Name: assessment of mitochondrial health in cancer-associated fibroblasts isolated from 3d multicellular lung tumor spheroids
Uploaded: 2022-10-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het SERB-Women Excellence Award Project, India (SB/WEA-02/2017) en het SERB-Early Career Research Award Project, India (ECR/2017/000892) aan DP. De auteurs, LA en SR erkennen IIT Ropar en MHRD voor hun onderzoeksbeurzen. MK erkent ICMR voor haar onderzoeksbeurs.

1. Celkweek
<ol><li>Kweek menselijke long adenocarcinoom cellijn A549, en menselijke monocytaire cellijn THP-1 in RPMI1640 media aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine bij 37 °C in een bevochtigde kamer met 5% CO2.</li>
	<li>Kweek MRC-5 menselijke longfibroblastcellen in DMEM-medium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine-oplossing bij 37 °C in een bevochtigde kamer met 5% CO2.</li>
</ol>2. Bereiding van meercellige tumo...

<ol>
	<li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+demonstrates+the+molecular+and+cellular+reprogramming+of+metastatic+lung+adenocarcinoma.">Single-cell RNA sequencing demonstrates the molecular and cellular reprogramming of metastatic lung adenocarcinoma.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-5 (2020).</li><li>Davidson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+reveals+a+dynamic+stromal+niche+that+supports+tumor+growth.">Single-cell RNA sequencing reveals a dynamic stromal niche that supports tumor growth.</a> Cell Reports. 31 (7), 107628 (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analyses+of+renal+cell+cancers+reveal+insights+into+tumor+microenvironment,+cell+of+origin,+and+therapy+response.">Single-cell analyses of renal cell cancers reveal insights into tumor microenvironment, cell of origin, and therapy response.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (24), (2021).</li><li>Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+patient+specificity+in+the+engineering+of+tumor+models.">Addressing patient specificity in the engineering of tumor models.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217 (2019).</li><li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method.">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Tissue Engineering. , 141-151 (2007).</li><li>Dituri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+tumor+spheroid+formation+and+one-step+cancer-associated+fibroblasts+purification+from+hepatocellular+carcinoma+tissue+promoted+by+inorganic+surface+topography.">Complex tumor spheroid formation and one-step cancer-associated fibroblasts purification from hepatocellular carcinoma tissue promoted by inorganic surface topography.</a> Nanomaterials. 11 (12), 3233 (2021).</li><li>Arora, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multicellular+3D+tumor+model+to+study+cellular+heterogeneity+and+plasticity+in+NSCLC+tumor+microenvironment.">Development of a multicellular 3D tumor model to study cellular heterogeneity and plasticity in NSCLC tumor microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 12, 881207 (2022).</li><li>Nurmik, M., Ullmann, P., Rodriguez, F., Haan, S., Letellier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+search+of+definitions:+Cancer-associated+fibroblasts+and+their+markers.">In search of definitions: Cancer-associated fibroblasts and their markers.</a> International Journal of Cancer. 146 (4), 895-905 (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1&#945;+is+necessary+for+activation+and+tumour-promotion+effect+of+cancer-associated+fibroblasts+in+lung+cancer.">HIF-1&#945; is necessary for activation and tumour-promotion effect of cancer-associated fibroblasts in lung cancer.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (12), 5457-5469 (2021).