Name: evaluation of caspase activation to assess innate immune cell death
Uploaded: 2023-01-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death at JoVE.com

Wir danken den Mitgliedern des Kanneganti-Labors für ihre Kommentare und Vorschläge, und wir danken J. Gullett, PhD, für die Unterstützung bei der wissenschaftlichen Redaktion. Die Arbeit in unserem Labor wird durch die Zuschüsse AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 und CA253095 (an T.-D.K.) der National Institutes of Health (NIH) sowie durch die American Libanese Syrian Associated Charities (an T.-D.K.) unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und spiegelt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health wider.

Die Verwendung und die Verfahren der Tiere wurden vom St. Jude Children's Research Hospital Committee on the Use and Care of Animals genehmigt.
1. Vorbereitung der Lösungen
<ol><li>Bereiten Sie L929-konditionierte Medien vor.<ol><li>Platte 1 × 106 L929-Zellen (siehe Materialtabelle) in einem 182cm2 Gewebekulturkolben mit 50 ml L929-Nährmedien (siehe Tabelle 1 zur Herstellung des Mediums).</li>
		<li>Züchten Sie die ...

Die Überwachung der Caspase-Spaltung und -Aktivierung liefert eines der umfassendsten Bilder der PCD-Aktivierung des angeborenen Immunsystems als Teil der angeborenen Immunantwort. Das hier beschriebene Protokoll demonstriert eine Strategie zur Überwachung der Caspase-Aktivierung als Reaktion auf IAV-, HSV1- und F. novicida-Infektionen und den sterilen Auslöser LPS + ATP, aber zahlreiche andere Stimuli können PCD induzieren und könnten in dieser Methode verwendet werden, wie in mehreren Veröffentlichungen ...

