Name: assessment of mitochondrial health in cancer-associated fibroblasts isolated from 3d multicellular lung tumor spheroids
Uploaded: 2022-10-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af SERB-Women Excellence Award Project, Indien (SB/WEA-02/2017) og SERB-Early Career Research Award Project, Indien (ECR/2017/000892) til DP. Forfatterne, LA og SR anerkender IIT Ropar og MHRD for deres forskningsstipendier. MK anerkender ICMR for sit forskningsstipendium.

1. Cellekultur
<ol><li>Kulturhumant lungeadenokarcinomcellelinje A549 og human monocytisk cellelinje THP-1 i RPMI1640-medier suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin ved 37 °C i et befugtet kammer med 5% CO2.</li>
	<li>Dyrkning MRC-5 humane lungefibroblastceller i DMEM-medium suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycinopløsning ved 37 °C i et befugtet kammer med 5% CO2.</li>
</ol>2. Fremstilling af multicellulære tumorsfæroider...

<ol>
	<li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+demonstrates+the+molecular+and+cellular+reprogramming+of+metastatic+lung+adenocarcinoma.">Single-cell RNA sequencing demonstrates the molecular and cellular reprogramming of metastatic lung adenocarcinoma.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-5 (2020).</li><li>Davidson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+reveals+a+dynamic+stromal+niche+that+supports+tumor+growth.">Single-cell RNA sequencing reveals a dynamic stromal niche that supports tumor growth.</a> Cell Reports. 31 (7), 107628 (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analyses+of+renal+cell+cancers+reveal+insights+into+tumor+microenvironment,+cell+of+origin,+and+therapy+response.">Single-cell analyses of renal cell cancers reveal insights into tumor microenvironment, cell of origin, and therapy response.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (24), (2021).</li><li>Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+patient+specificity+in+the+engineering+of+tumor+models.">Addressing patient specificity in the engineering of tumor models.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217 (2019).</li><li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method.">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Tissue Engineering. , 141-151 (2007).</li><li>Dituri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+tumor+spheroid+formation+and+one-step+cancer-associated+fibroblasts+purification+from+hepatocellular+carcinoma+tissue+promoted+by+inorganic+surface+topography.">Complex tumor spheroid formation and one-step cancer-associated fibroblasts purification from hepatocellular carcinoma tissue promoted by inorganic surface topography.</a> Nanomaterials. 11 (12), 3233 (2021).</li><li>Arora, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multicellular+3D+tumor+model+to+study+cellular+heterogeneity+and+plasticity+in+NSCLC+tumor+microenvironment.">Development of a multicellular 3D tumor model to study cellular heterogeneity and plasticity in NSCLC tumor microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 12, 881207 (2022).</li><li>Nurmik, M., Ullmann, P., Rodriguez, F., Haan, S., Letellier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+search+of+definitions:+Cancer-associated+fibroblasts+and+their+markers.">In search of definitions: Cancer-associated fibroblasts and their markers.</a> International Journal of Cancer. 146 (4), 895-905 (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1&#945;+is+necessary+for+activation+and+tumour-promotion+effect+of+cancer-associated+fibroblasts+in+lung+cancer.">HIF-1&#945; is necessary for activation and tumour-promotion effect of cancer-associated fibroblasts in lung cancer.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (12), 5457-5469 (2021).