</li><li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+heterogeneity+and+versatility+of+cancer-associated+fibroblasts+in+the+tumor+microenvironment.">Biological heterogeneity and versatility of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment.</a> Oncogene. 38 (25), 4887-4901 (2019).</li><li>Whitaker-Menezes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+stromal-epithelial+&amp;#34;lactate+shuttle&amp;#34;+in+human+tumors:+MCT4+is+a+marker+of+oxidative+stress+in+cancer-associated+fibroblasts.">Evidence for a stromal-epithelial &amp;#34;lactate shuttle&amp;#34; in human tumors: MCT4 is a marker of oxidative stress in cancer-associated fibroblasts.</a> Cell cycle. 10 (11), 1772-1783 (2011).</li><li>Mandujano-Tinoco, E. A., Gallardo-P&#233;rez, J. C., Mar&#237;n-Hern&#225;ndez, A., Moreno-S&#225;nchez, R., Rodr&#237;guez-Enr&#237;quez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-mitochondrial+therapy+in+human+breast+cancer+multi-cellular+spheroids.">Anti-mitochondrial therapy in human breast cancer multi-cellular spheroids.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1833 (3), 541-551 (2013).</li><li>Bregman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology. , (2002).</li><li>Berry, E. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+hemes+a,+b,+and+c+from+pyridine+hemochrome+spectra.">Simultaneous determination of hemes a, b, and c from pyridine hemochrome spectra.</a> Analytical Biochemistry. 161 (1), 1-15 (1987).</li><li>Avagliano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+cancer+associated+fibroblasts:+the+slavery+of+stromal+fibroblasts.">Metabolic reprogramming of cancer associated fibroblasts: the slavery of stromal fibroblasts.</a> BioMed Research International. , (2018).</li><li>Lorusso, G., R&#252;egg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+and+its+contribution+to+tumor+evolution+toward+metastasis.">The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).</li><li>Liu, T., Zhou, L., Li, D., Andl, T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+build+and+secure+the+tumor+microenvironment.">Cancer-associated fibroblasts build and secure the tumor microenvironment.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 60 (2019).</li><li>Sebastian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+analysis+of+tumor-derived+fibroblasts+and+normal+tissue-resident+fibroblasts+reveals+fibroblast+heterogeneity+in+breast+cancer.">Single-cell transcriptomic analysis of tumor-derived fibroblasts and normal tissue-resident fibroblasts reveals fibroblast heterogeneity in breast cancer.</a> Cancers. 12 (5), 1307 (2020).</li><li>Elyada, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+single-cell+analysis+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+reveals+antigen-presenting+cancer-associated+fibroblasts.">Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts.</a> Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).</li><li>Ganguly, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts:+Versatile+players+in+the+tumor+microenvironment.">Cancer-associated fibroblasts: Versatile players in the tumor microenvironment.</a> Cancers. 12 (9), 2652 (2020).</li><li>Harryvan, T. J., Verdegaal, E. M., Hardwick, J. C., Hawinkels, L. J., vander Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+the+cancer-associated+fibroblast-T-cell+axis+in+solid+malignancies.">Targeting of the cancer-associated fibroblast-T-cell axis in solid malignancies.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1989 (2019).</li><li>Santi, A., Kugeratski, F. G., Zanivan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts:+the+architects+of+stroma+remodeling.">Cancer associated fibroblasts: the architects of stroma remodeling.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700167 (2018).</li></ol>

