Name: evaluation of caspase activation to assess innate immune cell death
Uploaded: 2023-01-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death at JoVE.com

Agradecemos a los miembros del laboratorio de Kanneganti por sus comentarios y sugerencias, y agradecemos a J. Gullett, PhD, por el apoyo de edición científica. El trabajo en nuestro laboratorio está respaldado por las subvenciones AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 y CA253095 (a T.-D.K.) y por las Caridades Asociadas Libanesas Sirias Americanas (a T.-D.K.). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

El uso y los procedimientos de los animales fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales del St. Jude Children's Research Hospital.
1. Preparación de las soluciones
<ol><li>Prepare los medios acondicionados para L929.<ol><li>Placa 1 × 106 células L929 (ver Tabla de materiales) en un matraz de cultivo de tejidos de 182cm2 que contiene 50 ml de medios de cultivo L929 (ver Tabla 1 para la preparación de...

El monitoreo de la escisión y activación de la caspasa proporciona una de las imágenes más completas de la activación innata de PCD inmune como parte de la respuesta inmune innata. El protocolo descrito aquí demuestra una estrategia para monitorizar la activación de caspasas en respuesta a infecciones por IAV, HSV1 y F. novicida y el desencadenante estéril LPS+ATP, pero muchos otros estímulos pueden inducir PCD y podrían ser utilizados en este método, como se ha demostrado en varias publicaciones 44,4...