</li><li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+heterogeneity+and+versatility+of+cancer-associated+fibroblasts+in+the+tumor+microenvironment.">Biological heterogeneity and versatility of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment.</a> Oncogene. 38 (25), 4887-4901 (2019).</li><li>Whitaker-Menezes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+stromal-epithelial+&amp;#34;lactate+shuttle&amp;#34;+in+human+tumors:+MCT4+is+a+marker+of+oxidative+stress+in+cancer-associated+fibroblasts.">Evidence for a stromal-epithelial &amp;#34;lactate shuttle&amp;#34; in human tumors: MCT4 is a marker of oxidative stress in cancer-associated fibroblasts.</a> Cell cycle. 10 (11), 1772-1783 (2011).</li><li>Mandujano-Tinoco, E. A., Gallardo-P&#233;rez, J. C., Mar&#237;n-Hern&#225;ndez, A., Moreno-S&#225;nchez, R., Rodr&#237;guez-Enr&#237;quez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-mitochondrial+therapy+in+human+breast+cancer+multi-cellular+spheroids.">Anti-mitochondrial therapy in human breast cancer multi-cellular spheroids.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1833 (3), 541-551 (2013).</li><li>Bregman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology. , (2002).</li><li>Berry, E. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+hemes+a,+b,+and+c+from+pyridine+hemochrome+spectra.">Simultaneous determination of hemes a, b, and c from pyridine hemochrome spectra.</a> Analytical Biochemistry. 161 (1), 1-15 (1987).</li><li>Avagliano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+cancer+associated+fibroblasts:+the+slavery+of+stromal+fibroblasts.">Metabolic reprogramming of cancer associated fibroblasts: the slavery of stromal fibroblasts.</a> BioMed Research International. , (2018).</li><li>Lorusso, G., R&#252;egg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+and+its+contribution+to+tumor+evolution+toward+metastasis.">The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).</li><li>Liu, T., Zhou, L., Li, D., Andl, T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+build+and+secure+the+tumor+microenvironment.">Cancer-associated fibroblasts build and secure the tumor microenvironment.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 60 (2019).</li><li>Sebastian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+analysis+of+tumor-derived+fibroblasts+and+normal+tissue-resident+fibroblasts+reveals+fibroblast+heterogeneity+in+breast+cancer.">Single-cell transcriptomic analysis of tumor-derived fibroblasts and normal tissue-resident fibroblasts reveals fibroblast heterogeneity in breast cancer.</a> Cancers. 12 (5), 1307 (2020).</li><li>Elyada, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+single-cell+analysis+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+reveals+antigen-presenting+cancer-associated+fibroblasts.">Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts.</a> Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).</li><li>Ganguly, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts:+Versatile+players+in+the+tumor+microenvironment.">Cancer-associated fibroblasts: Versatile players in the tumor microenvironment.</a> Cancers. 12 (9), 2652 (2020).</li><li>Harryvan, T. J., Verdegaal, E. M., Hardwick, J. C., Hawinkels, L. J., vander Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+the+cancer-associated+fibroblast-T-cell+axis+in+solid+malignancies.">Targeting of the cancer-associated fibroblast-T-cell axis in solid malignancies.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1989 (2019).</li><li>Santi, A., Kugeratski, F. G., Zanivan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts:+the+architects+of+stroma+remodeling.">Cancer associated fibroblasts: the architects of stroma remodeling.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700167 (2018).</li></ol>