Das angeborene Immunsystem fungiert als erste Verteidigungslinie während einer Infektion und als Reaktion auf sterile Reize wie Gewebeverletzungen und Veränderungen der Homöostase. Angeborene Immunsensoren auf der Zelloberfläche und im Zytoplasma reagieren auf pathogen- oder schädigungsassoziierte molekulare Muster (PAMPs bzw. DAMPs), um entzündliche Signalwege und zelluläre Reaktionen auszulösen. Einer der Schlüsselprozesse der angeborenen Immunantwort ist die Induktion des Zelltods, um infizierte oder beschädigte Zellen zu entfernen und weitere angeborene und adaptive Immunantworten voranzutreiben. Der programmierte Zelltod (PCD) ist ein hochkonservierter Prozess über Spezies hinweg, was seine evolutionäre Bedeutung als angeborener Immunmechanismus unterstreicht.
Es gibt mehrere angeborene Immun-PCD-Signalwege, die in allen Zelltypen aktiviert werden können. Caspasen sind eine Schlüsselfamilie hochkonservierter, intrazellulärer, Cystein-abhängiger Proteasen, die für viele PCD-Signalwege, einschließlich des traditionell nicht-inflammatorischen Apoptosewegs sowie entzündlicher PCD-Signalwege wie Pyroptose, Nekroptose und PANoptosekritisch sind 1,2,3,4,5 . Es gibt 11 humane und 10 murine Caspasen, die gut definiert sind, sowie Pseudo-Caspasen, die funktionell sein können, und die meisten werden konstitutiv als inaktive monomere oder dimere Pro-Caspasen exprimiert, die eine Spaltung zur Aktivierung erfordern 6,7. Caspasen enthalten auch wichtige Domänen für die Rekrutierung und Bildung von Multiproteinkomplexen. Dazu gehören die Caspase-Aktivierungs- und Rekrutierungsdomäne (CARD), die in Caspase-1, Caspase-2, Caspase-4, Caspase-5, Caspase-9 und Caspase-11 zu finden ist, oder die Todeseffektordomäne (DED), die in Caspase-8 und Caspase-10 zu finden ist. Sowohl durch ihre proteolytische Aktivität als auch durch ihre Fähigkeit, Multiproteinkomplexe zu bilden, sind Caspasen entscheidende Treiber der angeborenen Immun-PCD.
Die Rolle von Caspasen bei der angeborenen Immun-PCD wurde erstmals in der Apoptose identifiziert, wo die Initiator-Caspasen Caspase-2, Caspase-8, Caspase-9 und Caspase-10 die Henker-Caspasen Caspase-3, Caspase-6 und Caspase-7 aktivieren, um den Zelltodzu beschleunigen 8,9,10,11,12. Initiator-Caspasen können durch verschiedene Signalkaskaden aktiviert werden; Der extrinsische Signalweg aktiviert Caspase-8 durch extrazelluläre Liganden-induzierte Todesrezeptor-Signalgebung, und der intrinsische Signalweg aktiviert Caspase-9 durch die Störung der mitochondrialen Integrität13. Aktivierte Initiator-Caspasen spalten den Linker und trennen die großen und kleinen katalytischen Untereinheiten von Henker-Caspasen, um ihre aktiven Formen zu erzeugen. Die Henker-Caspasen spalten dann ihre Substrate, um die Zelle zu zerlegen, was zu DNA-Abbau, Membranblasen, Kernfragmentierung und der Freisetzung apoptotischer Körper führt14,15. Dieser Prozess endet typischerweise in einer nicht-lytischen und nicht-entzündlichen Form des Zelltods, wenn er mit der sofortigen Beseitigung der sterbenden Zellen durch Efferozytosegekoppelt ist 16. Defekte in der Efferozytose oder ein Mangel an phagozytischen Zellen können jedoch zur Anhäufung von apoptotischen Zellen führen, die dann einen lytischen und entzündlichen Zelltod durchlaufen17,18.
Es wurde entdeckt, dass die entzündlichen Caspasen, einschließlich Caspase-1 (Mensch und Maus), Caspase-4 und Caspase-5 (Mensch) und Caspase-11 (Maus), während einer Form der entzündlichen angeborenen Immun-PCD (III-PCD) aktiviert werden, die als Pyroptose bezeichnet wird. Die Caspase-1-Aktivierung ist mit der Bildung von Inflammasomen verbunden, bei denen es sich um Multiproteinkomplexe handelt, die einen zytosolischen angeborenen Immunsensor, ein Adaptermolekül (Apoptose-assoziiertes speckartiges Protein, das eine CARD [ASC] enthält) und Caspase-1 enthalten. Die Bildung dieses Komplexes ermöglicht es Caspase-1, eine Proximity-vermittelte Autoproteolyse zu durchlaufen, um seine aktive Form freizusetzen, die Zielsubstrate spalten kann, einschließlich der proinflammatorischen Zytokine Interleukin (IL)-1β und IL-18 und des porenbildenden Moleküls Gasdermin D (GSDMD)19,20,21,22,23 . Caspase-11, Caspase-4 und Caspase-5 können GSDMD auch aktivieren, ohne dass das Inflammasom stromaufwärts gebildet wird, nachdem PAMPs wie Lipopolysaccharid (LPS) erkannt wurden19,20. Diese Caspasen durchlaufen eine Dimerisierung, gefolgt von einer Oligomerisierung und Selbstspaltung zur Aktivierung bei Bindung an zytosolisches LPS, was zu einer nicht-kanonischen Inflammasom-Aktivierung 24,25,26 und einer Caspase-1-Aktivierung in zellintrinsischer Weise führt, um die IL-1β- und IL-18-Reifung zu induzieren 20. Die Reifung und Freisetzung dieser entzündungsfördernden Zytokine charakterisieren diese Caspasen als "entzündlich". Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die apoptotische Caspase-8 auf dem Inflammasom lokalisiert ist, was eine Verbindung zwischen apoptotischen und pyroptotischen Prozessen herstellt. Studien haben gezeigt, dass die apoptotische Caspase-8 auch für die Regulierung einer anderen Form der PCD, der Nekroptose, entscheidend ist. Der Verlust von Caspase-8 führt zu einer spontanen Rezeptor-interagierenden Serin-Threonin-Kinase 3 (RIPK3)-vermittelten Mixed-Lineage-Kinase-Domänen-ähnlichen Pseudokinase (MLKL)-Aktivierung, um den III-PCD-Weg der Nekroptose 27,28,29,30,31,32,33,34,35 anzutreiben.
