Name: assessment of mitochondrial health in cancer-associated fibroblasts isolated from 3d multicellular lung tumor spheroids
Uploaded: 2022-10-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av SERB-Women Excellence Award Project, India (SB / WEA-02/2017) og SERB-Early Career Research Award Project, India (ECR / 2017 / 000892) til DP. Forfatterne, LA og SR anerkjenner IIT Ropar og MHRD for sine stipendiatstillinger. MK anerkjenner ICMR for sin stipendiatstilling.

1. Cellekultur
<ol><li>Kultur humant lungeadenokarsinom cellelinje A549, og human monocytisk cellelinje THP-1 i RPMI1640-medier supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C i et fuktet kammer med 5% CO2.</li>
	<li>Kultur MRC-5 humane lungefibroblastceller i DMEM-medium supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycinoppløsning ved 37 ° C i et fuktet kammer med 5% CO2.</li>
</ol>2. Fremstilling av flercellede tumorsfæroider ved b...

<ol>
	<li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+demonstrates+the+molecular+and+cellular+reprogramming+of+metastatic+lung+adenocarcinoma.">Single-cell RNA sequencing demonstrates the molecular and cellular reprogramming of metastatic lung adenocarcinoma.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-5 (2020).</li><li>Davidson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+reveals+a+dynamic+stromal+niche+that+supports+tumor+growth.">Single-cell RNA sequencing reveals a dynamic stromal niche that supports tumor growth.</a> Cell Reports. 31 (7), 107628 (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analyses+of+renal+cell+cancers+reveal+insights+into+tumor+microenvironment,+cell+of+origin,+and+therapy+response.">Single-cell analyses of renal cell cancers reveal insights into tumor microenvironment, cell of origin, and therapy response.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (24), (2021).</li><li>Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+patient+specificity+in+the+engineering+of+tumor+models.">Addressing patient specificity in the engineering of tumor models.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217 (2019).</li><li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method.">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Tissue Engineering. , 141-151 (2007).</li><li>Dituri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+tumor+spheroid+formation+and+one-step+cancer-associated+fibroblasts+purification+from+hepatocellular+carcinoma+tissue+promoted+by+inorganic+surface+topography.">Complex tumor spheroid formation and one-step cancer-associated fibroblasts purification from hepatocellular carcinoma tissue promoted by inorganic surface topography.</a> Nanomaterials. 11 (12), 3233 (2021).</li><li>Arora, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multicellular+3D+tumor+model+to+study+cellular+heterogeneity+and+plasticity+in+NSCLC+tumor+microenvironment.">Development of a multicellular 3D tumor model to study cellular heterogeneity and plasticity in NSCLC tumor microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 12, 881207 (2022).</li><li>Nurmik, M., Ullmann, P., Rodriguez, F., Haan, S., Letellier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+search+of+definitions:+Cancer-associated+fibroblasts+and+their+markers.">In search of definitions: Cancer-associated fibroblasts and their markers.</a> International Journal of Cancer. 146 (4), 895-905 (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1&#945;+is+necessary+for+activation+and+tumour-promotion+effect+of+cancer-associated+fibroblasts+in+lung+cancer.">HIF-1&#945; is necessary for activation and tumour-promotion effect of cancer-associated fibroblasts in lung cancer.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (12), 5457-5469 (2021).</li><li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+heterogeneity+and+versatility+of+cancer-associated+fibroblasts+in+the+tumor+microenvironment.">Biological heterogeneity and versatility of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment.</a> Oncogene. 38 (25), 4887-4901 (2019).</li><li>Whitaker-Menezes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+stromal-epithelial+&amp;#34;lactate+shuttle&amp;#34;+in+human+tumors:+MCT4+is+a+marker+of+oxidative+stress+in+cancer-associated+fibroblasts.">Evidence for a stromal-epithelial &amp;#34;lactate shuttle&amp;#34; in human tumors: MCT4 is a marker of oxidative stress in cancer-associated fibroblasts.</a> Cell cycle. 10 (11), 1772-1783 (2011).</li><li>Mandujano-Tinoco, E. A., Gallardo-P&#233;rez, J. C., Mar&#237;n-Hern&#225;ndez, A., Moreno-S&#225;nchez, R., Rodr&#237;guez-Enr&#237;quez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-mitochondrial+therapy+in+human+breast+cancer+multi-cellular+spheroids.">Anti-mitochondrial therapy in human breast cancer multi-cellular spheroids.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1833 (3), 541-551 (2013).</li><li>Bregman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology. , (2002).</li><li>Berry, E. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+hemes+a,+b,+and+c+from+pyridine+hemochrome+spectra.">Simultaneous determination of hemes a, b, and c from pyridine hemochrome spectra.</a> Analytical Biochemistry. 161 (1), 1-15 (1987).</li><li>Avagliano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+cancer+associated+fibroblasts:+the+slavery+of+stromal+fibroblasts.">Metabolic reprogramming of cancer associated fibroblasts: the slavery of stromal fibroblasts.</a> BioMed Research International. , (2018).</li><li>Lorusso, G., R&#252;egg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+and+its+contribution+to+tumor+evolution+toward+metastasis.">The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).</li><li>Liu, T., Zhou, L., Li, D., Andl, T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+build+and+secure+the+tumor+microenvironment.">Cancer-associated fibroblasts build and secure the tumor microenvironment.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 60 (2019).</li><li>Sebastian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+analysis+of+tumor-derived+fibroblasts+and+normal+tissue-resident+fibroblasts+reveals+fibroblast+heterogeneity+in+breast+cancer.">Single-cell transcriptomic analysis of tumor-derived fibroblasts and normal tissue-resident fibroblasts reveals fibroblast heterogeneity in breast cancer.</a> Cancers. 12 (5), 1307 (2020).</li><li>Elyada, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+single-cell+analysis+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+reveals+antigen-presenting+cancer-associated+fibroblasts.">Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts.</a> Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).</li><li>Ganguly, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts:+Versatile+players+in+the+tumor+microenvironment.">Cancer-associated fibroblasts: Versatile players in the tumor microenvironment.</a> Cancers. 12 (9), 2652 (2020).</li><li>Harryvan, T. J., Verdegaal, E. M., Hardwick, J. C., Hawinkels, L. J., vander Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+the+cancer-associated+fibroblast-T-cell+axis+in+solid+malignancies.">Targeting of the cancer-associated fibroblast-T-cell axis in solid malignancies.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1989 (2019).</li><li>Santi, A., Kugeratski, F. G., Zanivan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts:+the+architects+of+stroma+remodeling.">Cancer associated fibroblasts: the architects of stroma remodeling.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700167 (2018).</li></ol>

