Name: evaluation of caspase activation to assess innate immune cell death
Uploaded: 2023-01-20T13:00:00
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Agradecemos aos membros do laboratório Kanneganti por seus comentários e sugestões, e agradecemos a J. Gullett, PhD, pelo apoio à edição científica. O trabalho em nosso laboratório é apoiado pelos subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 e CA253095 (para T.-D.K.) e pelas Instituições de Caridade Associadas Sírias Libanesas Americanas (para T.-D.K.). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

O uso e os procedimentos dos animais foram aprovados pelo Comitê de Pesquisa do Hospital Infantil St. Jude sobre o Uso e Cuidado dos Animais.
1. Preparação das soluções
<ol><li>Prepare a mídia condicionada por L929.<ol><li>A placa 1 × 106 células L929 (ver Tabela de Materiais) num balão de cultura de tecidos de182 cm 2 contendo 50 ml de meios de cultura L929 (ver Tabela 1 para a preparação do meio).</li>
		<l...

O monitoramento da clivagem e ativação da caspase fornece uma das imagens mais abrangentes da ativação inata do PCD imune como parte da resposta imune inata. O protocolo aqui descrito demonstra uma estratégia para monitorar a ativação da caspase em resposta às infecções por IAV, HSV1 e F. novicida e ao gatilho estéril LPS + ATP, mas inúmeros outros estímulos podem induzir PCD e poderiam ser utilizados nesse método, como tem sido demonstrado em várias publicações 44,48,49,50,51,52,53,54,56<sup cl...