Während Caspasen in der Vergangenheit aufgrund der Art des Zelltods, den sie auslösen, als "apoptotisch" oder "entzündlich" eingestuft wurden, deuten immer mehr Hinweise darauf hin, dass es durch Caspasen ein umfangreiches Übersprechen zwischen den angeborenen immunen PCD-Signalwegen gibt 3,4. Zum Beispiel spaltet die inflammatorische Caspase-1 aus Inflammasomen die apoptotische Caspase-7 an ihrer kanonischen Aktivierungsstelle34. Die Caspase-1-Aktivierung kann auch zur Spaltung von apoptotischen Substraten wie der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase 1 (PARP1)36 führen. In Zellen, denen GSDMD fehlt, kann Caspase-1 auch Caspase-3 spalten37,38. Zusätzlich kann die kanonisch apoptotische Caspase-3 Gasdermin E (GSDME) spalten, um PCD17,18 zu induzieren, und verarbeitet auch GSDMD in eine inaktive Form40. Darüber hinaus wurde eine Caspase-8-Rekrutierung für den Inflammasom-Komplex beobachtet 39,40,41,42,43,44,45, und Caspase-8 ist ein Schlüsselregulator der kanonischen und nicht-kanonischen Inflammasom-Aktivierung 39. Es gibt auch überlappende und redundante Rollen für Caspase-8 und Caspase-1 bei vielen entzündlichen Erkrankungen, und die angeborene Immun-PCD, die durch die Aktivierung von pyroptotischen, apoptotischen und nekrototischen Komponenten gekennzeichnet ist, tritt im gesamten Krankheitsspektrumauf 39,46,47,48,49,50.
Basierend auf dieser Wechselwirkung zwischen entzündlichen und apoptotischen Caspasen wurde eine Schlüssellücke im mechanistischen Verständnis der angeborenen Immunität und der PCD identifiziert, die zur Entdeckung der PANoptose führte. PANoptose ist eine einzigartige Form der III-PCD, die als Reaktion auf Krankheitserreger, PAMPs, DAMPs und Veränderungen der Homöostase aktiviert wird und durch PANoptosomen reguliert wird - facettenreiche makromolekulare Komplexe, die Komponenten aus anderen Zelltodwegen integrieren 44,50,51,52,53,54,55 . Die Gesamtheit der biologischen Wirkungen bei der PANoptose kann nicht allein durch Pyroptose, Apoptose oder Nekroptose allein erklärt werden 3,4,35,36,39,46,47,48, da die PANoptose durch die Aktivierung mehrerer Caspasen gekennzeichnet ist, einschließlich Caspase-1, Caspase-11, Caspase-8, Caspase-9, Caspase-3 und/oder Caspase-7, je nach Kontext 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptose wird zunehmend mit Infektions- und Entzündungskrankheiten sowie mit Krebs und Krebstherapien in Verbindung gebracht 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56 ,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.
Angesichts der essentiellen Rolle von Caspasen in Zelltodwegen, einschließlich Apoptose, Pyroptose, Nekroptose und PANoptose, ist es wichtig, Techniken zu entwickeln, um ihre Aktivierung zu charakterisieren und die volle Komplexität der PCD-Signalwege zu verstehen. Das Protokoll beschreibt hier eine Methode zur Stimulation von Zellen und zur Messung der anschließenden Aktivierung von Caspasen (Abbildung 1). Diese Methode nutzt die proteolytische Spaltung von Caspasen, die im Allgemeinen für ihre Aktivierung erforderlich ist, um sie zu untersuchen. Durch Western Blot können die Proteingrößen bestimmt werden, was eine klare Visualisierung und Differenzierung von inaktiven Pro-Caspasen und ihren aktivierten, gespaltenen Formen ermöglicht.
Die Hauptvorteile dieses Protokolls sind 1) seine Fähigkeit, die Aktivierung mehrerer Caspasen parallel aus einer einzigen Population endogener Zellen zu beurteilen, um die PCD-Aktivierung genauer zu bestimmen, und 2) die Verwendung relativ einfacher Labortechniken, die keine umfangreiche Schulung oder teure Ausrüstung erfordern. Frühere Protokolle haben Western Blotting, Fluoreszenzreporter oder Antikörperfärbung verwendet, um die Caspase-Aktivierung in Kulturüberständen, Zell- und Gewebelysaten, ganzen Zellen durch Mikroskopie und in vivo 67,68,69,70,71 zu überwachen, aber diese Techniken überwachen im Allgemeinen nur ein oder zwei Caspasen in einer Probe. Während synthetische Peptidsubstrate, die Caspase-Spaltstellen enthalten, die bei der Spaltung fluoreszieren, zur Überwachung der Caspase-Aktivierung in Zell- oder Gewebelysaten69 verwendet wurden, können diese Substrate oft von mehr als einer Caspase gespalten werden, was es schwierig macht, die spezifische Aktivierung einzelner Caspasen in diesem System zu bestimmen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Western Blot anstelle der Verwendung von fluoreszierenden Reportern oder anderen Tag-basierten Methoden den Forschern, endogene Zellen zu verwenden, anstatt spezifische Zelllinien mit Reportergenen zu erzeugen. Die Verwendung endogener Zellen hat mehrere Vorteile, einschließlich der Tatsache, dass viele immortalisierte Zelllinien einen Mangel an Schlüsselmolekülen für den Zelltodaufweisen 72,73, was die Ergebnisse beeinflussen könnte. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung endogener Zellen die Bewertung verschiedener Zelltypen wie Makrophagen, Epithelzellen und Endothelzellen anstelle einer einzelnen Linie. Western Blot ist auch eine relativ einfache und kostengünstige Technik, die in Labors auf der ganzen Welt durchgeführt werden kann, ohne dass große, teure Geräte oder komplizierte Setups erforderlich sind.