Denne studien introduserer utviklingen av flercellede tumorsfæroider som består av tumorceller, stromalcellepopulasjon (dvs. fibroblaster) og immuncellepopulasjon (dvs. monocytter) ved hjelp av en modifisert hengende dråpemetode. Fibroblaster og monocytter/makrofager er blant de viktigste populasjonene som utgjør tumormikromiljøet (TME), og deres tilstedeværelse er ofte knyttet til dårlig pasientprognose16. Når de er tilstede i TME, forvandles fibroblaster, og viser en spesifikk kreftassos...

Solide svulster består av heterogene cellepopulasjoner som styres av tumormikromiljøet (TME), men opprinnelsen til de fleste cellene er ennå ikke oppdaget. Hovedsakelig stromale og immunceller (fibroblaster, endotelceller, monocytter, makrofager, dendrittiske celler, B-celler, T-celler og deres undergrupper) reflekterer tumor heterogeniteten i lunge-, bryst-, nyre- og andre faste kreftformer 1,2,3. Å forstå opprinnelsen til hver subtype og deres transdifferensieringspotensial er av største behov for å utvikle avanserte terapier mot disse kreftformene. Analysen av denne mangfoldige cellepopulasjonen i humane biopsier presenterer seg med flere utfordringer på grunn av tumortype, sted, stadium, begrensning av prøvemengde og pasientspesifikke variabiliteter4. Dermed er det nødvendig med en eksperimentell modell, som ikke bare er pålitelig, men som også kan simulere in vivo tumortilstanden, og viser seg å være ideell for å studere tumor-stroma crosstalk og dens involvering i sykdomspatofysiologi.
Tredimensjonale (3D) flercellede tumorsfæroidkulturer (MCTS) er et fordelaktig in vitro-modellsystem av svulster på grunn av deres likhet med naturlige kolleger. MCTS kan bedre replikere aspekter av solide svulster enn 2D-cellekulturmodeller, inkludert deres romlige arkitektur, fysiologiske responser, frigjøring av løselige mediatorer, genuttrykksmønstre og stoffresistensmekanismer. Videre er en stor fordel med MCTS at den kan brukes til å studere tumor heterogenitet og tumormikromiljøet (TME). Hanging-drop-metoden er det mest brukte verktøyet for å utvikle og analysere MCTS5. I denne metoden suspenderes de forskjellige cellene med media i form av dråper, noe som gjør det mulig å vokse på en sammenhengende 3D-samlet måte og er enkel å få tilgang til for undersøkelse. Teknikken er grei; Det krever ikke mange celler og eliminerer kravet til et spesialisert substrat som agarose for sfæroidutvikling6. En ekstra fordel med denne metoden ligger i reproduserbarheten av teknikken. Videre har denne metoden også blitt brukt til å co-kultur blandede cellepopulasjoner, som endotelceller og tumorceller, for å simulere tidlig tumorangiogenese7.
I denne studien ble flercellede 3D lungesvulstsfæroider fremstilt med lungeadenokarsinomceller, fibroblaster og monocytter ved hjelp av hengende dråpemetoden som etterligner lungetumormikromiljøet. Deretter ble den kreftassosierte fibroblastpopulasjonen (CAF) isolert for å undersøke mitokondriell helse. Hovedideen bak utviklingen av disse sfæroidene er å isolere CAF-ene, da krysstalen mellom cellene i sfæroider kan forvandle fibroblastene til en myo-fibroblast-lignende aktivert CAF-tilstand. For det andre kan denne studien også skildre hvordan avvikende ROS-produksjon og mitokondriell dysfunksjon driver de normale fibroblaster mot den mer aggressive CAF-fenotypen. Det ble funnet at fibroblaster samlet i tumorsfæroider fikk myofibroblastiske egenskaper med økt ROS-aktivitet og induksjon av metabolsk genuttrykk. Denne protokollen fremhever viktigheten av tumormikromiljøet ved aktivering av CAF og kan være en utmerket modell for in vitro-generering og studier av CAF-fenotypiske egenskaper.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human &#945;-SMA</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>Cat# IC1420A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fibroblast microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-050-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549 lung adenocarcinoma cells</td>
			<td>NCCS Pune</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC-5 fetal lung fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 Human monocytes</td>