O sistema imunológico inato atua como a primeira linha de defesa durante a infecção e em resposta a estímulos estéreis, como lesão tecidual e alterações na homeostase. Sensores imunes inatos na superfície celular e no citoplasma respondem a padrões moleculares associados a patógenos ou danos (PAMPs ou DAMPs, respectivamente) para desencadear vias de sinalização inflamatória e respostas celulares. Um dos principais processos da resposta imune inata é a indução da morte celular para remover células infectadas ou danificadas e impulsionar ainda mais respostas imunes inatas e adaptativas. A morte celular programada (PCD) é um processo altamente conservado em todas as espécies, destacando sua importância evolutiva como um mecanismo imunológico inato.
Existem várias vias inatas de PCD imunes que podem ser ativadas em todos os tipos de células. As caspases são uma família-chave de proteases altamente conservadas, intracelulares e dependentes de cisteína que são críticas em muitas vias de PCD, incluindo a via de apoptose tradicionalmente não inflamatória, bem como vias inflamatórias de PCD, como piroptose, necroptose e PANoptose 1,2,3,4,5 . Existem 11 caspases humanas e 10 murinas que estão bem definidas, bem como pseudocaspases que podem ser funcionais, e a maioria é expressa constitutivamente como pró-caspases monoméricas ou diméricas inativas que requerem clivagem para ativação 6,7. As caspases também contêm domínios importantes para o recrutamento e formação de complexos multiproteicos. Estes incluem o domínio de ativação e recrutamento da caspase (CARD), que pode ser encontrado na caspase-1, caspase-2, caspase-4, caspase-5, caspase-9 e caspase-11, ou o domínio efetor da morte (DED), que é encontrado na caspase-8 e caspase-10. Através de sua atividade proteolítica e sua capacidade de formar complexos multiproteicos, as caspases são fatores críticos da PCD imune inata.
O papel das caspases na PCD imune inata foi identificado pela primeira vez na apoptose, onde as caspases iniciadoras, caspase-2, caspase-8, caspase-9 e caspase-10, ativam as caspases carrasco, caspase-3, caspase-6 e caspase-7, para conduzir a morte celular 8,9,10,11,12. As caspases do iniciador podem ser ativadas por diversas cascatas de sinalização; a via extrínseca ativa a caspase-8 através da sinalização do receptor de morte induzida por ligantes extracelulares, e a via intrínseca ativa a caspase-9 através da ruptura da integridade mitocondrial13. As caspases iniciadoras ativadas clivam o ligador separando as grandes e pequenas subunidades catalíticas das caspases do carrasco para produzir suas formas ativas. As caspases do carrasco então clivam seus substratos para desmontar a célula, resultando em degradação do DNA, blebbing da membrana, fragmentação nuclear e liberação de corpos apoptóticos14,15. Esse processo geralmente termina em uma forma não lítica e não inflamatória de morte celular quando acoplado à depuração imediata das células moribundas por eferocitose16. No entanto, defeitos na eferocitose ou falta de células fagocíticas podem levar ao acúmulo de células apoptóticas, que então sofrem morte celular lítica e inflamatória17,18.
As caspases inflamatórias, incluindo caspase-1 (humana e rato), caspase-4 e caspase-5 (humana) e caspase-11 (rato), foram descobertas para serem ativadas durante uma forma de PCD IMUNE INATA INFLAMATÓRIA (III-PCD) chamada piroptose. A ativação da caspase-1 está associada à formação de inflamassomas, que são complexos multiproteicos contendo um sensor imune inato citosólico, uma molécula adaptadora (proteína speck-like associada à apoptose contendo um CARD [ASC]) e caspase-1. A formação desse complexo permite que a caspase-1 sofra autoproteólise mediada por proximidade para liberar sua forma ativa, que pode clivar substratos-alvo, incluindo as citocinas pró-inflamatórias interleucina (IL)-1β e IL-18 e a molécula formadora de poros gasdermina D (GSDMD)19,20,21,22,23 . A casspase-11, a caspase-4 e a caspase-5 também podem ativar o GSDMD sem a formação a montante do inflamassoma após a detecção de PAMPs como o lipopolissacarídeo (LPS)19,20. Essas caspases sofrem dimerização seguida de oligomerização e autoclivagem para ativação após a ligação ao LPS citosólico, o que leva à ativação do inflamassoma não canônico 24,25,26 e ativação da caspase-1 de forma intrínseca à célula para induzir a maturação da IL-1β e IL-18 20. A maturação e a liberação dessas citocinas pró-inflamatórias caracterizam essas caspases como "inflamatórias". Além disso, descobriu-se que a caspase-8 apoptótica localiza-se no inflamassoma, fornecendo uma ligação entre os processos apoptóticos e piropóticos. Estudos descobriram que a caspase-8 apoptótica também é crítica para regular outra forma de PCD chamada necroptose. A perda de caspase-8 resulta na ativação espontânea de serina-treonina quinase 3 (RIPK3) mediada por uma pseudoquinase de linhagem mista mediada por receptores (MLKL) para conduzir a via III-PCD da necroptose 27,28,29,30,31,32,33,34,35.
Embora as caspases tenham sido historicamente classificadas como "apoptóticas" ou "inflamatórias" com base no tipo de morte celular que iniciam, evidências crescentes sugerem que há uma extensa conversa cruzada entre as vias inatas da PCD imune através das caspases 3,4. Por exemplo, a caspase-1 inflamatória dos inflamassomos cliva a caspase-7 apoptótica em seu local de ativação canônica34. A ativação da caspase-1 também pode levar à clivagem de substratos apoptóticos, como a poli(ADP-ribose) polimerase 1 (PARP1)36. Em células sem GSDMD, a caspase-1 também pode clivar a caspase-337,38. Além disso, a caspase-3 canonicamente apoptótica pode clivar a gasdermina E (GSDME) para induzir a PCD17,18 e também processa a GSDMD em uma forma inativa40. Além disso, o recrutamento da caspase-8 para o complexo inflamassoma tem sido observado 39,40,41,42,43,44,45, e a caspase-8 é um regulador chave da ativação do inflamassoma canônico e não canônico 39. Há também papéis sobrepostos e redundantes para a caspase-8 e a caspase-1 em muitas condições inflamatórias, e a PCD imune inata caracterizada pela ativação de componentes piropóticos, apoptóticos e necroptóticos ocorre em todo o espectro da doença 39,46,47,48,49,50.
Com base nesse crosstalk entre caspases inflamatórias e apoptóticas, uma lacuna fundamental na compreensão mecanicista da imunidade inata e PCD foi identificada, levando à descoberta da PANoptosis. A PANoptose é uma forma única de III-PCD que é ativada em resposta a patógenos, PAMPs, DAMPs e alterações na homeostase e é regulada por PANoptossomos - complexos macromoleculares multifacetados que integram componentes de outras vias de morte celular 44,50,51,52,53,54,55 . A totalidade dos efeitos biológicos na PANoptose não pode ser individualmente explicada por piroptose, apoptose ou necroptose isoladamente 3,4,35,36,39,46,47,48, uma vez que a PANoptose é caracterizada pela ativação de múltiplas caspases, incluindo caspase-1, caspase-11, caspase-8, caspase-9, caspase-3 e/ou caspase-7, dependendo do contexto 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . A PANoptose tem sido cada vez mais implicada em doenças infecciosas e inflamatórias, bem como em cânceres e terapias oncológicas 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56 ,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.