De huidige studie introduceert de ontwikkeling van meercellige tumorsferoïden bestaande uit tumorcellen, stromale celpopulatie (d.w.z. fibroblasten) en immuuncelpopulatie (d.w.z. monocyten) met behulp van een gemodificeerde hanging drop-methode. Fibroblasten en monocyten/macrofagen behoren tot de belangrijkste populaties die de tumormicro-omgeving (TME) vormen, en hun aanwezigheid is vaak gekoppeld aan een slechte prognose van de patiënt16. Wanneer aanwezig in de TME, transformeren fibroblasten ...

Solide tumoren zijn samengesteld uit heterogene celpopulaties die worden geleid door de tumormicro-omgeving (TME), maar de oorsprong van de meeste cellen moet nog worden ontdekt. Voornamelijk stromale en immuuncellen (fibroblasten, endotheelcellen, monocyten, macrofagen, dendritische cellen, B-cellen, T-cellen en hun subsets) weerspiegelen de tumorheterogeniteit in long-, borst-, nier- en andere solide kankers 1,2,3. Inzicht in de oorsprong van elk subtype en hun transdifferentiatiepotentieel is van het grootste belang voor het ontwikkelen van geavanceerde therapieën tegen deze kankers. De analyse van deze diverse celpopulatie in menselijke biopsieën stelt zich voor verschillende uitdagingen vanwege het tumortype, de plaats, het stadium, de beperking van de hoeveelheid monster en patiëntspecifiekevariabiliteiten 4. Er is dus een experimenteel model nodig, dat niet alleen betrouwbaar is, maar ook de in vivo tumorconditie kan simuleren, wat bewijst dat het ideaal is voor het bestuderen van tumor-stroma-overspraak en de betrokkenheid ervan bij de pathofysiologie van de ziekte.
Driedimensionale (3D) meercellige tumor sferoïde (MCTS) culturen zijn een voordelig in vitro modelsysteem van tumoren vanwege hun gelijkenis met natuurlijke tegenhangers. MCTS kan aspecten van solide tumoren beter repliceren dan 2D-celkweekmodellen, inclusief hun ruimtelijke architectuur, fysiologische reacties, het vrijkomen van oplosbare mediatoren, genexpressiepatronen en medicijnresistentiemechanismen. Bovendien is een belangrijk voordeel van MCTS dat het kan worden gebruikt om tumor heterogeniteit en de tumormicro-omgeving (TME) te bestuderen. De hanging-drop methode is het meest gebruikte hulpmiddel voor het ontwikkelen en analyseren van MCTS5. Bij deze methode worden de verschillende cellen met media gesuspendeerd in de vorm van druppels, waardoor de groei op een coherente 3D-geaggregeerde manier mogelijk is en eenvoudig toegankelijk is voor onderzoek. De techniek is eenvoudig; het vereist niet veel cellen en elimineert de vereiste van een gespecialiseerd substraat zoals agarose voor de ontwikkeling van sferoïden6. Een bijkomend voordeel van deze methode ligt in de reproduceerbaarheid van de techniek. Bovendien is deze methode ook gebruikt om gemengde celpopulaties, zoals endotheelcellen en tumorcellen, te co-kweken om vroege tumorangiogenese te simuleren7.
In deze studie werden meercellige 3D-longtumorsferoïden bereid met longadenocarcinoomcellen, fibroblasten en monocyten met behulp van de hanging drop-methode die de micro-omgeving van de longtumor nabootst. Vervolgens werd de kanker-geassocieerde fibroblast (CAF) populatie geïsoleerd om mitochondriale gezondheid te onderzoeken. Het belangrijkste idee achter het ontwikkelen van deze sferoïden is om de CAFs te isoleren, omdat de kruisverwijzing tussen de cellen in sferoïden de fibroblasten zou kunnen transformeren in een myo-fibroblastachtige geactiveerde CAF-toestand. Ten tweede kan deze studie ook laten zien hoe afwijkende ROS-productie en mitochondriale disfunctie de normale fibroblasten naar het agressievere CAF-fenotype drijft. Het bleek dat fibroblasten geassembleerd in tumorsferoïden myofibroblastische kenmerken kregen met verhoogde ROS-activiteit en de inductie van metabole genexpressie. Dit protocol benadrukt het belang van de tumormicro-omgeving bij het activeren van CAF en zou een uitstekend model kunnen zijn voor in vitro generatie en studie van CAF fenotypische kenmerken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human &#945;-SMA</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>Cat# IC1420A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fibroblast microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-050-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549 lung adenocarcinoma cells</td>
			<td>NCCS Pune</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC-5 fetal lung fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 Human monocytes</td>
			<td>NCCS Pune</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>Cat# 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,6-dichloroindophenol (DCPIP)</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 55287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# C3099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCFDA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# D6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>Cat# 17892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 62858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZcoun Lactate Dehydrogenase Cell Assay Kit</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>Cat# CCK036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 87786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse heart Cytochrome c</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 81551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-iT Red hypoxia reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# H10498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# T3168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 69824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nacl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH MB Grade</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 54941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 85124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenazine methosulfate (PMS)</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 55782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>Cat# P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Cell Lysis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 4458235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# A7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# 205222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 89904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate hexahydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 36313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO cDNA synthesis kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11754-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Cat# 172-5124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL core imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Serial Number F0518-1727-0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica fluorescent inverted microscope</td>
			<td>s</td>
			<td>DMi8 automated S/N 424150)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi MACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of mitochondrial health in cancer-associated fibroblasts isolated from 3d multicellular lung tumor spheroids

Kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs) behoren tot de meest voorkomende stromale cellen die aanwezig zijn in de micro-omgeving van de tumor, waardoor tumorgroei en progressie worden vergemakkelijkt. Complexiteit binnen de micro-omgeving van de tumor, waaronder tumorsecreoom, laaggradige ontsteking, hypoxie en redox-onbalans, bevordert heterotypische interactie en maakt de transformatie van inactieve residente fibroblasten mogelijk om actieve CAFs te worden. CAFs worden metabolisch onderscheiden van normale fibroblasten (NF's) omdat ze meer glycolytisch actief zijn, hogere niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) produceren en lactaatexporteur MCT-4 overexpresseren, wat leidt tot de opening van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie (MPTP). Hier is een methode beschreven om de mitochondriale gezondheid van geactiveerde CAFs te analyseren die zijn geïsoleerd uit de meercellige 3D-tumorsferoïden bestaande uit menselijke longadenocarcinoomcellen (A549), menselijke monocyten (THP-1) en menselijke longfibroblastcellen (MRC5). Tumorsferoïden werden met verschillende tijdsintervallen gedesintegreerd en door magnetisch geactiveerde celsortering werden CAFs geïsoleerd. Het mitochondriale membraanpotentieel van CAFs werd beoordeeld met behulp van JC-1-kleurstof, ROS-productie door 2',7'-dichloordisofluorescerinediacetaat (DCFDA) -kleuring en enzymactiviteit in de geïsoleerde CAFs. Het analyseren van de mitochondriale gezondheid van geïsoleerde CAFs biedt een beter begrip van het omgekeerde Warburg-effect en kan ook worden toegepast om de gevolgen van CAF mitochondriale veranderingen te bestuderen, zoals metabole fluxen en de bijbehorende regulerende mechanismen op heterogeniteit van longkanker. De huidige studie pleit dus voor een goed begrip van tumor-stroma-interacties op mitochondriale gezondheid. Het zou een platform bieden om mitochondriaal-specifieke kandidaat-geneesmiddelen te controleren op hun werkzaamheid tegen CAFs als potentiële therapeutica in de tumormicro-omgeving, waardoor CAF-betrokkenheid bij de progressie van longkanker wordt voorkomen.

Figuur 1 toont de ontwikkeling van meercellige tumorsferoïden met behulp van drie verschillende celpopulaties - A549 (longadenocarcinoom), MRC-5 (fibroblasten) en THP-1 (monocyten) - door de hanging drop-methode zoals waargenomen op dag 7 en dag 10 onder de microscoop. Op dag 7 waren sferoïden compact en stijf met een diameter van 260 ± 5,3 μm en op dag 10 waren de sferoïden 480 ± 7,5 μm in diameter (figuur 1A bovenpaneel, fig...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids at JoVE.com

Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

Meercellige 3D-tumorsferoïden werden bereid met longadenocarcinoomcellen, fibroblasten en monocyten, gevolgd door de isolatie van kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs) uit deze sferoïden. Geïsoleerde CAFs werden vergeleken met normale fibroblasten om de mitochondriale gezondheid te beoordelen door het mitochondriale transmembraanpotentieel, reactieve zuurstofsoorten en enzymatische activiteiten te bestuderen.

Beoordeling van mitochondriale gezondheid in kankergeassocieerde fibroblasten geïsoleerd uit 3D meercellige longtumorenferoïden

