Name: assessment of mitochondrial health in cancer-associated fibroblasts isolated from 3d multicellular lung tumor spheroids
Uploaded: 2022-10-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal SERB-Women Excellence Award Project, India (SB/WEA-02/2017) e dal SERB-Early Career Research Award Project, India (ECR/2017/000892) a DP. Gli autori, LA e SR riconoscono IIT Ropar e MHRD per le loro borse di ricerca. MK riconosce l'ICMR per la sua borsa di ricerca.

1. Coltura cellulare
<ol><li>Linea cellulare di adenocarcinoma polmonare umano di coltura A549 e linea cellulare monocitica umana THP-1 in terreni RPMI1640 integrati con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina a 37 °C in camera umidificata con 5% di CO2.</li>
	<li>Coltura di cellule di fibroblasti polmonari umani MRC-5 in terreno DMEM integrato con soluzione di FBS al 10% e soluzione di penicillina-streptomicina all'1% a 37 °C in camera umidificata con CO2 al 5%.</li>
</ol><p cla...

<ol>
	<li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+demonstrates+the+molecular+and+cellular+reprogramming+of+metastatic+lung+adenocarcinoma.">Single-cell RNA sequencing demonstrates the molecular and cellular reprogramming of metastatic lung adenocarcinoma.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-5 (2020).</li><li>Davidson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+reveals+a+dynamic+stromal+niche+that+supports+tumor+growth.">Single-cell RNA sequencing reveals a dynamic stromal niche that supports tumor growth.</a> Cell Reports. 31 (7), 107628 (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analyses+of+renal+cell+cancers+reveal+insights+into+tumor+microenvironment,+cell+of+origin,+and+therapy+response.">Single-cell analyses of renal cell cancers reveal insights into tumor microenvironment, cell of origin, and therapy response.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (24), (2021).</li><li>Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+patient+specificity+in+the+engineering+of+tumor+models.">Addressing patient specificity in the engineering of tumor models.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217 (2019).</li><li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method.">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Tissue Engineering. , 141-151 (2007).</li><li>Dituri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+tumor+spheroid+formation+and+one-step+cancer-associated+fibroblasts+purification+from+hepatocellular+carcinoma+tissue+promoted+by+inorganic+surface+topography.">Complex tumor spheroid formation and one-step cancer-associated fibroblasts purification from hepatocellular carcinoma tissue promoted by inorganic surface topography.</a> Nanomaterials. 11 (12), 3233 (2021).</li><li>Arora, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multicellular+3D+tumor+model+to+study+cellular+heterogeneity+and+plasticity+in+NSCLC+tumor+microenvironment.">Development of a multicellular 3D tumor model to study cellular heterogeneity and plasticity in NSCLC tumor microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 12, 881207 (2022).</li><li>Nurmik, M., Ullmann, P., Rodriguez, F., Haan, S., Letellier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+search+of+definitions:+Cancer-associated+fibroblasts+and+their+markers.">In search of definitions: Cancer-associated fibroblasts and their markers.</a> International Journal of Cancer. 146 (4), 895-905 (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1&#945;+is+necessary+for+activation+and+tumour-promotion+effect+of+cancer-associated+fibroblasts+in+lung+cancer.">HIF-1&#945; is necessary for activation and tumour-promotion effect of cancer-associated fibroblasts in lung cancer.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (12), 5457-5469 (2021).