Dieses Protokoll ist in der gesamten Biologie weit verbreitet, um sowohl die zelltodabhängigen als auch die zelltodunabhängigen Funktionen von Caspasen zu verstehen, einschließlich ihrer Gerüstrollen und Funktionen in anderen entzündlichen Signalwegen74. Die Anwendung dieser Methode ermöglicht einen einheitlichen Ansatz bei der Untersuchung von PCD-Signalwegen des angeborenen Immunsystems und der Entzündungssignalisierung über Krankheiten und Zustände hinweg, und dieses Protokoll kann verwendet werden, um kritische regulatorische Prozesse und mechanistische Verbindungen zu identifizieren, die die Entwicklung zukünftiger therapeutischer Strategien beeinflussen werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCHVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12% polyacrylamide gel with 10 wells&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needle&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm tissue culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>182-cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accessory white trans tray</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0834-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-1 antibody</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-20B-0042-C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-11 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB120-10454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-3 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-7 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-8 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-9 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;cleaved caspase-3 antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;cleaved caspase-7 antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;cleaved caspase-8 antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>315-035-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-035-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>112-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;&#946;-Actin antibody (C4) HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-47778 HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-atpl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Trypticase Soy Broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead bath</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-4598-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer D30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6133000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BME</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BO126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>CellTreat Scientific Products</td>
			<td>229315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence imager (Amersham 600)&#160;</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29083461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2&#160;chamber</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>221S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eelectrophoresis apparatus&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Francisella novicida (U112 strain)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel releaser&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-043-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herpes simplex virus 1 (HF strain)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti&#8211;caspase-1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB6215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti&#8211;caspase-8 antibody</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ALX-804-242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>v1.53a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])&#160;</td>
			<td>constructed per Hoffmann et al.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-1</td>
			<td>cell line for creating L929-conditioned media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP376-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminata Forte Western HRP substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUF0500</td>
			<td>standard-sensitivity HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDCK cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td>cell line for determining IAV viral titer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dried milk powder</td>
			<td>Kroger</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>PHOSS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power source&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking shaker</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S2035-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripping buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal Femto HRP substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34580</td>
			<td>high-sensitivity HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot semi-dry system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-3pelps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td>cell line for determining HSV1 viral titer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of caspase activation to assess innate immune cell death

