen 3,4,35,36,39,46,47,48, aangezien PANoptose wordt gekenmerkt door de activering van meerdere caspasen, waaronder caspase-1, caspase-11, caspase-8, caspase-9, caspase-3 en/of caspase-7, afhankelijk van de context 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptose is in toenemende mate betrokken bij infectie- en ontstekingsziekten, evenals bij kankers en kankertherapieën 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56 ,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.
Gezien de essentiële rol van caspasen in celdoodroutes, waaronder apoptose, pyroptose, necroptose en PANoptose, is het belangrijk om technieken te ontwikkelen om hun activering te karakteriseren en de volledige complexiteit van de PCD-routes te begrijpen. Het protocol beschrijft hier een methode om cellen te stimuleren en de daaropvolgende activering van caspasen te meten (figuur 1). Deze methode maakt gebruik van de proteolytische splitsing van caspasen, die over het algemeen nodig is voor hun activering, als een middel om ze te bestuderen. Door middel van western blotting kunnen de eiwitgroottes worden bepaald, waardoor de inactieve pro-caspasen en hun geactiveerde, gesplitste vormen duidelijk kunnen worden gevisualiseerd en gedifferentieerd.
De belangrijkste voordelen van dit protocol zijn 1) het vermogen om de activering van meerdere caspasen parallel van een enkele populatie van endogene cellen te beoordelen om pcd-activering nauwkeuriger te bepalen en 2) het gebruik van relatief eenvoudige laboratoriumtechnieken die geen uitgebreide training of dure apparatuur vereisen. Eerdere protocollen hebben westerse blotting, fluorescerende reporters of antilichaamkleuring gebruikt om caspase-activering in kweeksupernatanten, cel- en weefsellysaten, hele cellen via microscopie en in vivo 67,68,69,70,71 te controleren, maar deze technieken controleren over het algemeen slechts één of twee caspasen in een monster. Bovendien, terwijl synthetische peptidesubstraten die caspasesplitsingsplaatsen bevatten die fluoresceren bij splitsing zijn gebruikt om caspase-activering in cel- of weefsellysaten te controleren69, kunnen deze substraten vaak door meer dan één caspase worden gesplitst, waardoor het moeilijk is om de specifieke activering van individuele caspasen in dit systeem te bepalen. Bovendien stelt het gebruik van western blotting in plaats van het gebruik van fluorescerende reporters of andere op tags gebaseerde methoden onderzoekers in staat om endogene cellen te gebruiken in plaats van specifieke cellijnen te maken met reportergenen. Er zijn meerdere voordelen aan het gebruik van endogene cellen, waaronder het feit dat veel vereeuwigde cellijnen een tekort hebben aan belangrijke celdoodmoleculen72,73, wat de resultaten zou kunnen beïnvloeden. Bovendien maakt het gebruik van endogene cellen de evaluatie van verschillende celtypen mogelijk, zoals macrofagen, epitheelcellen en endotheelcellen, in plaats van een enkele afstamming. Western blotting is ook een relatief eenvoudige en kosteneffectieve techniek die kan worden uitgevoerd in laboratoria over de hele wereld zonder de noodzaak van grote, dure apparatuur of gecompliceerde opstellingen.
Dit protocol is breed toepasbaar in de biologie om zowel de celdoodafhankelijke als celdoodonafhankelijke functies van caspasen te begrijpen, inclusief hun steigerrollen en functies in andere ontstekingssignaleringsroutes74. Het toepassen van deze methode maakt een uniforme aanpak mogelijk in de studie van aangeboren immuun-PCD-routes en ontstekingssignalering tussen ziekten en aandoeningen, en dit protocol kan worden gebruikt om kritieke regulerende processen en mechanistische verbindingen te identificeren die de ontwikkeling van toekomstige therapeutische strategieën zullen informeren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCHVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12% polyacrylamide gel with 10 wells&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needle&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm tissue culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>182-cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accessory white trans tray</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0834-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-1 antibody</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-20B-0042-C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-11 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB120-10454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-3 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-7 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-8 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-9 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;cleaved caspase-3 antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;cleaved caspase-7 antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;cleaved caspase-8 antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>315-035-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-035-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>112-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;&#946;-Actin antibody (C4) HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-47778 HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-atpl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Trypticase Soy Broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead bath</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-4598-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer D30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6133000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BME</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BO126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>CellTreat Scientific Products</td>
			<td>229315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence imager (Amersham 600)&#160;</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29083461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2&#160;chamber</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>221S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eelectrophoresis apparatus&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Francisella novicida (U112 strain)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel releaser&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-043-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herpes simplex virus 1 (HF strain)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti&#8211;caspase-1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB6215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti&#8211;caspase-8 antibody</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ALX-804-242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>v1.53a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])&#160;</td>
			<td>constructed per Hoffmann et al.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-1</td>
			<td>cell line for creating L929-conditioned media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP376-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminata Forte Western HRP substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUF0500</td>
			<td>standard-sensitivity HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDCK cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td>cell line for determining IAV viral titer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dried milk powder</td>
			<td>Kroger</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>PHOSS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power source&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking shaker</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S2035-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripping buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal Femto HRP substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34580</td>
			<td>high-sensitivity HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot semi-dry system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-3pelps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td>cell line for determining HSV1 viral titer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of caspase activation to assess innate immune cell death