</li><li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+heterogeneity+and+versatility+of+cancer-associated+fibroblasts+in+the+tumor+microenvironment.">Biological heterogeneity and versatility of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment.</a> Oncogene. 38 (25), 4887-4901 (2019).</li><li>Whitaker-Menezes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+stromal-epithelial+&amp;#34;lactate+shuttle&amp;#34;+in+human+tumors:+MCT4+is+a+marker+of+oxidative+stress+in+cancer-associated+fibroblasts.">Evidence for a stromal-epithelial &amp;#34;lactate shuttle&amp;#34; in human tumors: MCT4 is a marker of oxidative stress in cancer-associated fibroblasts.</a> Cell cycle. 10 (11), 1772-1783 (2011).</li><li>Mandujano-Tinoco, E. A., Gallardo-P&#233;rez, J. C., Mar&#237;n-Hern&#225;ndez, A., Moreno-S&#225;nchez, R., Rodr&#237;guez-Enr&#237;quez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-mitochondrial+therapy+in+human+breast+cancer+multi-cellular+spheroids.">Anti-mitochondrial therapy in human breast cancer multi-cellular spheroids.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1833 (3), 541-551 (2013).</li><li>Bregman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology. , (2002).</li><li>Berry, E. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+hemes+a,+b,+and+c+from+pyridine+hemochrome+spectra.">Simultaneous determination of hemes a, b, and c from pyridine hemochrome spectra.</a> Analytical Biochemistry. 161 (1), 1-15 (1987).</li><li>Avagliano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+cancer+associated+fibroblasts:+the+slavery+of+stromal+fibroblasts.">Metabolic reprogramming of cancer associated fibroblasts: the slavery of stromal fibroblasts.</a> BioMed Research International. , (2018).</li><li>Lorusso, G., R&#252;egg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+and+its+contribution+to+tumor+evolution+toward+metastasis.">The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).</li><li>Liu, T., Zhou, L., Li, D., Andl, T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+build+and+secure+the+tumor+microenvironment.">Cancer-associated fibroblasts build and secure the tumor microenvironment.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 60 (2019).</li><li>Sebastian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+analysis+of+tumor-derived+fibroblasts+and+normal+tissue-resident+fibroblasts+reveals+fibroblast+heterogeneity+in+breast+cancer.">Single-cell transcriptomic analysis of tumor-derived fibroblasts and normal tissue-resident fibroblasts reveals fibroblast heterogeneity in breast cancer.</a> Cancers. 12 (5), 1307 (2020).</li><li>Elyada, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+single-cell+analysis+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+reveals+antigen-presenting+cancer-associated+fibroblasts.">Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts.</a> Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).</li><li>Ganguly, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts:+Versatile+players+in+the+tumor+microenvironment.">Cancer-associated fibroblasts: Versatile players in the tumor microenvironment.</a> Cancers. 12 (9), 2652 (2020).</li><li>Harryvan, T. J., Verdegaal, E. M., Hardwick, J. C., Hawinkels, L. J., vander Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+the+cancer-associated+fibroblast-T-cell+axis+in+solid+malignancies.">Targeting of the cancer-associated fibroblast-T-cell axis in solid malignancies.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1989 (2019).</li><li>Santi, A., Kugeratski, F. G., Zanivan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts:+the+architects+of+stroma+remodeling.">Cancer associated fibroblasts: the architects of stroma remodeling.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700167 (2018).</li></ol>