Die angeborene Immunität stellt die entscheidende erste Verteidigungslinie als Reaktion auf Krankheitserreger und sterile Beleidigungen dar. Eine wichtige mechanistische Komponente dieser Reaktion ist die Einleitung des angeborenen immunprogrammierten Zelltods (PCD), um infizierte oder beschädigte Zellen zu eliminieren und Immunantworten zu verbreiten. Eine übermäßige PCD ist jedoch mit Entzündungen und Pathologien verbunden. Daher ist das Verständnis der Aktivierung und Regulation von PCD ein zentraler Aspekt bei der Charakterisierung der angeborenen Immunantwort und der Identifizierung neuer therapeutischer Ziele im gesamten Krankheitsspektrum.
Dieses Protokoll bietet Methoden zur Charakterisierung der PCD-Aktivierung des angeborenen Immunsystems durch Überwachung von Caspasen, einer Familie von Cystein-abhängigen Proteasen, die häufig mit verschiedenen PCD-Signalwegen assoziiert sind, einschließlich Apoptose, Pyroptose, Nekroptose und PANoptose. Erste Berichte charakterisierten Caspase-2, Caspase-8, Caspase-9 und Caspase-10 als Initiator-Caspasen und Caspase-3, Caspase-6 und Caspase-7 als Effektor-Caspasen bei Apoptose, während spätere Studien die entzündlichen Caspasen Caspase-1, Caspase-4, Caspase-5 und Caspase-11 fanden, die Pyroptose auslösen. Es ist nun bekannt, dass es eine umfangreiche Wechselwirkung zwischen den Caspasen und anderen angeborenen Immun- und Zelltodmolekülen über die zuvor definierten PCD-Signalwege gibt, was eine wichtige Wissenslücke im mechanistischen Verständnis der angeborenen Immunität und der PCD identifiziert und zur Charakterisierung der PANoptose führt. PANoptose ist ein einzigartiger angeborener immuninflammatorischer PCD-Signalweg, der durch PANoptosom-Komplexe reguliert wird, die Komponenten, einschließlich Caspasen, aus anderen Zelltodwegen integrieren.
Hier werden Methoden zur Beurteilung der Aktivierung von Caspasen als Reaktion auf verschiedene Reize bereitgestellt. Diese Methoden ermöglichen die Charakterisierung von PCD-Signalwegen sowohl in vitro als auch in vivo, da aktivierte Caspasen eine proteolytische Spaltung durchlaufen, die durch Western Blot unter Verwendung optimaler Antikörper und Blotting-Bedingungen sichtbar gemacht werden kann. Es wurden ein Protokoll und ein Western-Blotting-Workflow etabliert, die es ermöglichen, die Aktivierung mehrerer Caspasen aus derselben Zellpopulation zu bewerten und eine umfassende Charakterisierung der PCD-Prozesse zu ermöglichen. Diese Methode kann in allen Forschungsbereichen in den Bereichen Entwicklung, Homöostase, Infektion, Entzündung und Krebs angewendet werden, um PCD-Signalwege in zellulären Prozessen in Gesundheit und Krankheit zu bewerten.