Aangeboren immuniteit biedt de kritieke eerste verdedigingslinie als reactie op ziekteverwekkers en steriele beledigingen. Een belangrijke mechanistische component van deze respons is de initiatie van aangeboren immuungeprogrammeerde celdood (PCD) om geïnfecteerde of beschadigde cellen te elimineren en immuunresponsen te verspreiden. Overtollig PCD wordt echter geassocieerd met ontsteking en pathologie. Daarom is het begrijpen van de activering en regulatie van PCD een centraal aspect van het karakteriseren van aangeboren immuunresponsen en het identificeren van nieuwe therapeutische doelen in het hele ziektespectrum.
Dit protocol biedt methoden voor het karakteriseren van aangeboren immuun-PCD-activering door caspasen te monitoren, een familie van cysteïne-afhankelijke proteasen die vaak worden geassocieerd met verschillende PCD-routes, waaronder apoptose, pyroptose, necroptose en PANoptose. Eerste rapporten karakteriseerden caspase-2, caspase-8, caspase-9 en caspase-10 als initiator caspases en caspase-3, caspase-6 en caspase-7 als effector caspases in apoptose, terwijl latere studies vonden dat de inflammatoire caspasen, caspase-1, caspase-4, caspase-5 en caspase-11, pyroptose veroorzaken. Het is nu bekend dat er uitgebreide overspraak is tussen de caspasen en andere aangeboren immuun- en celdoodmoleculen over de eerder gedefinieerde PCD-routes, waardoor een belangrijke kenniskloof wordt geïdentificeerd in het mechanistische begrip van aangeboren immuniteit en PCD en leidt tot de karakterisering van PANoptose. PANoptose is een unieke aangeboren immuuninflammatoire PCD-route gereguleerd door PANoptosoomcomplexen, die componenten, waaronder caspasen, van andere celdoodroutes integreren.
Hier worden methoden gegeven voor het beoordelen van de activering van caspasen als reactie op verschillende stimuli. Deze methoden maken de karakterisering van PCD-routes mogelijk, zowel in vitro als in vivo, omdat geactiveerde caspasen proteolytische splitsing ondergaan die kan worden gevisualiseerd door western blotting met behulp van optimale antilichamen en blottingcondities. Er zijn een protocol en western blotting workflow opgesteld die de beoordeling van de activering van meerdere caspasen uit dezelfde cellulaire populatie mogelijk maken, waardoor een uitgebreide karakterisering van de PCD-processen wordt geboden. Deze methode kan worden toegepast op onderzoeksgebieden in ontwikkeling, homeostase, infectie, ontsteking en kanker om PCD-routes te evalueren tijdens cellulaire processen in gezondheid en ziekte.

PANoptosis is waargenomen als reactie op talrijke bacteriële, virale en schimmelinfecties en andere ontstekingsstimuli, evenals in kankercellen 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 ...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death at JoVE.com

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Dit protocol beschrijft een uitgebreide methode voor het beoordelen van caspase-activering (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 en caspase-11) in reactie op zowel in vitro als in vivo (bij muizen) modellen van infectie, steriele beledigingen en kanker om de initiatie van celdoodroutes te bepalen, zoals pyroptose, apoptose, necroptose en PANoptose.