Il presente studio introduce lo sviluppo di sferoidi tumorali multicellulari comprendenti cellule tumorali, popolazione di cellule stromali (cioè fibroblasti) e popolazione di cellule immunitarie (cioè monociti) utilizzando un metodo di goccia sospesa modificata. I fibroblasti e i monociti/macrofagi sono tra le popolazioni più significative che costituiscono il microambiente tumorale (TME) e la loro presenza è spesso correlata a una prognosi infausta16. Quando presenti nella TME, i fibroblasti...

I tumori solidi sono composti da popolazioni cellulari eterogenee che sono guidate dal microambiente tumorale (TME), tuttavia, l'origine della maggior parte delle cellule deve ancora essere scoperta. Principalmente le cellule stromali e immunitarie (fibroblasti, cellule endoteliali, monociti, macrofagi, cellule dendritiche, cellule B, cellule T e loro sottogruppi) riflettono l'eterogeneità tumorale nei tumori polmonari, mammari, renali e altri tumori solidi 1,2,3. Comprendere l'origine di ciascun sottotipo e il loro potenziale di trans-differenziazione è della massima necessità per lo sviluppo di terapie avanzate contro questi tumori. L'analisi di questa variegata popolazione cellulare nelle biopsie umane presenta diverse sfide a causa del tipo di tumore, del sito, dello stadio, della limitazione della quantità del campione e delle variabilità specifiche del paziente4. Pertanto, è necessario un modello sperimentale, che non sia solo affidabile, ma possa anche simulare la condizione tumorale in vivo, dimostrandosi ideale per lo studio della diafonia tumore-stroma e il suo coinvolgimento nella fisiopatologia della malattia.
Le colture tridimensionali (3D) di sferoidi tumorali multicellulari (MCTS) sono un sistema modello in vitro vantaggioso di tumori a causa della loro somiglianza con le controparti naturali. MCTS può replicare meglio gli aspetti dei tumori solidi rispetto ai modelli di coltura cellulare 2D, compresa la loro architettura spaziale, le risposte fisiologiche, il rilascio di mediatori solubili, i modelli di espressione genica e i meccanismi di resistenza ai farmaci. Inoltre, uno dei principali vantaggi della MCTS è che può essere utilizzato per studiare l'eterogeneità tumorale e il microambiente tumorale (TME). Il metodo hanging-drop è lo strumento più comunemente impiegato per lo sviluppo e l'analisi di MCTS5. In questo metodo, le diverse cellule con i media sono sospese sotto forma di goccioline, il che consente la sua crescita in modo coerente aggregato 3D ed è semplice da accedere per l'esame. La tecnica è semplice; Non richiede molte cellule ed elimina la necessità di un substrato specializzato come l'agarosio per lo sviluppo di sferoidi6. Un ulteriore vantaggio di questo metodo risiede nella riproducibilità della sua tecnica. Inoltre, questo metodo è stato utilizzato anche per co-coltivare popolazioni cellulari miste, come cellule endoteliali e cellule tumorali, per simulare l'angiogenesi tumorale precoce7.
In questo studio, sferoidi tumorali polmonari 3D multicellulari sono stati preparati con cellule di adenocarcinoma polmonare, fibroblasti e monociti utilizzando il metodo della goccia sospesa che imita il microambiente del tumore polmonare. Quindi la popolazione di fibroblasti associati al cancro (CAF) è stata isolata per studiare la salute mitocondriale. L'idea principale alla base dello sviluppo di questi sferoidi è quella di isolare i CAF poiché la diafonia tra le cellule negli sferoidi potrebbe trasformare i fibroblasti in uno stato CAF attivato simile ai miofibroblasti. In secondo luogo, questo studio può anche descrivere come la produzione aberrante di ROS e la disfunzione mitocondriale spingano i fibroblasti normali verso il fenotipo CAF più aggressivo. È stato scoperto che i fibroblasti assemblati all'interno degli sferoidi tumorali hanno acquisito caratteristiche miofibroblastiche con una maggiore attività ROS e l'induzione dell'espressione genica metabolica. Questo protocollo evidenzia l'importanza del microambiente tumorale nell'attivazione della CAF e potrebbe essere un ottimo modello per la generazione in vitro e lo studio delle caratteristiche fenotipiche della CAF.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human &#945;-SMA</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>Cat# IC1420A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fibroblast microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-050-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549 lung adenocarcinoma cells</td>
			<td>NCCS Pune</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC-5 fetal lung fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 Human monocytes</td>
			<td>NCCS Pune</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>Cat# 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,6-dichloroindophenol (DCPIP)</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 55287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# C3099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCFDA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# D6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>Cat# 17892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 62858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZcoun Lactate Dehydrogenase Cell Assay Kit</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>Cat# CCK036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 87786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse heart Cytochrome c</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 81551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-iT Red hypoxia reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# H10498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# T3168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 69824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nacl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH MB Grade</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 54941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 85124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenazine methosulfate (PMS)</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 55782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>Cat# P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Cell Lysis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 4458235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# A7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# 205222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 89904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate hexahydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 36313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO cDNA synthesis kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11754-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Cat# 172-5124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL core imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Serial Number F0518-1727-0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica fluorescent inverted microscope</td>
			<td>s</td>
			<td>DMi8 automated S/N 424150)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi MACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of mitochondrial health in cancer-associated fibroblasts isolated from 3d multicellular lung tumor spheroids