PANoptose wurde als Reaktion auf zahlreiche bakterielle, virale und Pilzinfektionen und andere entzündliche Reize sowie in Krebszellen beobachtet 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 </su...

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Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Dieses Protokoll beschreibt eine umfassende Methode zur Beurteilung der Caspase-Aktivierung (Caspase-1, Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9 und Caspase-11) als Reaktion auf In-vitro - und In-vivo-Modelle (in Mäusen) von Infektionen, sterilen Beleidigungen und Krebs, um die Initiierung von Zelltodwegen wie Pyroptose, Apoptose, Nekroptose und PANoptose zu bestimmen.

Evaluierung der Caspase-Aktivierung zur Beurteilung des angeborenen Immunzelltods

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Dieses Protokoll bietet ein facettenreiches Verständnis der Aktivierung von Zelltodprozessen, das entscheidende Einblicke in Krankheitsmechanismen und therapeutische Strategien liefern kann. Dieses Protokoll beruht auf der Verwendung einer einfacheren Technik und dem Zugriff auf die Aktivierung mehrerer Caspasen, die von einer einzigen Population endogener Zellen unerlässlich sind, um die Aktivierung stark zu bestimmen. Der angeborene Zelltod des Immunsystems wurde über das gesamte Krankheitsspektrum hinweg in Verbindung gebracht, von Infektionen über entzündliche Erkrankungen bis hin zu Krebs.Das Verständnis der molekularen Mechanismen des Zelltods durch Caspase-Aktivierung kann entscheidende Einblicke in Krankheitsprozesse liefern. Dr. Julieann, eine Postdoktorandin aus einem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Nachdem Sie das Knochenmark isoliert und die BMDMs differenziert haben, infizieren Sie die Zellen mit dem Influenza-A-Virus.Berechnen Sie das Virusvolumen, das bei einer Vielzahl von Infektionen von 20 plaquebildenden Einheiten benötigt wird. Entfernen Sie das Medium aus den BMDMs und waschen Sie die Zellen einmal mit 500 Mikrolitern PBS. Geben Sie 450 Mikroliter Influenza-A-Virus in DMEM mit hohem Glukosegehalt ohne hitzeinaktiviertes FBS in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator, um die Absorption zu ermöglichen.Fügen Sie am Ende der einstündigen Inkubation 50 Mikroliter hitzeinaktiviertes FBS hinzu und geben Sie die Platten für insgesamt 12 Stunden bei 37 Grad Celsius in den Inkubator zurück. Entfernen Sie die Platte nach 12 Stunden Inkubation aus dem Inkubator. Saugen Sie 150 Mikroliter des Überstands ab und verwerfen oder bewahren Sie diese für die Analyse des Überstands auf.Entfernen Sie nicht den restlichen Überstand. Erstellen Sie nun die Proteinsammellösung, indem Sie 50 Mikroliter Caspase-Lysepuffer und 100 Mikroliter vier XSDS-Puffer pro Well kombinieren. Geben Sie dann 150 Mikroliter der Mischung in jede Vertiefung.Für jede Vertiefung pipettieren Sie die Mischung, um die lysierten Zellen und den Überstand zu sammeln. Kratzen Sie während des Pipettierens mit der Pipettenspitze den Boden der Vertiefung ab, um die Zellen aufzubrechen. Nach dem Schaben und Pipettieren das Proteinlysat in markierten 1,5-Milliliter-Röhrchen sammeln.Erhitzen Sie alle Röhrchen mit einem Heizblock 12 Minuten lang auf 100 Grad Celsius. Entfernen Sie die Röhrchen aus dem Heizblock und zentrifugieren Sie sie 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur bei 14.500 G, um unlösliche Bestandteile zu pelletieren. Bereiten Sie das Elektrophoresegerät mit einem 12%igen Polyacrylamid-Gel mit 10 Vertiefungen vor.Füllen Sie das Elektrophoresegerät