El sistema inmune innato actúa como la primera línea de defensa durante la infección y en respuesta a estímulos estériles, como lesiones tisulares y alteraciones en la homeostasis. Los sensores inmunes innatos en la superficie celular y en el citoplasma responden a patrones moleculares asociados a patógenos o daños (PAMP o DAMP, respectivamente) para desencadenar vías de señalización inflamatoria y respuestas celulares. Uno de los procesos clave de la respuesta inmune innata es la inducción de la muerte celular para eliminar las células infectadas o dañadas e impulsar más respuestas inmunes innatas y adaptativas. La muerte celular programada (PCD) es un proceso altamente conservado en todas las especies, destacando su importancia evolutiva como mecanismo inmune innato.
Hay varias vías innatas inmunes de PCD que pueden activarse en todos los tipos de células. Las caspasas son una familia clave de proteasas altamente conservadas, intracelulares y dependientes de cisteína que son críticas en muchas vías de PCD, incluida la vía de apoptosis tradicionalmente no inflamatoria, así como las vías inflamatorias de PCD como piroptosis, necroptosis y PANoptosis 1,2,3,4,5 . Hay 11 caspasas humanas y 10 murinas que están bien definidas, así como pseudo-caspasas que pueden ser funcionales, y la mayoría se expresan constitutivamente como pro-caspasas monoméricas o diméricas inactivas que requieren escisión para la activación 6,7. Las caspasas también contienen dominios importantes para el reclutamiento y la formación de complejos multiproteicos. Estos incluyen el dominio de activación y reclutamiento de caspasas (CARD), que se puede encontrar en caspasa-1, caspasa-2, caspasa-4, caspasa-5, caspasa-9 y caspasa-11, o el dominio efector de muerte (DED), que se encuentra en caspasa-8 y caspasa-10. A través de su actividad proteolítica y su capacidad para formar complejos multiproteicos, las caspasas son impulsores críticos de la PCD inmune innata.
El papel de las caspasas en la PCD inmune innata se identificó por primera vez en la apoptosis, donde las caspasas iniciadoras, caspasa-2, caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-10, activan las caspasas verdugo, caspasa-3, caspasa-6 y caspasa-7, para conducir a la muerte celular 8,9,10,11,12. Las caspasas del iniciador pueden activarse mediante diversas cascadas de señalización; La vía extrínseca activa la caspasa-8 a través de la señalización del receptor de muerte inducida por ligandos extracelulares, y la vía intrínseca activa la caspasa-9 a través de la interrupción de la integridad mitocondrial13. Las caspasas iniciadoras activadas escinden el enlazador separando las subunidades catalíticas grandes y pequeñas de las caspasas ejecutoras para producir sus formas activas. Las caspasas verdugos luego escinden sus sustratos para desmontar la célula, lo que resulta en la degradación del ADN, el blebbing de la membrana, la fragmentación nuclear y la liberación de cuerpos apoptóticos14,15. Este proceso típicamente termina en una forma no lítica y no inflamatoria de muerte celular cuando se combina con la eliminación inmediata de las células moribundas por eferocitosis16. Sin embargo, los defectos en la eferocitosis o la falta de células fagocíticas pueden conducir a la acumulación de células apoptóticas, que luego sufren la muerte celular lítica e inflamatoria17,18.
Se ha descubierto que las caspasas inflamatorias, incluidas la caspasa-1 (humana y ratón), la caspasa-4 y la caspasa-5 (humana) y la caspasa-11 (ratón), se activan durante una forma de PCD INMUNE INNATA INFLAMATORIA (III-PCD) llamada piroptosis. La activación de la caspasa-1 se asocia con la formación de inflamasomas, que son complejos multiproteicos que contienen un sensor inmune innato citosólico, una molécula adaptadora (proteína moteada asociada a la apoptosis que contiene una CARD [ASC]) y caspasa-1. La formación de este complejo permite que la caspasa-1 se someta a una autoproteólisis mediada por proximidad para liberar su forma activa, que puede escindir sustratos diana incluyendo las citoquinas proinflamatorias interleucina (IL)-1β e IL-18 y la molécula formadora de poros gasdermina D (GSDMD)19,20,21,22,23 . La caspasa-11, la caspasa-4 y la caspasa-5 también pueden activar la GSDMD sin la formación aguas arriba del inflamasoma después de detectar PAMPs como el lipopolisacárido (LPS)19,20. Estas caspasas sufren dimerización seguida de oligomerización y autoescisión para la activación al unirse a LPS citosólico, lo que conduce a la activación no canónica del inflamasoma 24,25,26 y la activación de la caspasa-1 de manera intrínseca celular para inducir la maduración de IL-1β e IL-18 20. La maduración y liberación de estas citoquinas proinflamatorias caracterizan a estas caspasas como "inflamatorias". Además, se ha encontrado que la caspasa-8 apoptótica se localiza en el inflamasoma, proporcionando un vínculo entre los procesos apoptóticos y piroptóticos. Los estudios han encontrado que la caspasa-8 apoptótica también es crítica para regular otra forma de PCD llamada necroptosis. La pérdida de caspasa-8 da como resultado la activación espontánea de la serina-treonina quinasa 3 (RIPK3) mediada por el receptor de serina-treonina quinasa 3 (RIPK3) mediada por la pseudoquinasa de linaje mixto (MLKL) para impulsar la vía III-PCD de necroptosis 27,28,29,30,31,32,33,34,35.
Mientras que las caspasas han sido históricamente clasificadas como "apoptóticas" o "inflamatorias" en función del tipo de muerte celular que inician, la creciente evidencia sugiere que existe una amplia diafonía entre las vías innatas inmunes de PCD a través de caspasas 3,4. Por ejemplo, la caspasa-1 inflamatoria de los inflamasomas escinde la caspasa-7 apoptótica en su sitio de activación canónica34. La activación de la caspasa-1 también puede conducir a la escisión de sustratos apoptóticos como la poli(ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP1)36. En las células que carecen de GSDMD, la caspasa-1 también puede escindir la caspasa-337,38. Además, la caspasa-3 canónicamente apoptótica puede escindir la gasdermina E (GSDME) para inducir PCD17,18 y también procesa GSDMD en una forma inactiva40. Además, se ha observado el reclutamiento de caspasa-8 para el complejo inflamasoma 39,40,41,42,43,44,45, y la caspasa-8 es un regulador clave de la activación del inflamasoma canónico y no canónico 39. También hay roles superpuestos y redundantes para la caspasa-8 y la caspasa-1 en muchas condiciones inflamatorias, y la PCD inmune innata caracterizada por la activación de componentes piroptóticos, apoptóticos y necroptóticos ocurre en todo el espectro de la enfermedad 39,46,47,48,49,50.
Sobre la base de esta diafonía entre las caspasas inflamatorias y apoptóticas, se identificó una brecha clave en la comprensión mecanicista de la inmunidad innata y la PCD, lo que llevó al descubrimiento de la PANoptosis. PANoptosis es una forma única de III-PCD que se activa en respuesta a patógenos, PAMP, DAMP y alteraciones en la homeostasis y está regulada por PANoptosomas, complejos macromoleculares multifacéticos que integran componentes de otras vías de muerte celular 44,50,51,52,53,54,55 . La totalidad de los efectos biológicos en la PANoptosis no pueden explicarse individualmente por piroptosis, apoptosis o necroptosis solas 3,4,35,36,39,46,47,48, ya que la PANoptosis se caracteriza por la activación de múltiples caspasas, incluyendo caspasa-1, caspasa-11, caspasa-8, caspasa-9, caspasa-3 y/o caspasa-7, dependiendo del contexto 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . La PANoptosis ha sido cada vez más implicada en enfermedades infecciosas e inflamatorias, así como en cánceres y terapias contra el cáncer 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56 ,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.