			<td>NCCS Pune</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>Cat# 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,6-dichloroindophenol (DCPIP)</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 55287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# C3099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCFDA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# D6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>Cat# 17892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 62858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZcoun Lactate Dehydrogenase Cell Assay Kit</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>Cat# CCK036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 87786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse heart Cytochrome c</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 81551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-iT Red hypoxia reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# H10498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# T3168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 69824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nacl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH MB Grade</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 54941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 85124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenazine methosulfate (PMS)</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 55782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>Cat# P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Cell Lysis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 4458235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# A7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# 205222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 89904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate hexahydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 36313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO cDNA synthesis kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11754-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Cat# 172-5124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL core imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Serial Number F0518-1727-0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica fluorescent inverted microscope</td>
			<td>s</td>
			<td>DMi8 automated S/N 424150)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi MACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of mitochondrial health in cancer-associated fibroblasts isolated from 3d multicellular lung tumor spheroids

Kreftassosierte fibroblaster (CAFs) er blant de mest tallrike stromale cellene som er tilstede i tumormikromiljøet, noe som letter tumorvekst og progresjon. Kompleksitet i tumormikromiljøet, inkludert tumorsekretome, lavgradig betennelse, hypoksi og redoks ubalanse, fremmer heterotypisk interaksjon og tillater transformasjon av inaktive bosatte fibroblaster å bli aktive CAFer. CAFer skilles metabolsk fra normale fibroblaster (NFs) da de er mer glykolytisk aktive, produserer høyere nivåer av reaktive oksygenarter (ROS) og overuttrykker laktateksportør MCT-4, noe som fører til åpningen av mitokondriell permeabilitetsovergangspore (MPTP). Her er det beskrevet en metode for å analysere mitokondriell helse av aktiverte CAFer isolert fra de flercellede 3D-tumorsfæroidene som består av humane lungeadenokarsinomceller (A549), humane monocytter (THP-1) og humane lungefibroblastceller (MRC5). Tumorsfæroider ble oppløst med forskjellige tidsintervaller, og gjennom magnetisk aktivert cellesortering ble CAF-er isolert. Det mitokondrielle membranpotensialet til CAFs ble vurdert ved bruk av JC-1 fargestoff, ROS-produksjon ved 2',7'-diklordihydrofluoresceindicetat (DCFDA) farging og enzymaktivitet i de isolerte CAF-ene. Analyse av mitokondriell helse av isolerte CAFer gir en bedre forståelse av den omvendte Warburg-effekten og kan også brukes til å studere konsekvensene av CAF mitokondrielle endringer, for eksempel metabolske flukser og tilsvarende reguleringsmekanismer på lungekreft heterogenitet. Dermed taler denne studien for en forståelse av tumor-stroma-interaksjoner på mitokondriell helse. Det ville gi en plattform for å sjekke mitokondrie-spesifikke legemiddelkandidater for deres effektivitet mot CAFs som potensielle terapier i tumormikromiljøet, og dermed forhindre CAF-involvering i lungekreftprogresjon.