mit laufendem Puffer und entfernen Sie den Gelkamm. Dann erhitzen Sie die Proben fünf Minuten lang bei 100 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Proben vor dem Laden bei 14.500 G 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur.Laden Sie dann langsam 30 Mikroliter der Probe in jede Vertiefung. Verwenden Sie kombinierten Überstand und Proteinlysat und Caspase-Lysepuffer oder das Gewebehomogenat für Caspase 1, 3, 7 und 8 Blots und verwenden Sie den im Protokoll beschriebenen Proteinlysat-DN-RIPA-Puffer oder das Gewebehomogenat für Caspase 11 und 9. Um alle sechs Caspasen gleichzeitig zu bewerten, verwenden Sie das gleiche Verfahren, um die gleichen Proben in jedes der sechs Gele zu laden.Schließen Sie das Elektrophoresegerät an die Stromquelle an und stellen Sie die Leistung 20 Minuten lang auf 80 Volt ein, um den Gellauf zu starten. Stellen Sie nach den ersten 20 Minuten die Leistung für 45 bis 60 Minuten auf 100 Volt ein. Beobachten Sie die Farbstofffront.Sobald die Farbstofffront den Boden des Gels erreicht, schalten Sie das Gerät aus. Während das Gel läuft, bereiten Sie den Transferpuffer wie im Manuskript beschrieben vor. Machen Sie die Lösung jedes Mal frisch.Entfernen Sie das Gel mit dem Gel-Trennmittel aus dem Elektrophoresegerät. Um den Transferstapel für das Gel einzurichten, aktivieren Sie eine PVDF-Membran, indem Sie sie eine Minute lang in Methanol einweichen. Befeuchten Sie zwei Stücke Filterpapier, das Gel und die PVDF-Membran und den Transferpuffer fünf Minuten lang.Bewahren Sie die PVDF-Membran und das Gel während dieser fünfminütigen Inkubation in getrennten Behältern auf. Beginnen Sie mit der Montage des Transferstapels auf dem halbtrockenen System. Legen Sie auf die untere Platin-Nano-Seite ein Stück Filterpapier, die PVDF-Membran, das Gel und schließlich ein Stück Filterpapier.Luftblasen zwischen den Schichten vorsichtig ausrollen oder ausdrücken und die Oberseite des Systems schließen. Schließen Sie nun die Stromquelle an. Stellen Sie die Stromversorgung für 40 Minuten auf 25 Volt ein.Zerlegen Sie nach dem Transfer den Transferstapel, sammeln Sie die Membran und legen Sie sie in eine quadratische Petrischale. Als nächstes führen Sie eine Membranblockierung durch, indem Sie 15 Milliliter einer 5%igen Magermilchlösung hinzufügen und die Membran eine Stunde lang auf einem Schaukelschüttler bei 50 bis 70 U / min bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation die Blockierlösung, fügen Sie 10 Milliliter der verdünnten Antikörperlösung hinzu und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur oder vier Grad Celsius über Nacht auf einem Schaukelschüttler, wie zuvor gezeigt.Sammeln Sie dann die Antikörperlösung und waschen Sie die Membran, indem Sie der Membran 10 Minuten lang 15 Milliliter TBST auf einem Schaukelschüttler bei Raumtemperatur hinzufügen. Entsorgen Sie die TBST. Wiederholen Sie den Waschgang mit 15 Millilitern TBST dreimal.Fügen Sie 10 Milliliter der verdünnten sekundären HRP-konjugierten Antikörperlösung hinzu. Eine Stunde lang auf einem Schaukelschüttler bei Raumtemperatur inkubieren. Am Ende der Inkubation, sobald die Antikörperlösung entfernt ist, waschen Sie die Membran, indem Sie 15 Milliliter TBST auf einem Schaukelschüttler bei Raumtemperatur für 10 Minuten hinzufügen.Nachdem Sie die Waschschritte abgeschlossen und das TBST entfernt haben, fügen Sie 10 Milliliter des hochempfindlichen HRP-Substrats hinzu. Lassen Sie es eine Minute bei Raumtemperatur ruhen. Entfernen Sie die Membran vom Substrat.Fahren Sie direkt mit