Dado o papel essencial das caspases nas vias de morte celular, inclusive na apoptose, piroptose, necroptose e PANoptose, é importante desenvolver técnicas para caracterizar sua ativação e compreender toda a complexidade das vias da PCD. O protocolo aqui detalha um método para estimular as células e medir a ativação subsequente das caspases (Figura 1). Este método aproveita a clivagem proteolítica das caspases, que geralmente é necessária para a sua ativação, como um meio de estudá-las. Através do western blotting, os tamanhos das proteínas podem ser determinados, permitindo a visualização clara e diferenciação de pró-caspases inativas e suas formas ativadas e clivas.
As principais vantagens deste protocolo são 1) sua capacidade de avaliar a ativação de múltiplas caspases em paralelo a partir de uma única população de células endógenas para determinar com mais precisão a ativação da PCD e 2) o uso de técnicas laboratoriais relativamente simples que não requerem treinamento extensivo ou equipamentos caros. Protocolos anteriores usaram western blotting, repórteres fluorescentes ou coloração de anticorpos para monitorar a ativação da caspase em sobrenadantes de cultura, lisados celulares e teciduais, células inteiras via microscopia e in vivo 67,68,69,70,71, mas essas técnicas geralmente monitoram apenas uma ou duas caspases em uma amostra. Além disso, enquanto substratos peptídicos sintéticos contendo sítios de clivagem da caspase que fluorescem sobre a clivagem têm sido usados para monitorar a ativação da caspase em lisados celulares ou teciduais69, esses substratos muitas vezes podem ser clivados por mais de uma caspase, dificultando a determinação da ativação específica de caspases individuais neste sistema. Além disso, o uso de western blotting em vez do uso de repórteres fluorescentes ou outros métodos baseados em tags permite que os pesquisadores usem células endógenas em vez de criar linhagens celulares específicas com genes repórteres. Existem múltiplas vantagens no uso de células endógenas, incluindo o fato de que muitas linhagens celulares imortalizadas são deficientes em moléculas-chave de morte celular72,73, o que poderia afetar os resultados. Além disso, o uso de células endógenas permite a avaliação de diversos tipos de células, como macrófagos, células epiteliais e células endoteliais, em vez de uma única linhagem. Western blotting também é uma técnica relativamente simples e econômica que pode ser realizada em laboratórios em todo o mundo sem a necessidade de equipamentos grandes e caros ou configurações complicadas.
Esse protocolo é amplamente aplicável em toda a biologia para entender as funções dependentes da morte celular e independentes da morte celular das caspases, incluindo seus papéis e funções de andaimes em outras vias de sinalização inflamatória74. A aplicação deste método permite uma abordagem unificada no estudo das vias inatas da PCD imune e da sinalização inflamatória entre doenças e condições, e este protocolo pode ser usado para identificar processos regulatórios críticos e conexões mecanicistas que informarão o desenvolvimento de futuras estratégias terapêuticas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCHVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12% polyacrylamide gel with 10 wells&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needle&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm tissue culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>182-cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accessory white trans tray</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0834-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-1 antibody</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-20B-0042-C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-11 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB120-10454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-3 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-7 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-8 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-9 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;cleaved caspase-3 antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;cleaved caspase-7 antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;cleaved caspase-8 antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>315-035-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-035-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>112-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;&#946;-Actin antibody (C4) HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-47778 HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-atpl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Trypticase Soy Broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead bath</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-4598-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer D30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6133000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BME</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BO126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>CellTreat Scientific Products</td>
			<td>229315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence imager (Amersham 600)&#160;</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29083461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2&#160;chamber</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>221S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eelectrophoresis apparatus&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Francisella novicida (U112 strain)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel releaser&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-043-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herpes simplex virus 1 (HF strain)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti&#8211;caspase-1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB6215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti&#8211;caspase-8 antibody</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ALX-804-242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>v1.53a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])&#160;</td>
			<td>constructed per Hoffmann et al.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-1</td>
			<td>cell line for creating L929-conditioned media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP376-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminata Forte Western HRP substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUF0500</td>
			<td>standard-sensitivity HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDCK cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td>cell line for determining IAV viral titer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dried milk powder</td>
			<td>Kroger</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>PHOSS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power source&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking shaker</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S2035-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripping buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal Femto HRP substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34580</td>
			<td>high-sensitivity HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot semi-dry system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-3pelps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td>cell line for determining HSV1 viral titer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of caspase activation to assess innate immune cell death