I fibroblasti associati al cancro (CAF) sono tra le cellule stromali più abbondanti presenti nel microambiente tumorale, facilitando la crescita e la progressione del tumore. La complessità all'interno del microambiente tumorale, tra cui secretoma tumorale, infiammazione di basso grado, ipossia e squilibrio redox, favorisce l'interazione eterotipica e consente la trasformazione dei fibroblasti residenti inattivi per diventare CAF attivi. I CAF sono metabolicamente distinti dai fibroblasti normali (NF) in quanto sono più glicoliticamente attivi, producono livelli più elevati di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e sovraesprimono l'esportatore di lattato MCT-4, portando all'apertura del poro di transizione della permeabilità mitocondriale (MPTP). Qui è stato descritto un metodo per analizzare la salute mitocondriale di CAF attivati isolati dagli sferoidi tumorali 3D multicellulari comprendenti cellule di adenocarcinoma polmonare umano (A549), monociti umani (THP-1) e cellule di fibroblasti polmonari umani (MRC5). Gli sferoidi tumorali sono stati disintegrati a diversi intervalli di tempo e attraverso la selezione cellulare attivata magneticamente, i CAF sono stati isolati. Il potenziale di membrana mitocondriale dei CAF è stato valutato utilizzando il colorante JC-1, la produzione di ROS mediante colorazione con 2',7'-diclorodiidrofluoresceina diacetato (DCFDA) e l'attività enzimatica nei CAF isolati. L'analisi della salute mitocondriale dei CAF isolati fornisce una migliore comprensione dell'effetto Warburg inverso e può anche essere applicata per studiare le conseguenze dei cambiamenti mitocondriali della CAF, come i flussi metabolici e i corrispondenti meccanismi regolatori sull'eterogeneità del cancro del polmone. Pertanto, il presente studio sostiene una comprensione delle interazioni tumore-stroma sulla salute mitocondriale. Fornirebbe una piattaforma per verificare i candidati farmaci mitocondriali specifici per la loro efficacia contro i CAF come potenziali terapie nel microambiente tumorale, prevenendo così il coinvolgimento del CAF nella progressione del cancro del polmone.

La Figura 1 mostra lo sviluppo di sferoidi tumorali multicellulari utilizzando tre diverse popolazioni cellulari - A549 (adenocarcinoma polmonare), MRC-5 (fibroblasti) e THP-1 (monociti) - con il metodo della goccia sospesa come osservato il giorno 7 e il giorno 10 al microscopio. Il giorno 7, gli sferoidi erano compatti e rigidi con un diametro di 260 ± 5,3 μm, e il giorno 10, gli sferoidi avevano un diametro di 480 ± 7,5 μm (Figura 1A pannello superiore,<s...

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Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

Gli sferoidi tumorali 3D multicellulari sono stati preparati con cellule di adenocarcinoma polmonare, fibroblasti e monociti, seguiti dall'isolamento dei fibroblasti associati al cancro (CAF) da questi sferoidi. I CAF isolati sono stati confrontati con fibroblasti normali per valutare la salute mitocondriale studiando il potenziale transmembrana mitocondriale, le specie reattive dell'ossigeno e le attività enzimatiche.

Valutazione della salute mitocondriale nei fibroblasti associati al cancro isolati da sferoidi tumorali polmonari multicellulari 3D