Dado el papel esencial de las caspasas a través de las vías de muerte celular, incluso en la apoptosis, la piroptosis, la necroptosis y la PANoptosis, es importante desarrollar técnicas para caracterizar su activación y comprender toda la complejidad de las vías de PCD. El protocolo aquí detalla un método para estimular las células y medir la activación posterior de las caspasas (Figura 1). Este método aprovecha la escisión proteolítica de las caspasas, que generalmente se requiere para su activación, como un medio para estudiarlas. A través de Western blotting, se pueden determinar los tamaños de las proteínas, lo que permite la visualización clara y la diferenciación de las pro-caspasas inactivas y sus formas activadas y escindidas.
Las principales ventajas de este protocolo son 1) su capacidad para evaluar la activación de múltiples caspasas en paralelo de una sola población de células endógenas para determinar con mayor precisión la activación de PCD y 2) el uso de técnicas de laboratorio relativamente simples que no requieren una capacitación extensa o equipos costosos. Los protocolos anteriores han utilizado Western blotting, reporteros fluorescentes o tinción de anticuerpos para monitorear la activación de caspasas en sobrenadantes de cultivo, lisados celulares y tisulares, células enteras mediante microscopía e in vivo 67,68,69,70,71, pero estas técnicas generalmente solo monitorean una o dos caspasas en una muestra. Además, mientras que los sustratos peptídicos sintéticos que contienen sitios de escisión de caspasa que fluorescen sobre la escisión se han utilizado para monitorear la activación de caspasas en lisados celulares o tisulares69, estos sustratos a menudo pueden ser escindidos por más de una caspasa, lo que dificulta determinar la activación específica de caspasas individuales en este sistema. Además, el uso de Western blot en lugar del uso de reporteros fluorescentes u otros métodos basados en etiquetas permite a los investigadores usar células endógenas en lugar de crear líneas celulares específicas con genes reporteros. El uso de células endógenas tiene múltiples ventajas, incluido el hecho de que muchas líneas celulares inmortalizadas son deficientes en moléculas clave de muerte celular72,73, lo que podría afectar los resultados. Además, el uso de células endógenas permite la evaluación de diversos tipos de células, como macrófagos, células epiteliales y células endoteliales, en lugar de un solo linaje. Western blot también es una técnica relativamente simple y rentable que se puede llevar a cabo en laboratorios de todo el mundo sin la necesidad de equipos grandes y costosos o configuraciones complicadas.
Este protocolo es ampliamente aplicable en toda la biología para comprender las funciones dependientes de la muerte celular e independientes de la muerte celular de las caspasas, incluidas sus funciones de andamiaje y funciones en otras vías de señalización inflamatoria74. La aplicación de este método permite un enfoque unificado en el estudio de las vías innatas inmunes de PCD y la señalización inflamatoria a través de enfermedades y afecciones, y este protocolo se puede utilizar para identificar procesos regulatorios críticos y conexiones mecanicistas que informarán el desarrollo de futuras estrategias terapéuticas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCHVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12% polyacrylamide gel with 10 wells&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needle&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm tissue culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>182-cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accessory white trans tray</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0834-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-1 antibody</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-20B-0042-C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-11 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB120-10454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-3 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-7 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-8 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;caspase-9 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;cleaved caspase-3 antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;cleaved caspase-7 antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;cleaved caspase-8 antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>315-035-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-035-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>112-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;&#946;-Actin antibody (C4) HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-47778 HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-atpl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Trypticase Soy Broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead bath</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-4598-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer D30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6133000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BME</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BO126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>CellTreat Scientific Products</td>
			<td>229315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence imager (Amersham 600)&#160;</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29083461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2&#160;chamber</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>221S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eelectrophoresis apparatus&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Francisella novicida (U112 strain)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel releaser&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-043-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herpes simplex virus 1 (HF strain)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti&#8211;caspase-1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB6215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti&#8211;caspase-8 antibody</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ALX-804-242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>v1.53a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])&#160;</td>
			<td>constructed per Hoffmann et al.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-1</td>
			<td>cell line for creating L929-conditioned media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP376-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminata Forte Western HRP substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUF0500</td>
			<td>standard-sensitivity HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDCK cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td>cell line for determining IAV viral titer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dried milk powder</td>
			<td>Kroger</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>PHOSS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power source&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking shaker</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S2035-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripping buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal Femto HRP substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34580</td>
			<td>high-sensitivity HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot semi-dry system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-3pelps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td>cell line for determining HSV1 viral titer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of caspase activation to assess innate immune cell death