A imunidade inata fornece a primeira linha crítica de defesa em resposta a patógenos e insultos estéreis. Um componente mecanicista chave dessa resposta é o início da morte celular imune programada inata (PCD) para eliminar células infectadas ou danificadas e propagar respostas imunes. No entanto, o excesso de PCD está associado à inflamação e patologia. Portanto, entender a ativação e a regulação da PCD é um aspecto central da caracterização das respostas imunes inatas e da identificação de novos alvos terapêuticos em todo o espectro da doença.
Este protocolo fornece métodos para caracterizar a ativação inata da PCD imune monitorando caspases, uma família de proteases dependentes de cisteína que são frequentemente associadas a diversas vias da PCD, incluindo apoptose, pirotose, necroptose e PANoptose. Os relatos iniciais caracterizaram caspase-2, caspase-8, caspase-9 e caspase-10 como caspases iniciadoras e caspase-3, caspase-6 e caspase-7 como caspases efetoras na apoptose, enquanto estudos posteriores encontraram as caspases inflamatórias, caspase-1, caspase-4, caspase-5 e caspase-11, impulsionam a piroptose. Sabe-se agora que há uma extensa conversa cruzada entre as caspases e outras moléculas inatas imunes e de morte celular através das vias PCD previamente definidas, identificando uma lacuna de conhecimento fundamental na compreensão mecanicista da imunidade inata e PCD e levando à caracterização da PANoptosis. A PANoptose é uma via inata de PCD inflamatória imune única regulada por complexos PANoptosome, que integram componentes, incluindo caspases, de outras vias de morte celular.
Aqui, métodos para avaliar a ativação de caspases em resposta a vários estímulos são fornecidos. Esses métodos permitem a caracterização das vias de PCD tanto in vitro quanto in vivo, uma vez que as caspases ativadas sofrem clivagem proteolítica que pode ser visualizada por western blotting usando anticorpos ideais e condições de blotting. Foi estabelecido um protocolo e um fluxo de trabalho de western blotting que permitem a avaliação da ativação de múltiplas caspases de uma mesma população celular, proporcionando uma caracterização abrangente dos processos de PCD. Este método pode ser aplicado em todas as áreas de pesquisa em desenvolvimento, homeostase, infecção, inflamação e câncer para avaliar as vias PCD em todos os processos celulares na saúde e na doença.