Denne undersøgelse introducerer udviklingen af multicellulære tumorsfæroider bestående af tumorceller, stromalcellepopulation (dvs. fibroblaster) og immuncellepopulation (dvs. monocytter) ved hjælp af en modificeret hængende dråbemetode. Fibroblaster og monocytter / makrofager er blandt de mest betydningsfulde populationer, der udgør tumormikromiljøet (TME), og deres tilstedeværelse er ofte forbundet med dårlig patientprognose16. Når fibroblaster er til stede i TME, transformeres de og...

Solide tumorer består af heterogene cellepopulationer, der styres af tumormikromiljøet (TME), men oprindelsen af de fleste celler er endnu ikke opdaget. Hovedsageligt stromale og immunceller (fibroblaster, endotelceller, monocytter, makrofager, dendritiske celler, B-celler, T-celler og deres undergrupper) afspejler tumorheterogeniteten i lunge-, bryst-, nyre- og andre faste kræftformer 1,2,3. Forståelse af oprindelsen af hver undertype og deres transdifferentieringspotentiale er af største behov for at udvikle avancerede terapier mod disse kræftformer. Analysen af denne forskelligartede cellepopulation i humane biopsier præsenterer sig for flere udfordringer på grund af tumortype, sted, stadium, begrænsning af prøvemængde og patientspecifikke variationer4. Således er der brug for en eksperimentel model, som ikke kun er pålidelig, men også kan simulere in vivo-tumortilstanden, hvilket viser sig at være ideel til at studere tumor-stroma krydstale og dets involvering i sygdomspatofysiologi.
Tredimensionelle (3D) multicellulære tumorsfæroidkulturer (MCTS) er et fordelagtigt in vitro-modelsystem af tumorer på grund af deres lighed med naturlige modstykker. MCTS kan bedre replikere aspekter af solide tumorer end 2D-cellekulturmodeller, herunder deres rumlige arkitektur, fysiologiske reaktioner, frigivelse af opløselige mediatorer, genekspressionsmønstre og lægemiddelresistensmekanismer. Desuden er en hovedfordel ved MCTS, at den kan bruges til at studere tumorheterogenitet og tumormikromiljøet (TME). Hanging-drop-metoden er det mest anvendte værktøj til udvikling og analyse af MCTS5. I denne metode suspenderes de forskellige celler med medier i form af dråber, hvilket tillader dets vækst på en sammenhængende 3D-aggregeret måde og er let tilgængelig til undersøgelse. Teknikken er ligetil; Det kræver ikke mange celler og eliminerer kravet om et specialiseret substrat som agarose til sfærisk udvikling6. En yderligere fordel ved denne metode ligger i reproducerbarheden af dens teknik. Desuden er denne metode også blevet brugt til co-kultur blandede cellepopulationer, såsom endotelceller og tumorceller, for at simulere tidlig tumorangiogenese7.
I denne undersøgelse blev multicellulære 3D-lungetumorsfæroider fremstillet med lungeadenokarcinomceller, fibroblaster og monocytter ved hjælp af hængende dråbemetoden, der efterligner lungetumormikromiljøet. Derefter blev den kræftassocierede fibroblast (CAF) befolkning isoleret for at undersøge mitokondriel sundhed. Hovedideen bag udviklingen af disse sfæroider er at isolere CAF'erne, da krydstalen mellem cellerne i sfæroider kunne omdanne fibroblasterne til en myo-fibroblastlignende aktiveret CAF-tilstand. For det andet kan denne undersøgelse også skildre, hvordan afvigende ROS-produktion og mitokondriel dysfunktion driver de normale fibroblaster mod den mere aggressive CAF-fænotype. Det blev fundet, at fibroblaster samlet i tumorsfæroider opnåede myofibroblastiske egenskaber med øget ROS-aktivitet og induktion af metabolisk genekspression. Denne protokol fremhæver vigtigheden af tumormikromiljøet i aktivering af CAF og kan være en fremragende model til in vitro-generering og undersøgelse af CAF-fænotypiske egenskaber.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human &#945;-SMA</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>Cat# IC1420A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fibroblast microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-050-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549 lung adenocarcinoma cells</td>
			<td>NCCS Pune</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC-5 fetal lung fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 Human monocytes</td>
			<td>NCCS Pune</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>Cat# 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,6-dichloroindophenol (DCPIP)</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 55287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# C3099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCFDA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# D6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>Cat# 17892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 62858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZcoun Lactate Dehydrogenase Cell Assay Kit</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>Cat# CCK036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 87786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse heart Cytochrome c</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 81551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-iT Red hypoxia reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# H10498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# T3168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 69824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nacl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH MB Grade</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 54941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 85124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenazine methosulfate (PMS)</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 55782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>Cat# P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Cell Lysis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 4458235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# A7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# 205222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 89904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate hexahydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 36313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO cDNA synthesis kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11754-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Cat# 172-5124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL core imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Serial Number F0518-1727-0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica fluorescent inverted microscope</td>
			<td>s</td>
			<td>DMi8 automated S/N 424150)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi MACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of mitochondrial health in cancer-associated fibroblasts isolated from 3d multicellular lung tumor spheroids