Evaluatie van Caspase-activering om aangeboren immuunceldood te beoordelen

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Dit protocol biedt een veelzijdig begrip van de activering van celdoodprocessen, wat kritische inzichten kan bieden in ziektemechanismen en therapeutische strategieën kan informeren. Dit protocol is gebaseerd op het gebruik van een eenvoudigere techniek en om toegang te krijgen tot de activering van meerdere caspasen die noodzakelijk zijn vanuit een enkele populatie van endogene cellen om de activering sterk te bepalen. Aangeboren immuunceldood is betrokken bij het hele ziektespectrum, van infecties tot ontstekingsziekten tot kankers.Het begrijpen van de moleculaire mechanismen van celdood door caspase-activering kan kritische inzichten bieden in ziekteprocessen. Dr. Julieann, een postdoctoraal onderzoeksmedewerker van een laboratorium, zal de procedure demonstreren. Na het isoleren van het beenmerg en het differentiëren van de BMDM's, infecteert u de cellen met het influenza A-virus.Bereken het virusvolume dat nodig is bij een infectiemultipliciteit van 20 plaquevormende eenheden. Verwijder de media uit de BMDM's en was de cellen eenmaal met 500 microliter PBS. Voeg 450 microliter Influenza A-virus in DMEM met hoge glucose zonder warmte-geïnactiveerde FBS toe aan elke put en incuber de platen bij 37 graden Celsius gedurende een uur in een bevochtigde incubator om absorptie mogelijk te maken.Voeg aan het einde van de incubatie van een uur 50 microliter warmte-geïnactiveerde FBS toe en breng de platen terug naar de incubator bij 37 graden Celsius voor een totaal van 12 uur. Verwijder na 12 uur incubatie de plaat uit de couveuse. Zuig 150 microliter van het supernatant op en gooi dit weg of bewaar dit voor supernatantanalyse.Verwijder het resterende supernatant niet. Maak nu de eiwitverzamelingsoplossing door 50 microliter caspaslysisbuffer en 100 microliter van vier XSDS-buffer per put te combineren. Voeg vervolgens 150 microliter van het mengsel toe aan elke put.Pipetteer voor elk putje het mengsel om de gelyseerde cellen en het supernatant te verzamelen. Schraap tijdens het pipetteren de bodem van de put met de pipetpunt om de cellen te verstoren. Na het schrapen en pipetteren, verzamel het eiwitlysaat in gelabelde buisjes van 1,5 milliliter.Verwarm met behulp van een warmteblok alle buizen gedurende 12 minuten tot 100 graden Celsius. Verwijder de buizen uit het warmteblok en centrifugeer gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur op 14.500 G om eventuele onoplosbare componenten te pelleteren. Bereid het elektroforese-apparaat voor met een 12% polyacrylamidegel met 10 putjes.Vul het elektroforese-apparaat met loopbuffer en verwijder de gelkam. Verwarm de monsters vervolgens gedurende vijf minuten op 100 graden Celsius. Centrifugeer de monsters gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur bij 14.500 g voordat u ze laadt.Laad vervolgens langzaam 30 microliter van het monster in elke put. Gebruik een gecombineerde supernatant- en eiwitlysaat- en caspaselysisbuffer of het weefselhomogenaat voor caspase 1, 3, 7 en 8 blots, en gebruik de eiwitlysaat DN RIPA-buffer beschreven in het protocol of het weefselhomogenaat voor caspase 11 en 9. Om alle zes caspasen tegelijk te evalueren, gebruikt u dezelfde procedure om dezelfde monsters in elk van de zes gels te laden.Sluit het elektroforese-apparaat aan op de stroombron en stel het vermogen gedurende 20 minuten in op 80 volt om de gelrun te starten. Stel na de eerste 20 minuten het vermogen gedurende 45 tot 60 minuten in op 100 volt. Let op de voorkant van de kleurstof.Zodra de kleurstofvoorkant de onderkant van de gel bereikt, schakelt u de stroom uit. Terwijl de gel loopt, bereidt u de overdrachtsbuffer voor zoals beschreven in het manuscript. Maak de oplossing elke keer vers.Verwijder de gel uit het elektroforese-apparaat met behulp van de gel-releaser. Om de transfer stack voor de gel in te stellen, activeert u een PVDF-membraan door het gedurende één minuut in methanol te weken. Maak twee stukken filtreerpapier, de gel en het PVDF-membraan vooraf nat en breng de buffer gedurende vijf minuten voor.Bewaar het PVDF-membraan en de gel in afzonderlijke containers tijdens deze incubatie van vijf minuten. Begin met het monteren van de transferstack op het semi-droge systeem. Plaats aan de onderkant van de platina nano-kant een stuk filterpapier, het PVDF-membraan, de gel en ten slotte een stuk filterpapier.Rol voorzichtig luchtbellen uit of druk ze uit tussen de lagen en sluit de bovenkant van het systeem. Sluit nu aan op de voedingsbron. Stel het vermogen gedurende 40 minuten in op 25 volt.Na de overdracht demonteer je de transferstapel, verzamel je het membraan en plaats je het in een vierkante petrischaal. Voer vervolgens membraanblokkering uit door 15 milliliter van