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

Questo protocollo evidenzia l'importanza del microambiente tumorale nell'attivazione dei fibroblasti associati al cancro o CAF. Potrebbe essere un ottimo modello in vitro per studiare le caratteristiche fenotipiche. I principali vincoli nella biologia della CAF risiedono nella limitata disponibilità di CAF da campioni primari di biopsia tumorale.Quindi questa tecnica può essere utilizzata per studiare vari aspetti della biologia CAF. Questo studio descrive la produzione crociata aberrante e la disfunzione mitocondriale associata all'attivazione della CAF che porta a una prognosi tumorale sfavorevole. L'applicazione di questo metodo sarebbe utile per valutare le interazioni traumatiche del tumore, in particolare l'attivazione della CAF e la salute mitocondriale.Al fine di esplorare i nuovi bersagli farmacologici. Gli individui devono avere esperienza nella procedura cellulare prima di eseguire questa tecnica. La dimostrazione visiva di questa tecnica permetterà di comprendere i passaggi critici nell'isolamento della popolazione CAF dagli sferoidi tumorali e le applicazioni a valle per studiare la biologia della CAF.La signorina Leena Arora, la signorina Moyna Kalia e la signora Soumyajit Roy, assistenti del mio laboratorio, eseguono gli esperimenti. Per iniziare a crescere l'adenocarcinoma polmonare umano A549 e le cellule aderenti MRC-5 dei fibroblasti polmonari umani in cellule DMEM e monociti umani THP-1 in RPMI completano il terreno di crescita in palloni T25 a 37 gradi Celsius in una camera umidificata con il 5% di anidride carbonica.Dopo tre giorni, alla confluenza cellulare dall'80 all'85%, lavare le cellule A549 e MRC-5 con un millilitro di PBS per un minuto. Successivamente, raccogliere le cellule incubandole con 500 microlitri di soluzione di tripsina EDTA allo 0,25% per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, aggiungere immediatamente quattro millilitri di terreno di crescita completo per inattivare la tripsina.Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri e pellettarla a 125 x g per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in un mezzo di crescita completo da cinque millilitri. Per stabilire sferoidi tumorali multicellulari, contare i numeri di cellule A549, MRC-5 e THP-1 utilizzando un contatore di cellule per un millilitro di volume.Dopo il conteggio, preparare la sospensione cellulare in un rapporto di 5: 4: 1 e aumentare il volume a un millilitro con DMEM completo. Quindi, posizionare una goccia di 25 microlitri di miscela di sospensione cellulare sul coperchio di un piatto di coltura da 90 millimetri. Riempire il fondo del piatto con 10 millilitri di acqua sterile.Capovolgere con attenzione il coperchio sopra la camera di idratazione piena d'acqua e posizionare il piatto in un incubatore di coltura cellulare per tre giorni. Il quarto giorno, monitorare gli sferoidi al microscopio. Per acquisire immagini, accendere l'interruttore di alimentazione.Posiziona il piatto di coltura da 90 millimetri sul palco e seleziona l'ingrandimento 10x. Regolare le lenti ed esaminare le cellule per analizzare l'aggregazione e la proliferazione cellulare. Premere i pulsanti di blocco e salvataggio forniti per acquisire l'immagine.Dopo l'imaging, sostituire il terreno di coltura aspirando con cura 20 microlitri di terreno da ciascuna goccia con un mezzo fresco. Per l'imaging live-dead, accendere Ctr advanced, che è switch one, quindi la CPU e attendere l'avvio del sistema software. Una volta avviato, posizionare il piatto da 90 millimetri contenente sferoidi sullo stadio del microscopio fluorescente invertito.Quindi osservare e acquisire immagini con ingrandimento 10x selezionando l'opzione di fluorescenza nel software e selezionando il FITC per il canale calceina e Texas Red. Quindi, seleziona l'opzione, vivi e visualizza l'immagine. Regolare l'intensità della fluorescenza per un'ottimizzazione appropriata e fare clic sul pulsante sicuro.Raccogliere 200 tumori, sferoidi ciascuno il settimo e il 10 giorno usando una pipetta da un millilitro e un tubo da 15 millilitri. Quindi pellettare gli sferoidi mediante centrifugazione a 125 x g per cinque minuti e aspirare accuratamente il surnatante. Lavare gli sferoidi con 200 microlitri di PBS, centrifugare nuovamente e scartare il surnatante.Aggiungere 400 microlitri di soluzione EDTA di tripsina allo 0,25% per la disintegrazione degli sferoidi e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Eseguire un pipettaggio vigoroso per la completa disintegrazione degli sferoidi. Neutralizzare la tripsina aggiungendo un millilitro di terreno di crescita DMEM completo.Quindi centrifugare la sospensione sferoidale e scartare il surnatante prima di risospendere il pellet in un millilitro di mezzo DMEM completo. Contare il numero totale di celle come dimostrato. Per l'isolamento dei fibroblasti associati al cancro