Figur 1 viser utvikling av flercellede tumorsfæroider ved bruk av tre ulike cellepopulasjoner-A549 (lungeadenokarsinom), MRC-5 (fibroblaster) og THP-1 (monocytter)-ved hengende dråpe-metoden observert dag 7 og dag 10 under mikroskopet. På dag 7 var sfæroidene kompakte og stive med en diameter på 260 ± 5,3 μm, og på dag 10 var sfæroidene 480 ± 7,5 μm i diameter (figur 1A øvre panel, figur 1B-D). Dag 7 og ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids at JoVE.com

Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

Flercellede 3D-tumorsfæroider ble fremstilt med lungeadenokarsinomceller, fibroblaster og monocytter, etterfulgt av isolering av kreftassosierte fibroblaster (CAFer) fra disse sfæroidene. Isolerte CAFer ble sammenlignet med normale fibroblaster for å vurdere mitokondriell helse ved å studere mitokondrielt transmembranpotensial, reaktive oksygenarter og enzymatiske aktiviteter.

Vurdering av mitokondriell helse i kreftassosierte fibroblaster isolert fra 3D multicellulære lungetumorsfæroider

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

Denne protokollen fremhever viktigheten av tumormikromiljøet ved aktivering av kreftassosierte fibroblaster eller CAF. Det kan være utmerket in vitro-modell for å studere fenotypiske egenskaper. De viktigste begrensningene i CAF-biologi ligger i den begrensede tilgjengeligheten av CAF fra primære tumorbiopsiprøver.Så denne teknikken kan brukes til å studere ulike aspekter av CAF-biologi. Denne studien viser avvikende kryssproduksjon og mitokondriell dysfunksjon assosiert med CAF-aktivering som fører til dårlig tumorprognose. Anvendelsen av denne metoden vil være nyttig for å vurdere svulstens traumeinteraksjoner, spesielt CAF-aktivering og mitokondriell helse.For å utforske de nye narkotikamålene. Enkeltpersoner må ha erfaring i celleprosedyre før de utfører denne teknikken. Den visuelle demonstrasjonen av denne teknikken vil tillate forståelse av de kritiske trinnene i å isolere CAF-befolkningen fra tumorsfæroider og nedstrøms applikasjoner for å studere CAF-biologi.Miss Leena Arora, Miss Moyna Kalia, og fru Soumyajit Roy, assistenter av laboratoriet mitt utføre eksperimenter. For å begynne å vokse humant lungeadenokarsinom A549 og humant lungefibroblast MRC-5 adherent celler i DMEM og humane monocytter THP-1 celler i RPMI komplett vekstmedium i T25 kolber ved 37 grader Celsius i et fuktet kammer med 5% karbondioksid.Etter tre dager, ved 80 til 85% cellekonfluens, vask A549- og MRC-5-cellene med en milliliter PBS i ett minutt. Deretter høster cellene ved å inkubere dem med 500 mikroliter 0,25% trypsin EDTA-løsning i fem minutter ved 37 grader Celsius. Deretter legger du umiddelbart til fire milliliter komplett vekstmedium for å inaktivere trypsinet.Samle cellesuspensjonen i et 15 milliliter rør og pellet det ned på 125 x g i fem minutter. Fjern supernatanten og resuspend cellene i et fem milliliter komplett vekstmedium. For å etablere flercellede tumorsfæroider, telle A549, MRC-5 og THP-1 celletall ved hjelp av en celleteller for ett milliliter volum.Etter telling, klargjør cellesuspensjonen i forholdet 5: 4: 1 og gjør opp volumet til en milliliter med fullstendig DMEM. Legg deretter en dråpe 25 mikroliter cellesuspensjonsblanding på forsiden av en 90 millimeter kulturskål. Fyll bunnen av fatet med 10 ml sterilt vann.Snu lokket forsiktig over det vannfylte hydreringskammeret og legg parabolen i en cellekulturinkubator i tre dager. På dag fire, overvåke sfæroider under mikroskopet. For å skaffe bilder, slå på strømbryteren.Plasser 90 millimeter kulturskålen på scenen og velg 10 x forstørrelse. Juster linsene og undersøk cellene for å analysere celleaggregering og spredning. Trykk på fryse- og lagre-knappene for å ta bildet.Etter avbildning, erstatt