PANoptosis tem sido observada em resposta a numerosas infecções bacterianas, virais e fúngicas e outros estímulos inflamatórios, bem como em células cancerosas 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 <su...

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Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Este protocolo descreve um método abrangente para avaliar a ativação da caspase (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 e caspase-11) em resposta a modelos in vitro e in vivo (em camundongos) de infecção, insultos estéreis e câncer para determinar o início de vias de morte celular, como piroptose, apoptose, necroptose e PANoptose.

Avaliação da ativação da caspase para avaliar a morte de células imunes inatas

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Este protocolo fornece uma compreensão multifacetada da ativação dos processos de morte celular, o que pode fornecer insights críticos sobre os mecanismos da doença e informar estratégias terapêuticas. Este protocolo baseia-se no uso de uma técnica mais simples e para acessar a ativação de múltiplas caspases imperativas a partir de uma única população de células endógenas para determinar grandemente a ativação. A morte de células imunes inatas tem sido implicada em todo o espectro da doença, de infecções a doenças inflamatórias e cânceres.Compreender os mecanismos moleculares da morte celular através da ativação da caspase pode fornecer insights críticos sobre os processos da doença. O Dr. Julieann, pesquisador associado de pós-doutorado de um laboratório, demonstrará o procedimento. Após isolar a medula óssea e diferenciar as BMDMs, infectar as células com o vírus influenza A.Calcule o volume de vírus necessário em uma multiplicidade de infecção de 20 unidades formadoras de placas. Remova o meio dos BMDMs e lave as células uma vez com 500 microlitros de PBS. Adicione 450 microlitros de vírus Influenza A em DMEM de alta glicose sem FBS inativado por calor a cada poço e incube as placas a 37 graus Celsius por uma hora em uma incubadora umidificada para permitir a absorção.Ao final da incubação de uma hora, adicione 50 microlitros de FBS inativado pelo calor e devolva as placas à incubadora a 37 graus Celsius por um total de 12 horas. Após 12 horas de incubação, retire a placa da incubadora. Aspirar 150 microlitros do sobrenadante e descartá-lo ou guardá-lo para análise do sobrenadante.Não remova o sobrenadante restante. Agora, crie a solução de coleta de proteínas combinando 50 microlitros de tampão de lise de caspase e 100 microlitros de quatro tampões XSDS por poço. Em seguida, adicione 150 microlitros da mistura a cada poço.Para cada poço, pipete a mistura para coletar as células lisadas e o sobrenadante. Durante a pipetagnação, raspe o fundo do poço com a ponta da pipeta para interromper as células. Após a raspagem e pipetagem, colete o lisado de proteína em tubos de 1,5 mililitro rotulados.Usando um bloco de calor, aqueça todos os tubos a 100 graus Celsius por 12 minutos. Retire os tubos do bloco de calor e centrifuja a 14.500 G durante 30 segundos à temperatura ambiente para peltar quaisquer componentes insolúveis. Preparar o aparelho de eletroforese com um gel de poliacrilamida a 12% com 10 orifícios.Encha o aparelho de eletroforese com tampão de funcionamento e remova o pente de gel. Em seguida, aqueça as amostras a 100 graus Celsius por cinco minutos. Centrifugar as amostras a 14, 500 G durante 30 segundos à temperatura ambiente antes de carregar.Em seguida, carregue lentamente 30 microlitros da amostra em cada poço. Use o sobrenadante combinado e o tampão de lisado proteico e lisato de caspase ou o homogeneizado tecidual para caspase 1, 3, 7 e 8 blots, e use o tampão de proteína lisado DN RIPA descrito no protocolo ou o homogeneizado tecidual para caspase 11 e 9. Para avaliar todas as seis caspases de uma só vez, use o mesmo procedimento para carregar as mesmas amostras em cada um dos seis géis.Conecte o aparelho de eletroforese à fonte de alimentação e ajuste a energia para 80 volts por 20 minutos para iniciar a corrida do gel. Após os 20 minutos iniciais, ajuste a potência para 100 volts por 45 a 60 minutos. Observe a frente do corante.Quando a frente do corante atingir o fundo do gel, desligue a energia. Enquanto o gel é executado, prepare o buffer de transferência conforme descrito no manuscrito. Torne a solução fresca a cada vez.Remova o gel do aparelho de eletroforese usando o liberador de gel. Para configurar a pilha de transferência para o gel, ative uma membrana PVDF mergulhando-a em metanol por um minuto. Pré-molhar dois pedaços de papel de filtro, o gel e a membrana de PVDF e tampão de transferência por cinco minutos.Mantenha a membrana e o gel PVDF em recipientes separados durante esta incubação de cinco minutos. Comece a montar a pilha de transferência no sistema semi-seco. No lado inferior do nano de platina, coloque um pedaço de papel de filtro, a membrana PVDF, o gel e, finalmente, um pedaço de papel de filtro.Estenda ou pressione suavemente as bolhas de ar entre as camadas e feche a parte