Kræftassocierede fibroblaster (CAF'er) er blandt de mest rigelige stromale celler, der er til stede i tumormikromiljøet, hvilket letter tumorvækst og progression. Kompleksitet inden for tumormikromiljøet, herunder tumorsekretom, lavgradig inflammation, hypoxi og redox ubalance, fremmer heterotypisk interaktion og tillader transformation af inaktive residente fibroblaster at blive aktive CAF'er. CAF'er skelnes metabolisk fra normale fibroblaster (NF'er), da de er mere glykolytisk aktive, producerer højere niveauer af reaktive iltarter (ROS) og overudtrykker laktateksportør MCT-4, hvilket fører til åbningen af mitokondriepermeabilitetsporen (MPTP). Her er der beskrevet en metode til at analysere mitokondriesundheden hos aktiverede CAF'er isoleret fra de multicellulære 3D-tumorsfæroider bestående af humane lungeadenokarcinomceller (A549), humane monocytter (THP-1) og humane lungefibroblastceller (MRC5). Tumorsfæroider blev opløst med forskellige tidsintervaller, og gennem magnetisk aktiveret cellesortering blev CAF'er isoleret. Mitokondriemembranpotentialet for CAF'er blev vurderet ved anvendelse af JC-1-farvestof, ROS-produktion ved 2',7'-dichlordihydrofluoresceindiacetatfarvning (DCFDA) og enzymaktivitet i de isolerede CAF'er. Analyse af mitokondriesundheden hos isolerede CAF'er giver en bedre forståelse af den omvendte Warburg-effekt og kan også anvendes til at studere konsekvenserne af CAF-mitokondrieændringer, såsom metaboliske fluxer og de tilsvarende reguleringsmekanismer på lungekræftheterogenitet. Således går den nuværende undersøgelse ind for en forståelse af tumor-stroma-interaktioner på mitokondriel sundhed. Det ville give en platform til at kontrollere mitokondriespecifikke lægemiddelkandidater for deres effektivitet mod CAF'er som potentielle behandlinger i tumormikromiljøet og derved forhindre CAF-involvering i lungekræftprogression.

Figur 1 viser udviklingen af flercellede tumorsfæroider ved hjælp af tre forskellige cellepopulationer - A549 (lungeadenokarcinom), MRC-5 (fibroblaster) og THP-1 (monocytter) - ved hængende dråbemetoden som observeret på dag 7 og dag 10 under mikroskopet. På dag 7 var sfæroider kompakte og stive med en diameter på 260 ± 5,3 μm, og på dag 10 var sfæroider 480 ± 7,5 μm i diameter (figur 1A øverste panel, figur 1B-D).<strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids at JoVE.com

Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

Multicellulære 3D-tumorsfæroider blev fremstillet med lungeadenocarcinomceller, fibroblaster og monocytter efterfulgt af isolering af kræftassocierede fibroblaster (CAF'er) fra disse sfæroider. Isolerede CAF'er blev sammenlignet med normale fibroblaster for at vurdere mitokondriel sundhed ved at studere mitokondrietransmembranpotentialet, reaktive iltarter og enzymatiske aktiviteter.

Vurdering af mitokondriel sundhed i kræftassocierede fibroblaster isoleret fra 3D multicellulære lungetumorsfæroider