La inmunidad innata proporciona la primera línea crítica de defensa en respuesta a patógenos e insultos estériles. Un componente mecanicista clave de esta respuesta es el inicio de la muerte celular programada inmune innata (PCD) para eliminar las células infectadas o dañadas y propagar las respuestas inmunes. Sin embargo, el exceso de PCD se asocia con inflamación y patología. Por lo tanto, comprender la activación y regulación de la PCD es un aspecto central de la caracterización de las respuestas inmunes innatas y la identificación de nuevos objetivos terapéuticos en todo el espectro de la enfermedad.
Este protocolo proporciona métodos para caracterizar la activación innata de PCD inmune mediante el monitoreo de caspasas, una familia de proteasas dependientes de cisteína que a menudo se asocian con diversas vías de PCD, incluyendo apoptosis, piroptosis, necroptosis y PANoptosis. Los informes iniciales caracterizaron la caspasa-2, la caspasa-8, la caspasa-9 y la caspasa-10 como caspasas iniciadoras y la caspasa-3, caspasa-6 y caspasa-7 como caspasas efectoras en la apoptosis, mientras que estudios posteriores encontraron que las caspasas inflamatorias, caspasa-1, caspasa-4, caspasa-5 y caspasa-11, impulsan la piroptosis. Ahora se sabe que existe una amplia diafonía entre las caspasas y otras moléculas innatas inmunes y de muerte celular a través de las vías de PCD previamente definidas, identificando una brecha de conocimiento clave en la comprensión mecanicista de la inmunidad innata y PCD y conduciendo a la caracterización de PANoptosis. PANoptosis es una vía PCD inflamatoria inmune innata única regulada por complejos PANoptosomas, que integran componentes, incluidas las caspasas, de otras vías de muerte celular.
Aquí, se proporcionan métodos para evaluar la activación de las caspasas en respuesta a diversos estímulos. Estos métodos permiten la caracterización de las vías de PCD tanto in vitro como in vivo, ya que las caspasas activadas experimentan una escisión proteolítica que puede visualizarse mediante western blot utilizando anticuerpos óptimos y condiciones de blotting. Se ha establecido un protocolo y un flujo de trabajo de western blotting que permiten evaluar la activación de múltiples caspasas de la misma población celular, proporcionando una caracterización integral de los procesos de PCD. Este método se puede aplicar en todas las áreas de investigación en desarrollo, homeostasis, infección, inflamación y cáncer para evaluar las vías de PCD a lo largo de los procesos celulares en la salud y la enfermedad.