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

Dit protocol benadrukt het belang van de tumormicro-omgeving bij het activeren van de kanker-geassocieerde fibroblasten of CAF. Het zou een uitstekend in vitro model kunnen zijn om fenotypische kenmerken te bestuderen. De belangrijkste beperkingen in de CAF-biologie liggen in de beperkte beschikbaarheid van CAF uit primaire tumorbiopsiemonsters.Deze techniek kan dus worden gebruikt om verschillende aspecten van de CAF-biologie te bestuderen. Deze studie toont afwijkende kruisproductie en mitochondriale disfunctie geassocieerd met CAF-activering die leidt tot een slechte tumorprognose. De toepassing van deze methode zou nuttig zijn voor het beoordelen van de trauma-interacties van de tumor, met name CAF-activering en mitochondriale gezondheid.Om de nieuwe medicijndoelen te verkennen. Individuen moeten ervaring hebben met celprocedures voordat ze deze techniek uitvoeren. De visuele demonstratie van deze techniek zal het mogelijk maken om de kritieke stappen te begrijpen bij het isoleren van de CAF-populatie van de tumorsferoïden en downstream-toepassingen om CAF-biologie te bestuderen.Miss Leena Arora, Miss Moyna Kalia en Mrs. Soumyajit Roy, assistenten van mijn lab voeren de experimenten uit. Om te beginnen met het kweken van menselijke longadenocarcinoom A549 en menselijke longfibroblast MRC-5-aanhangcellen in DMEM en menselijke monocyten THP-1-cellen in RPMI volledig groeimedium in T25-kolven bij 37 graden Celsius in een bevochtigde kamer met 5% koolstofdioxide.Na drie dagen, bij 80 tot 85% celconfluentie, wast u de A549- en MRC-5-cellen gedurende één minuut met één milliliter PBS. Oogst vervolgens de cellen door ze te incuberen met 500 microliter 0,25% trypsine EDTA-oplossing gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens onmiddellijk vier milliliter volledig groeimedium toe om het trypsine te inactiveren.Verzamel de celsuspensie in een buis van 15 milliliter en pelleteer deze gedurende vijf minuten op 125 x g. Verwijder het supernatant en resuspenseer de cellen in een vijf milliliter compleet groeimedium. Om meercellige tumorsferoïden vast te stellen, telt u A549-, MRC-5- en THP-1-celnummers met behulp van een celteller voor één millilitervolume.Bereid na het tellen de celsuspensie in een verhouding van 5:4:1 en vul het volume aan tot één milliliter met volledige DMEM. Plaats vervolgens een druppel van 25 microliter celsuspensiemengsel op de afdekking van een kweekschaal van 90 millimeter. Vul de bodem van de schaal met 10 milliliter steriel water.Keer het deksel voorzichtig om over de met water gevulde hydratatiekamer en plaats het gerecht drie dagen in een celkweekincubator. Controleer op dag vier de sferoïden onder de microscoop. Als u afbeeldingen wilt verkrijgen, schakelt u de aan/uit-schakelaar in.Plaats de 90 millimeter cultuurschaal op het podium en selecteer de 10 x vergroting. Pas de lenzen aan en onderzoek de cellen om de celaggregatie en proliferatie te analyseren. Druk op de knoppen vastlopen en opslaan om de afbeelding vast te leggen.Vervang na beeldvorming het groeimedium door voorzichtig 20 microliter medium uit elke druppel te halen met een vers medium. Schakel voor live-dead imaging Ctr advanced in, dat is switch één, dan de CPU en wacht tot het softwaresysteem opstart. Wanneer u opstart, plaatst u de schotel van 90 millimeter met sferoïden op het podium van de omgekeerde fluorescerende microscoop.Observeer en leg vervolgens beelden vast met een vergroting van 10 x door de fluorescentieoptie in de software te selecteren en de FITC voor het calceïne- en Texas Red-kanaal te selecteren. Selecteer vervolgens de optie, live en bekijk de afbeelding. Pas de fluorescentie-intensiteit aan voor de juiste optimalisatie en klik op de veilige knop.Verzamel 200 tumoren, sferoïden elk op dag zeven en 10 met behulp van een pipet van één milliliter en een buis van 15 milliliter. Pelleteer vervolgens de sferoïden door centrifugering bij 125 x g gedurende vijf minuten en adem het supernatant voorzichtig op. Was de sferoïden met 200 microliter PBS, centrifugeer opnieuw en gooi het supernatant weg.Voeg 400 microliter 0,25% trypsine EDTA-oplossing toe voor sferoïde desintegratie en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Voer krachtig pipetteren uit voor volledige desintegratie van de sferoïden. Neutraliseer het trypsine door één milliliter compleet DMEM-groeimedium toe te voegen.Centrifugeer vervolgens de sferoïde suspensie en gooi het supernatant weg voordat de pellet in één milliliter volledig DMEM-medium resuspendeert. Tel het totale aantal cellen zoals aangetoond. Voor de isolatie van cancer-associated fibroblasten of CAFs van de tumorsferoïden, resuspensie 1 x 10 tot de zevende cellen in 80 microliter koude magnetische geactiveerde celsortering of MACS-buffer.Voeg 20 microliter anti-fibroblast microbeads toe aan de celsuspensie, meng goed door zachtjes op de buis te tikken en deze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te broeden. Was na incubatie de cellen met één milliliter koude MACS-buffer. Vervolgens centrifugeer en aspirateer het supernatant voordat de pellet wordt geresuspendeerd in 500 microliter MACS-buffer.Voor magnetische op kralen gebaseerde celscheiding bereidt u de MACS-kolom