een 5% magere melkoplossing toe te voegen en het membraan gedurende een uur op een schommelende shaker bij 50 tot 70 RPM bij kamertemperatuur te incuberen. Verwijder na incubatie de blokkerende oplossing, voeg 10 milliliter van de verdunde antilichaamoplossing toe en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur of vier graden Celsius 's nachts op een schommelende shaker, zoals eerder aangetoond.Verzamel vervolgens de antilichaamoplossing en was het membraan door 15 milliliter TBST aan het membraan toe te voegen op een schommelende shaker bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Gooi de TBST weg. Herhaal de was met 15 milliliter TBST drie keer.Voeg 10 milliliter van de verdunde secundaire HRP-geconjugeerde antilichaamoplossing toe. Incubeer op een schommelende shaker bij kamertemperatuur gedurende een uur. Aan het einde van de incubatie, zodra de antilichaamoplossing is verwijderd, wast u het membraan door 15 milliliter TBST toe te voegen aan een schommelende shaker bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.Voeg na het voltooien van de wasstappen en het verwijderen van de TBST 10 milliliter van het zeer gevoelige HRP-substraat toe. Laat het een minuut op kamertemperatuur staan. Verwijder het membraan van het substraat.Ga direct naar de beeldvorming met behulp van een chemiluminescentie-imager met de witte translade van het accessoire in de onderste positie. Belicht het membraan met behulp van de automatische belichtingsmodus. De pro en geactiveerde caspase 1, 11, 3, 7, 8 en 9 in wild type en ZBP1 mutant na Influenza A virus infectie, wild type en AIM2 mutant na HSV1 infectie, en Francisella novicida infectie, of wild type en NLRP3 mutant BDM's na lipopolysaccharide en ATP stimulatie worden geanalyseerd.Cellen zonder upstream PANoptosis-sensoren ondergaan geen robuuste celdood als reactie op de verwante PANoptose-inducerende stimuli. Influenza A-virusinfectie induceert de vorming van het ZBP1-PANoptosoom en de ZBP1-deficiënte cellen worden aanzienlijk beschermd tegen celdood tijdens influenza A-virusinfectie. Evenzo induceren HSV1- en Francisella novitida-infecties de vorming van het AIM2 PANoptosoom en AIM2-deficiënte cellen ondergaan geen robuuste celdood als reactie op deze infecties.Cellen zonder upstream inflammasoomsensoren worden beschermd tegen celdood als reactie op hun respectievelijke stimuli, en NLRP3-deficiënte cellen ondergaan geen celdood als reactie op lipopolysaccharide en ATP. Het is belangrijk om te onthouden om een mengsel van beide cellysates te bereiden om een specifieke caspase te bepalen. Na het laden van de jet moet het lichtgevende monster minus 20 graden worden opgeslagen om de integriteit van de doelen van caspase voor follow-up te behouden In combinatie met dit protocol kunnen real-time celdoodbeeldvorming of LDH-assays worden gebruikt om de uitvoering van celdood te volgen, en ELIZA's kunnen worden gebruikt om te controleren op de afgifte van cytokines of DAMPs uit cellen die verschillende soorten celdood ondergaan.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Zeven Stappen naar cellen stellatum

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Methoden om Beta Cell Death gemedieerd beoordelen door cytotoxische T lymfocyten

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Kwantificering van de Respiratory Burst Response als een indicator van het aangeboren immuunsysteem Gezondheid in zebravis

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Ontleden Innate Immune Signalering in Viral Evasion van cytokine productie

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Met behulp van RNA-interferentie te onderzoeken de aangeboren immuunrespons in muizenmacrofagen

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Niet-invasieve beeldvorming van de aangeboren immuunrespons in een zebravis larven Model van<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infectie

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Verzadigde vetzuren induceren Ceramide-geassocieerde Macrophage celdood

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling TUNEL and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

Met behulp van Terminal Transferase-gemedieerde dUTP testen Nick einde-etikettering (TUNEL) en Caspase-3/7 aan maatregel epidermale celdood in kikkers met Chytridiomycosis

Amphibians are experiencing a great loss in biodiversity globally and one of the major causes is the infectious disease chytridiomycosis. This disease is ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Detectie van Inflammasome-activering en Pyroptotic celdood in lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

Immunostimulerende Agent evaluatie: Lymfoïde weefsel extractie en injectie Route-afhankelijke dendritische cel activeren

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...