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

Denne protokol fremhæver vigtigheden af tumormikromiljøet i aktivering af kræftassocierede fibroblaster eller CAF. Det kunne være fremragende in vitro model til at studere fænotypiske egenskaber. De største begrænsninger i CAF-biologi ligger i den begrænsede tilgængelighed af CAF fra primære tumorbiopsiprøver.Så denne teknik kan bruges til at studere forskellige aspekter af CAF-biologi. Denne undersøgelse viser afvigende krydsproduktion og mitokondriel dysfunktion forbundet med CAF-aktivering, der fører til en dårlig tumorprognose. Anvendelsen af denne metode ville være nyttig til vurdering af tumorens traumeinteraktioner, især CAF-aktivering og mitokondriel sundhed.For at udforske de nye lægemiddelmål. Enkeltpersoner skal have erfaring med celleprocedure, før de udfører denne teknik. Den visuelle demonstration af denne teknik vil gøre det muligt at forstå de kritiske trin i isolering af CAF-populationen fra tumorsfæroiderne og nedstrømsapplikationer til at studere CAF-biologi.Miss Leena Arora, Miss Moyna Kalia og Mrs. Soumyajit Roy, assistenter i mit laboratorium, udfører eksperimenterne. Til at begynde vokse humant lungeadenocarcinom A549 og humane lungefibroblast MRC-5 klæbende celler i DMEM og humane monocytter THP-1-celler i RPMI komplet vækstmedium i T25-kolber ved 37 grader Celsius i et befugtet kammer med 5% kuldioxid.Efter tre dage, ved 80 til 85% cellesammenløb, vaskes A549- og MRC-5-cellerne med en milliliter PBS i et minut. Derefter høstes cellerne ved at inkubere dem med 500 mikroliter 0,25% trypsin EDTA-opløsning i fem minutter ved 37 grader Celsius. Derefter tilsættes straks fire ml komplet vækstmedium for at inaktivere trypsinet.Saml cellesuspensionen i et 15 ml rør og pellet det ned ved 125 x g i fem minutter. Supernatanten fjernes og cellerne resuspenderes i et fem ml komplet vækstmedium. For at etablere multicellulære tumorsfæroider skal du tælle A549-, MRC-5- og THP-1-cellenumre ved hjælp af en celletæller for et milliliter volumen.Efter tælling fremstilles cellesuspensionen i et forhold på 5: 4: 1 og fyldes op til en milliliter med komplet DMEM. Anbring derefter en dråbe 25 mikroliter cellesuspensionsblanding på dækslet til en 90 millimeter kulturskål. Fyld bunden af fadet med 10 ml sterilt vand.Vend forsigtigt låget over det vandfyldte hydratiseringskammer og læg skålen i en cellekulturinkubator i tre dage. På dag fire skal du overvåge sfæroiderne under mikroskopet. For at hente billeder skal du tænde for afbryderen.Placer 90 millimeter kulturskålen på scenen, og vælg 10 x forstørrelsen. Juster linserne og undersøg cellerne for at analysere celleaggregering og spredning. Tryk på de medfølgende fryse- og gemknapper for at tage billedet.Efter billeddannelse udskiftes vækstmediet ved forsigtigt at opsuge 20 mikroliter medium fra hver dråbe med et frisk medium. For levende død billeddannelse skal du tænde Ctr advanced, som er switch en, derefter CPU'en og vente på, at softwaresystemet starter. Når du starter, skal du placere 90 millimeter skålen indeholdende sfæroider på scenen i det inverterede fluorescerende mikroskop.Observer og tag derefter billeder med 10 x forstørrelse ved at vælge fluorescensindstillingen i softwaren og vælge FITC for calcein og Texas Red-kanalen. Vælg derefter indstillingen, live og se billedet. Juster fluorescensintensiteten for passende optimering, og klik på knappen sikker.Saml 200 tumorer, sfæroider hver på dag syv og 10 ved hjælp af en milliliter pipette og et 15 ml rør. Derefter pelleteres sfæroiderne ved centrifugering ved 125 x g i fem minutter, og supernatanten suges forsigtigt. Kugleformerne vaskes med 200 mikroliter PBS, centrifugeres igen og supernatanten kasseres.Tilsæt 400 mikroliter 0.25% trypsin EDTA-opløsning til sfærisk opløsning og inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Udfør kraftig pipettering for fuldstændig opløsning af sfæroiderne. Neutralisere trypsin ved at tilsætte en milliliter komplet DMEM vækstmedium.Derefter centrifugeres den kugleformede suspension, og supernatanten kasseres, inden pelletsen resuspenderes i en ml komplet DMEM-medium. Tæl det samlede antal celler som vist. Til isolering af kræftassocierede fibroblaster eller CAF'er fra tumorsfæroiderne resuspenderes 1 x 10 til de syvende celler i 80 mikroliter kold magnetisk aktiveret cellesortering eller MACS-buffer.Tilsæt 20 mikroliter antifibroblastmikroperler i cellesuspensionen, bland godt ved forsigtigt at banke røret og inkubere det ved stuetemperatur i 30 minutter. Efter inkubation vaskes cellerne med en milliliter kold MACS-buffer. Derefter centrifugeres og aspireres supernatanten, inden pelletsen resuspenderes i 500 mikroliter MACS-buffer.Til magnetisk perlebaseret celleseparation skal du forberede MACS-kolonnen ved at skylle den med tre ml MACS-buffer. Placer cellesuspensionen i kolonnen, og opsaml gennemstrømningen, der indeholder den umærkede