voor door deze te spoelen met drie milliliter MACS-buffer. Plaats de celsuspensie in de kolom en verzamel de doorstroom met de niet-gelabelde celpopulatie. Was vervolgens de kolom driemaal met drie milliliter MACS-buffer voordat u deze uit de separator verwijdert.Plaats vervolgens de kolom op de verzamelbuis. Verzamel de anti-fibroblast microbead gelabelde cellen door vijf milliliter MACS-buffer toe te voegen en de zuiger stevig in de kolom te duwen. Centrifugeer de gelabelde cellen voordat u verder gaat met downstream-toepassingen.Tel het aantal geïsoleerde CAFs en gebruik ongeveer 6 x 10 tot de vierde cellen voor flowcytometrieanalyse. Was de cellen eenmaal met PBS, centrifugeer en aspirateer het supernatant. Voeg vervolgens 100 microliter celpermeabilisatiebuffer toe en incubeer de cellen gedurende 30 minuten op vier graden Celsius met intermitterende vortexing om een enkele celsuspensie te behouden.Nogmaals, na centrifugatie en resuspendatie van de cellen in permeabilisatiebuffer, voeg twee microliter APC-geconjugeerd anti-humaan alfa-SMA-antilichaam toe en incubeer gedurende 45 minuten bij vier graden Celsius. Voeg na incubatie een milliliter permeabilisatiebuffer en centrifuge toe om overtollig antilichaam te verwijderen. Resuspendeer de pellet in 400 microliter permeabilisatiebuffer voor flowcytometrie.Selecteer ACTA2-positieve cellen na het onderscheiden van de populaties van cellen op basis van hun voorwaartse en zijwaartse spreiding. Het selecteren van de singletpopulatie gevolgd door het selecteren van de ACTA2-positieve cellen die verschijnen als een enkele piek op het histogram met één parameter. De ontwikkeling van meercellige tumorsferoïden en levend-dood analyse worden hier getoond.Op dag zeven waren sferoïden compact en stijf met een diameter van ongeveer 260 micron. Op dag 10 hadden sferoïden een diameter van 480 micron. In de levensvatbaarheidstest van cellen werd een afname van propidiumjodidefluorescentie en een toename van calceïne-AM-fluorescentie van dag zeven tot dag 10 waargenomen.Hypoxische kleuring onthulde een hypoxische kern in het midden van de dag 10 sferoïden. Bovendien werd upregulatie van E-cadherine en Mki-67 genexpressie met de toename van dagen van tumorsferoïde vorming waargenomen. CAFs geïsoleerd vanaf dag 10 tumorsferoïden waren ongeveer 69% ACTA2-positief.De CAFs vertoonden drievoudige upregulatie in ACTA2 en tienvoudig in collageen type 1 alfa 2 keten in vergelijking met de MRC-5 fibroblasten. Een significante toename van ROS-niveaus op dag 10 tumorsferoïden werd waargenomen in vergelijking met dag zeven, wat de mogelijke betrokkenheid van ROS-generatie bij CAF-activering suggereert. Een significante toename werd waargenomen in cellulaire ROS-niveaus in CAFs, geïsoleerd vanaf dag zeven en dag 10 tumorsferoïden.Bovendien werd een verandering van mitochondriaal membraanpotentiaal waargenomen door JC-1-kleuring. Een inductie van GLUT1- en MCT4-genexpressie werd waargenomen in CAFs in vergelijking met normale fibroblasten. Significante inductie van lactaatdehydrogenase, cytochroom C-oxidase en succinaatdehydrogenase-enzymactiviteit werd waargenomen in CAFs in vergelijking met normale fibroblasten.Een verhouding van 5:4:1 van A549-, MRC-5- en THP-1-cellen moet worden gebruikt voor de succesvolle ontwikkeling van 3D-meercellige tumorsferoïden. Fibroblastpopulatie is van cruciaal belang voor de stijfheid van de tumorsferoïden. Vergelijkbaar met kationoplossing en karakterisering, kan men deze tumorsferoïde ook gebruiken om tumorgeassocieerde macrofaagcelpopulatie te verkrijgen, die medeplichtig is aan tumorprogressie.Deze sferoïde analyse zou ons helpen te begrijpen hoe kankercellen gekruiste fibroblast betrokken zijn bij de activering van de CAFs, en kan ook worden gebruikt om de mitochondriale specifieke kandidaat-geneesmiddelen te controleren.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

Long Tumor cel aanwerving Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR beoordeling van pH, pO2, Redox Status, en concentraties van fosfaat en glutathion in de communicatie van de Tumor

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

De oprichting van een Long kolonisatie Assay voor het circulerende Tumor visualisatie van de cel in de weefsels van de longen

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Oprichting en karakterisering van de neuro-endocriene tumor Spheroids van de kleine darm

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Detectie van longtumorprogressie bij muizen door echografie

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Een muismodel om de rol van kanker-geassocieerde fibroblasten in tumorgroei te onderzoeken

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Isolatie van primaire kanker-geassocieerde fibroblasten uit een syngenetisch muizenmodel van borstkanker voor de studie van gerichte nanodeeltjes

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Onderzoek naar mitochondriaal energiemetabolisme van enkelvoudige 3D-microtissue-sferoïden met behulp van extracellulaire fluxanalyse

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Het vaststellen van 3-dimensionale sferoïden uit van de patiënt afgeleide tumormonsters en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...