La PANoptosis se ha observado en respuesta a numerosas infecciones bacterianas, virales y fúngicas y otros estímulos inflamatorios, así como en células cancerosas 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 <s...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death at JoVE.com

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Este protocolo describe un método integral para evaluar la activación de caspasas (caspasa-1, caspasa-3, caspasa-7, caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-11) en respuesta a modelos de infección, insultos estériles y cáncer tanto in vitro como in vivo (en ratones) para determinar el inicio de vías de muerte celular, como piroptosis, apoptosis, necroptosis y PANoptosis.

Evaluación de la activación de la caspasa para evaluar la muerte celular inmune innata

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Este protocolo proporciona una comprensión multifacética de la activación de los procesos de muerte celular, que puede proporcionar información crítica sobre los mecanismos de la enfermedad e informar estrategias terapéuticas. Este protocolo se basa en el uso de una técnica más sencilla y para acceder a la activación de múltiples caspasas imperativo de una sola población de células endógenas para determinar en gran medida la activación. La muerte celular inmune innata se ha implicado en todo el espectro de la enfermedad, desde infecciones hasta enfermedades inflamatorias y cánceres.Comprender los mecanismos moleculares de la muerte celular a través de la activación de caspasas puede proporcionar información crítica sobre los procesos de la enfermedad. Julieann, investigadora postdoctoral asociada de un laboratorio, demostrará el procedimiento. Después de aislar la médula ósea y diferenciar las DMO, infectar las células con el virus de la gripe A.Calcule el volumen de virus necesario en una multiplicidad de infección de 20 unidades formadoras de placa. Retire los medios de los BMDM y lave las células una vez con 500 microlitros de PBS. Agregue 450 microlitros del virus de la influenza A en DMEM de alta glucosa sin FBS inactivado por calor a cada pocillo, e incube las placas a 37 grados centígrados durante una hora en una incubadora humidificada para permitir la absorción.Al final de la incubación de una hora, agregue 50 microlitros de FBS inactivado por calor y devuelva las placas a la incubadora a 37 grados centígrados durante un total de 12 horas. Después de 12 horas de incubación, retire la placa de la incubadora. Aspire 150 microlitros del sobrenadante y deseche o guárdelo para el análisis del sobrenadante.No retire el sobrenadante restante. Ahora, cree la solución de recolección de proteínas combinando 50 microlitros de tampón de lisis de caspasa y 100 microlitros de cuatro tampón XSDS por pocillo. Luego, agregue 150 microlitros de la mezcla a cada pozo.Para cada pocillo, pipetear la mezcla para recoger las células lisadas y el sobrenadante. Durante el pipeteo, raspe el fondo del pozo con la punta de la pipeta para interrumpir las células. Después de raspar y pipetear, recoger el lisado de proteínas en tubos marcados de 1,5 mililitros.Usando un bloque de calor, caliente todos los tubos a 100 grados centígrados durante 12 minutos. Retire los tubos del bloque térmico y centrifugar a 14, 500 G durante 30 segundos a temperatura ambiente para granular cualquier componente insoluble. Preparar el aparato de electroforesis con un gel de poliacrilamida al 12% con 10 pocillos.Llene el aparato de electroforesis con un tampón de funcionamiento y retire el peine de gel. Luego, caliente las muestras a 100 grados centígrados durante cinco minutos. Centrifugar las muestras a 14, 500 G durante 30 segundos a temperatura ambiente antes de cargarlas.Luego, cargue lentamente 30 microlitros de la muestra en cada pocillo. Utilice el sobrenadante combinado y el lisado de proteínas y el tampón de lisis de caspasa o el homogeneizado tisular para las manchas de caspasa 1, 3, 7 y 8, y use el tampón DN RIPA de lisado de proteínas descrito en el protocolo o el homogeneizado tisular para la caspasa 11 y 9. Para evaluar las seis caspasas a la vez, utilice el mismo procedimiento para cargar las mismas muestras en cada uno de los seis geles.Conecte el aparato de electroforesis a la fuente de alimentación y ajuste la alimentación a 80 voltios durante 20 minutos para comenzar la carrera del gel. Después de los primeros 20 minutos, ajuste la potencia a 100 voltios durante 45 a 60 minutos. Observe el frente del tinte.Una vez que el frente del tinte llegue al fondo del gel, apague la alimentación. Mientras el gel funciona, prepare el tampón de transferencia como se describe en el manuscrito. Haga que la solución sea fresca cada vez.Retire el gel del aparato de electroforesis utilizando el liberador de gel. Para configurar la pila de transferencia para el gel, active una membrana de PVDF empapándola en metanol durante un minuto. Moje previamente dos trozos de papel de filtro, el gel y la membrana de PVDF y el tampón de transferencia durante cinco minutos.Mantenga la membrana de PVDF y el gel en recipientes separados durante esta incubación de cinco minutos. Comience a ensamblar la pila de transferencia en el sistema semiseco. En el lado inferior nano de platino, coloque una pieza de papel de filtro, la membrana de PVDF, el gel y, finalmente, una pieza de papel de filtro.Extienda suavemente o presione las burbujas de aire entre las capas y cierre la parte superior