o CAF dagli sferoidi tumorali, risospendere 1 x 10 alle cellule settima in 80 microlitri di selezione delle cellule attivate magneticamente a freddo o tampone MACS.Aggiungere 20 microlitri di microsfere anti-fibroblasti nella sospensione cellulare, mescolare bene picchiettando delicatamente il tubo e incubandolo a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo l'incubazione, lavare le cellule con un millilitro di tampone MACS freddo. Quindi centrifugare e aspirare il surnatante prima di risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone MACS.Per la separazione delle cellule basata su sfere magnetiche, preparare la colonna MACS risciacquandola con tre millilitri di tampone MACS. Posizionare la sospensione cellulare nella colonna e raccogliere il flusso attraverso il contenimento della popolazione cellulare non etichettata. Quindi, lavare la colonna tre volte con tre millilitri di tampone MACS prima di rimuoverla dal separatore.Quindi posizionare la colonna sul tubo di raccolta. Raccogliere le cellule marcate con microsfere anti-fibroblasti aggiungendo cinque millilitri di tampone MACS e spingendo saldamente lo stantuffo nella colonna. Centrifugare le celle etichettate prima di procedere per le applicazioni a valle.Contare il numero di CAF isolati e utilizzare circa 6 x 10 alle quarte cellule per l'analisi della citometria a flusso. Lavare le cellule una volta con PBS, quindi centrifugare e aspirare il surnatante. Quindi, aggiungere 100 microlitri di tampone di permeabilizzazione cellulare e incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 30 minuti con vortice intermittente per mantenere una sospensione a singola cella.Ancora una volta, dopo la centrifugazione e la sospensione delle cellule nel tampone di permeabilizzazione, aggiungere due microlitri di anticorpo alfa SMA anti-umano coniugato APC e incubare a quattro gradi Celsius per 45 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di tampone di permeabilizzazione e centrifugare per rimuovere l'anticorpo in eccesso. Risospendere il pellet in 400 microlitri di tampone di permeabilizzazione per citometria a flusso.Selezionare le cellule ACTA2 positive dopo aver distinto le popolazioni di cellule in base alla loro dispersione diretta e laterale. Selezione della popolazione di singoletto seguita dalla selezione delle cellule ACTA2 positive che appaiono come un singolo picco sull'istogramma a singolo parametro. Lo sviluppo di sferoidi tumorali multicellulari e l'analisi dei morti vivi sono mostrati qui.Il settimo giorno, gli sferoidi erano compatti e rigidi con un diametro di circa 260 micron. Il giorno 10, gli sferoidi avevano un diametro di 480 micron. Nel test di vitalità cellulare, è stata osservata una diminuzione della fluorescenza dello ioduro di propidio e un aumento della fluorescenza della calceina-AM dal settimo al giorno 10.La colorazione ipossica ha rivelato un nucleo ipossico al centro del giorno 10 sferoidi. Inoltre, è stata osservata una sovraregolazione dell'espressione genica E-caderina e Mki-67 con l'aumento dei giorni di formazione di sferoidi tumorali. I CAF isolati dagli sferoidi tumorali del giorno 10 erano circa il 69% positivi all'ACTA2.I CAF hanno mostrato una sovraregolazione triplicata in ACTA2 e dieci volte nella catena del collagene di tipo 1 alfa 2 rispetto ai fibroblasti MRC-5. È stato osservato un aumento significativo dei livelli di ROS negli sferoidi tumorali del giorno 10 rispetto al settimo giorno, suggerendo il possibile coinvolgimento della generazione di ROS nell'attivazione della CAF. È stato osservato un aumento significativo dei livelli cellulari di ROS nei CAF, isolati dagli sferoidi tumorali del settimo e del giorno 10.Inoltre, un'alterazione del potenziale della membrana mitocondriale è stata osservata dalla colorazione di JC-1. Un'induzione dell'espressione genica GLUT1 e MCT4 è stata osservata nei CAF rispetto ai fibroblasti normali. Nei CAF è stata osservata una significativa induzione della lattato deidrogenasi, della citocromo C ossidasi e dell'attività enzimatica della succinato deidrogenasi rispetto ai fibroblasti normali.Un rapporto di 5: 4: 1 di cellule A549, MRC-5 e THP-1 deve essere utilizzato per lo sviluppo di successo dello sferoide tumorale multicellulare 3D. La popolazione di fibroblasti è fondamentale per la rigidità degli sferoidi tumorali. Simile alla soluzione cationica e alla caratterizzazione, si può anche usare questo sferoide tumorale per ottenere la popolazione di cellule macrofagiche associate al tumore, che è complice nella progressione del tumore.Questa analisi sferoidale ci aiuterebbe a capire come le cellule cancerose incrociate dei fibroblasti sono coinvolte nell'attivazione dei CAF e può anche essere utilizzata per controllare i candidati farmaci specifici mitocondriali.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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