cellepopulation. Vask derefter søjlen tre gange med tre ml MACS-buffer, før du fjerner den fra separatoren.Placer derefter søjlen på opsamlingsrøret. Saml de antifibroblast mikroperlemærkede celler ved at tilføje fem milliliter MACS-buffer og skubbe stemplet fast ind i søjlen. Centrifuger de mærkede celler, før du fortsætter til downstream-applikationer.Tæl antallet af isolerede CAF'er og brug ca. 6 x 10 til den fjerde celle til flowcytometrianalyse. Cellerne vaskes én gang med PBS, centrifugeres og aspireres derefter supernatanten. Derefter tilsættes 100 mikroliter cellepermeabiliseringsbuffer og inkuberer cellerne ved fire grader Celsius i 30 minutter med intermitterende hvirvel for at opretholde en enkelt cellesuspension.Igen, efter centrifugering og resuspendering af cellerne i permeabiliseringsbuffer, tilsættes to mikroliter APC-konjugeret anti-humant alfa SMA-antistof og inkuberes ved fire grader Celsius i 45 minutter. Efter inkubation tilsættes en milliliter permeabiliseringsbuffer og centrifugeres for at fjerne overskydende antistof. Resuspender pellet i 400 mikroliter permeabiliseringsbuffer til flowcytometri.Vælg ACTA2-positive celler efter at have skelnet mellem populationerne af celler baseret på deres fremad- og sidespredning. Valg af singletpopulation efterfulgt af valg af ACTA2-positive celler, der vises som en enkelt top på enkeltparameterhistogrammet. Udviklingen af multicellulære tumorsfæroider og levende døde analyser er vist her.På dag syv var sfæroider kompakte og stive med ca. 260 mikron i diameter. På dag 10 var sfæroider 480 mikron i diameter. I cellelevedygtighedsanalyse blev der observeret et fald i propidiumiodidfluorescens og en stigning i calcein-AM-fluorescens fra dag syv til dag 10.Hypoxisk farvning afslørede en hypoxisk kerne i midten af dagen 10 sfæroider. Desuden blev der observeret opregulering af E-cadherin og Mki-67 genekspression med stigningen i dage med tumorsfæroiddannelse. CAF'er isoleret fra dag 10 tumorsfæroider var ca. 69% ACTA2 positive.CAF'erne viste tredobbelt opregulering i ACTA2 og ti gange i kollagen type 1 alfa 2-kæde sammenlignet med MRC-5 fibroblaster. En signifikant stigning i ROS-niveauer på dag 10 tumorsfæroider blev observeret sammenlignet med dag syv, hvilket tyder på den mulige involvering af ROS-generering på CAF-aktivering. En signifikant stigning blev observeret i cellulære ROS niveauer i CAF'er, isoleret fra dag syv og dag 10 tumorsfæroider.Desuden blev en ændring af mitokondriemembranpotentiale set ved JC-1-farvning. En induktion af GLUT1 og MCT4 genekspression blev observeret i CAF'er sammenlignet med normale fibroblaster. Signifikant induktion af lactat dehydrogenase, cytokrom C oxidase og succinat dehydrogenase enzymaktivitet blev observeret i CAF'er sammenlignet med normale fibroblaster.Et forhold på 5: 4: 1 af A549-, MRC-5- og THP-1-celler skal anvendes til en vellykket udvikling af 3D multicellulær tumorsfæroid. Fibroblast befolkning er kritisk for stivheden af tumor sfæroider. I lighed med kationopløsning og karakterisering kan man også bruge denne tumorsfæroid til at opnå tumorassocieret makrofagcellepopulation, som er medskyldig i tumorprogression.Denne sfæroidanalyse vil hjælpe os med at forstå, hvordan kræftceller, der krydses fibroblast, er involveret i CAFs aktivering, og kan også bruges til at kontrollere mitokondriespecifikke lægemiddelkandidater.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

Lunge Tumor celle rekruttering Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR vurdering af pH, pO2, Redox Status, og koncentrationen af fosfat og glutathion i Tumor mikromiljø

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Etablering af en lunge kolonisering Assay for Cirkulerende Tumor Cell visualisering i lungevæv

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

En 3D Spheroid model som et mere fysiologisk system for kræft-associeret fibroblaster differentiering og invasion in vitro undersøgelser

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Etablering og karakterisering af små tarm neuroendokrine tumor Sfæroider

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Påvisning af lungetumorprogression hos mus ved ultralydsscanning

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

En musemodel til at undersøge rollen som kræftassocierede fibroblaster i tumorvækst

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Isolering af primær cancer-associerede fibroblaster fra en Syngeneic Murine Model af brystkræft til undersøgelse af målrettede nanopartikler

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Udforskning af mitokondrieenergimetabolisme af enkelt 3D-mikrotissu-sfroider ved hjælp af ekstracellulær fluxanalyse

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Etablering af 3-dimensionelle sfæroider fra patientafledte tumorprøver og evaluering af deres følsomhed over for lægemidler

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...