del sistema. Ahora, conéctese a la fuente de alimentación. Ajuste la alimentación a 25 voltios durante 40 minutos.Después de la transferencia, desmonte la pila de transferencia, recoja la membrana y colóquela en una placa de Petri cuadrada. A continuación, realice el bloqueo de la membrana agregando 15 mililitros de una solución de leche descremada al 5% e incube la membrana en una coctelera oscilante a 50 a 70 RPM a temperatura ambiente durante una hora. Después de la incubación, retire la solución de bloqueo, agregue 10 mililitros de la solución de anticuerpos diluidos e incube durante dos horas a temperatura ambiente o cuatro grados centígrados durante la noche en una coctelera oscilante, como se demostró anteriormente.Luego, recoja la solución de anticuerpos y lave la membrana agregando 15 mililitros de TBST a la membrana en un agitador oscilante a temperatura ambiente durante 10 minutos. Descarte el TBST. Repita el lavado con 15 mililitros de TBST tres veces.Agregue 10 mililitros de la solución de anticuerpos conjugados HRP secundaria diluida. Incubar en una coctelera a temperatura ambiente durante una hora. Al final de la incubación, una vez que se retire la solución de anticuerpos, lave la membrana agregando 15 mililitros de TBST en una coctelera a temperatura ambiente durante 10 minutos.Después de completar los pasos de lavado y retirar el TBST, agregue 10 mililitros del sustrato HRP de alta sensibilidad. Déjelo reposar a temperatura ambiente durante un minuto. Retire la membrana del sustrato.Proceda directamente a la obtención de imágenes utilizando un generador de imágenes de quimioluminiscencia con la bandeja trans blanca accesoria insertada en la posición inferior. Exponga la membrana utilizando el modo de exposición automática. Se analizan las caspasa pro y activada 1, 11, 3, 7, 8 y 9 en tipo salvaje y mutante ZBP1 después de la infección por el virus de la influenza A, tipo salvaje y mutante AIM2 después de la infección por HSV1, e infección por Francisella novicida, o BDM mutantes de tipo salvaje y NLRP3 después de la estimulación con lipopolisacáridos y ATP.Las células que carecen de sensores de PANoptosis aguas arriba no experimentan una muerte celular robusta en respuesta a los estímulos afines inductores de PANoptosis. La infección por el virus de la influenza A induce la formación del monosoma ZBP1-PANoptosoma y las células deficientes en ZBP1 están significativamente protegidas de la muerte celular durante la infección por el virus de la influenza A. Del mismo modo, las infecciones por HSV1 y Francisella novicida inducen la formación del PANoptosoma AIM2, y las células deficientes en AIM2 no experimentan una muerte celular robusta en respuesta a estas infecciones.Las células que carecen de sensores inflamasómicos aguas arriba están protegidas de la muerte celular en respuesta a sus respectivos estímulos, y las células deficientes en NLRP3 no sufren muerte celular en respuesta al lipopolisacárido y al ATP. Es importante recordar preparar una mezcla de ambos lisados celulares para determinar una caspasa específica. Después de cargar el chorro, la muestra luminosa debe almacenarse menos 20 grados para mantener la integridad de los objetivos de la caspasa para el seguimiento Junto con este protocolo, se pueden usar imágenes de muerte celular en tiempo real o ensayos de LDH para monitorear la ejecución de la muerte celular, y ELIZA se puede usar para verificar la liberación de citoquinas o DAMP de células que experimentan diferentes tipos de muerte celular.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Siete pasos para células estrelladas

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Investigación

Inmunología e Infección

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Métodos para evaluar la Beta mediada por la muerte celular por linfocitos T citotóxicos

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Cuantificación de la respuesta estallido respiratorio como un indicador de la salud inmune innata en el pez cebra

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

La disección de señalización inmune innata en Evasion Viral de la producción de citoquinas

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

El uso de ARN de interferencia para Investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Imagen no invasiva de la respuesta inmune innata en un modelo de larvas de pez cebra de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infección

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Ácidos grasos saturados inducir muerte celular de macrófago asociado de ceramida

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling TUNEL and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

Utilizando mediada por la transferasa Terminal dUTP Nick End-etiquetado (TUNEL) y caspasas 3/7 ensayos a muerte celular epidérmica, medida en ranas con la quitridiomicosis

Amphibians are experiencing a great loss in biodiversity globally and one of the major causes is the infectious disease chytridiomycosis. This disease is ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Detección de Inflammasome activación y muerte celular Pyroptotic en macrófagos derivados de médula ósea murinas

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

Evaluación de inmunoestimulantes agente: Linfoide inyección y extracción de tejido dendrítico de la célula dependiente de la ruta de activación

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...