superior do sistema. Agora, conecte-se à fonte de alimentação. Ajuste a potência para 25 volts por 40 minutos.Após a transferência, desmonte a pilha de transferência, colete a membrana e coloque-a em uma placa de Petri quadrada. Em seguida, execute o bloqueio da membrana adicionando 15 mililitros de uma solução de leite desnatado a 5% e incube a membrana em um agitador de balanço a 50 a 70 RPM à temperatura ambiente por uma hora. Após a incubação, remova a solução de bloqueio, adicione 10 mililitros da solução de anticorpos diluídos e incube por duas horas à temperatura ambiente ou quatro graus Celsius durante a noite em um agitador de balanço, como demonstrado anteriormente.Em seguida, recolha a solução de anticorpos e lave a membrana adicionando 15 mililitros de TBST à membrana num agitador de balanço à temperatura ambiente durante 10 minutos. Descarte o TBST. Repita a lavagem com 15 mililitros de TBST três vezes.Adicionar 10 mililitros da solução de anticorpos conjugados HRP secundários diluídos. Incubar num agitador à temperatura ambiente durante uma hora. No final da incubação, uma vez que a solução de anticorpos é removida, lave a membrana adicionando 15 mililitros de TBST em um agitador de balanço à temperatura ambiente por 10 minutos.Depois de completar as etapas de lavagem e remover o TBST, adicione 10 mililitros do substrato HRP de alta sensibilidade. Deixe descansar à temperatura ambiente durante um minuto. Remova a membrana do substrato.Prossiga diretamente para a imagem usando um imageador de quimioluminescência com a bandeja trans branca acessória inserida na posição inferior. Exponha a membrana usando o modo de exposição automática. São analisadas as caspase pró e ativada 1, 11, 3, 7, 8 e 9 no tipo selvagem e mutante ZBP1 após infecção pelo vírus Influenza A, tipo selvagem e mutante AIM2 após infecção por HSV1 e infecção por Francisella novicida, ou BDMs mutantes do tipo selvagem e NLRP3 após estimulação com lipopolissacarídeo e ATP.As células sem sensores de PANoptosis a montante não sofrem morte celular robusta em resposta aos estímulos cognatos indutores de PANoptosis. A infecção pelo vírus influenza A induz a formação do ZBP1-PANoptosome e as células deficientes em ZBP1 são significativamente protegidas da morte celular durante a infecção pelo vírus Influenza A. Da mesma forma, as infecções por HSV1 e Francisella novicida induzem a formação do PANoptossomo AIM2, e as células deficientes em AIM2 não sofrem morte celular robusta em resposta a essas infecções.As células sem sensores de inflamassoma a montante são protegidas da morte celular em resposta aos seus respectivos estímulos, e as células deficientes em NLRP3 não sofrem morte celular em resposta ao lipopolissacarídeo e ATP. É importante lembrar de preparar uma mistura de lisado celular para determinar uma caspase específica. Após o carregamento do jato, a amostra luminosa deve ser armazenada menos 20 graus para manter a integridade dos objetivos da caspase para acompanhamento Em conjunto com este protocolo, imagens de morte celular em tempo real ou ensaios de LDH podem ser usados para monitorar a execução da morte celular, e ELIZAs podem ser usados para verificar a liberação de citocinas ou DAMPs de células submetidas a diferentes tipos de morte celular.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Métodos para avaliar Mediated Beta Morte celular por linfócitos T citotóxicos

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Imunologia e Infecção

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Quantificação da Resposta explosão respiratória como um indicador da imunitário inatas Saúde em Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Dissecando imunitário inatas Sinalização em Evasion Viral da produção de citocinas

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Imagem não invasivo do imunitário inatas Response em um modelo de peixe-zebra larval de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C)

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic PolyI:C

Indução de Maternal Immune Activation em Ratos na Fase Mid-gestação com Viral Mimic poli (I: C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Ácidos graxos saturados induzir a morte celular de macrófagos associada a ceramida

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling TUNEL and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

Usando o Terminal Transferase-mediada dUTP Nick End-rotulagem (TUNEL) e Caspase 3/7 ensaios a morte de células epidérmicas medida em sapos com quitridiomicose

Amphibians are experiencing a great loss in biodiversity globally and one of the major causes is the infectious disease chytridiomycosis. This disease is ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Deteção de ativação de Inflammasome e morte celular de Pyroptotic nos macrófagos da medula óssea-derivado murino

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

Immunostimulatory agente avaliação: Linfoide em injeção e extração de tecido ativação rota dependente de célula dendrítica

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...