der Bildgebung fort, indem Sie einen Chemilumineszenz-Imager verwenden, wobei das weiße Zubehörfach in der unteren Position eingesetzt wird. Belichten Sie die Membran mit dem automatischen Belichtungsmodus. Analysiert werden die Pro- und aktivierten Caspase 1, 11, 3, 7, 8 und 9 in Wildtyp- und ZBP1-Mutanten nach Influenza-A-Virusinfektion, Wildtyp- und AIM2-Mutante nach HSV1-Infektion und Francisella novicida-Infektion oder Wildtyp- und NLRP3-Mutanten-BDMs nach Lipopolysaccharid- und ATP-Stimulation.Zellen, denen vorgeschaltete PANoptose-Sensoren fehlen, durchlaufen keinen robusten Zelltod als Reaktion auf die verwandten PANoptose-induzierenden Reize. Eine Influenza-A-Virusinfektion induziert die Bildung des ZBP1-PANoptosoms und die ZBP1-defizienten Zellen sind während einer Influenza-A-Virusinfektion signifikant vor dem Zelltod geschützt. In ähnlicher Weise induzieren HSV1- und Francisella novicida-Infektionen die Bildung des AIM2-PANoptosoms, und AIM2-defiziente Zellen erleiden als Reaktion auf diese Infektionen keinen robusten Zelltod.Zellen, denen vorgeschaltete Inflammasomsensoren fehlen, sind als Reaktion auf ihre jeweiligen Reize vor dem Zelltod geschützt, und NLRP3-defiziente Zellen erleiden keinen Zelltod als Reaktion auf Lipopolysaccharid und ATP. Es ist wichtig, daran zu denken, eine Mischung aus beiden Zelllysaten herzustellen, um eine bestimmte Caspase zu bestimmen. Nach dem Laden des Jets sollte die leuchtende Probe bei minus 20 Grad gelagert werden, um die Integrität der Caspase-Ziele für die Nachverfolgung aufrechtzuerhalten In Verbindung mit diesem Protokoll können Echtzeit-Zelltod-Bildgebung oder LDH-Assays verwendet werden, um die Ausführung des Zelltods zu überwachen, und ELIZAs können verwendet werden, um die Freisetzung von Zytokinen oder DAMPs aus Zellen zu überprüfen, die verschiedenen Arten des Zelltods unterzogen werden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Seven Steps to Cells Stellate

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Methoden zur Beta Cell Death vermittelt durch zytotoxische T-Lymphozyten Beurteilung

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Die Quantifizierung der Atem Burst Antwort als Indikator für Angeborene Immunsystem Gesundheit in Zebrafisch

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Zergliedern Angeborene Immunsystem Signaling in Viral Evasion von Zytokin-Produktion

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Mit RNA-Interferenz, um die angeborene Immunantwort in Makrophagen der Maus Untersuchen

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Nicht-invasive Bildgebung von der angeborenen Immunantwort in einem Zebrafisch-Larven Modell<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infektions

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Gesättigte Fettsäuren induzieren Ceramid-assoziierten Makrophagen Zelltod

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling TUNEL and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

Mit Terminal-Transferase-vermittelten dUTP Assays Nick Ende-Kennzeichnung (TUNEL) und Caspase 3/7 Maßnahme epidermalen Zelltod in Frösche mit Chytridiomykose

Amphibians are experiencing a great loss in biodiversity globally and one of the major causes is the infectious disease chytridiomycosis. This disease is ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

Immunstimulierenden Agent Bewertung: Lymphatischen Gewebe Extraktion und Injektion Route-Dependent Dendritische Zelle Aktivierung

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...