vekstmediet ved forsiktig å aspirere 20 mikroliter medium fra hver dråpe med et nytt medium. For levende-død bildebehandling, slå på Ctr avansert, som er bryter en, deretter CPU og vent på at programvaresystemet skal starte opp. Når du starter opp, plasser 90 millimeter parabolen som inneholder sfæroider på scenen til det omvendte fluorescerende mikroskopet.Deretter observerer og tar du bilder med 10 x forstørrelse ved å velge fluorescensalternativet i programvaren og velge FITC for calcein og Texas Red-kanalen. Velg deretter alternativet, live og se bildet. Juster fluorescensintensiteten for passende optimalisering og klikk på den sikre knappen.Samle 200 svulster, sfæroider hver på dag syv og 10 ved hjelp av en milliliter pipette og en 15 milliliter rør. Pellets deretter sfæroidene ved sentrifugering ved 125 x g i fem minutter og aspirer supernatanten forsiktig. Vask sfæroidene med 200 mikroliter PBS, sentrifuger igjen og kast supernatanten.Tilsett 400 mikroliter 0,25% trypsin EDTA-løsning for sfæroidoppløsning og inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Utfør kraftig pipettering for fullstendig oppløsning av sfæroidene. Nøytraliser trypsinet ved å tilsette en milliliter komplett DMEM-vekstmedium.Sentrifuger deretter sfæroidsuspensjonen og kast supernatanten før du resuspenderer pelleten i en milliliter komplett DMEM-medium. Tell totalt antall celler som vist. For isolering av kreftassosierte fibroblaster eller CAFer fra tumorsfæroidene, resuspend 1 x 10 til de syvende cellene i 80 mikroliter kald magnetisk aktivert cellesortering eller MACS-buffer.Tilsett 20 mikroliter anti-fibroblast mikroperler i cellesuspensjonen, bland godt ved å forsiktig tappe røret og inkubere det ved romtemperatur i 30 minutter. Etter inkubasjon, vask cellene med en milliliter kald MACS-buffer. Sentrifuger og aspirer deretter supernatanten før du resuspenderer pelleten i 500 mikroliter MACS-buffer.For magnetisk perlebasert celleseparasjon, klargjør MACS-kolonnen ved å skylle den med tre milliliter MACS-buffer. Plasser cellesuspensjonen i kolonnen og samle strømmen som inneholder den umerkede cellepopulasjonen. Vask deretter kolonnen tre ganger med tre milliliter MACS-buffer før du fjerner den fra separatoren.Plasser deretter kolonnen på oppsamlingsrøret. Samle anti-fibroblast mikroperle merkede celler ved å legge til fem milliliter MACS-buffer og skyve stempelet fast inn i kolonnen. Sentrifuger de merkede cellene før du fortsetter for nedstrøms applikasjoner.Tell antall isolerte CAFer og bruk ca. 6 x 10 til fjerde celle for flowcytometrianalyse. Vask cellene en gang med PBS, sentrifuger deretter og aspirer supernatanten. Deretter tilsettes 100 mikroliter cellepermeabiliseringsbuffer og inkuberer cellene ved fire grader Celsius i 30 minutter med intermitterende vortexing for å opprettholde en enkeltcellesuspensjon.Igjen, etter sentrifugering og resuspendering av cellene i permeabiliseringsbuffer, tilsett to mikroliter APC-konjugert anti-humant alfa SMA-antistoff og inkuber ved fire grader Celsius i 45 minutter. Etter inkubasjon, tilsett en milliliter permeabiliseringsbuffer og sentrifuge for å fjerne overflødig antistoff. Resuspend pelleten i 400 mikroliter permeabiliseringsbuffer for flowcytometri.Velg ACTA2-positive celler etter å ha skilt populasjonene av celler basert på deres fremover- og sidespredning. Velge singletpopulasjonen etterfulgt av å velge ACTA2-positive celler som vises som en enkelt topp på enkeltparameterhistogrammet. Utviklingen av multicellulære tumorsfæroider og levende død analyse er vist her.På dag syv var sfæroider kompakte og stive med omtrent 260 mikron i diameter. På dag 10 var sfæroider 480 mikron i diameter. I celle levedyktighetsanalyse ble det observert en reduksjon i propidiumjodidfluorescens og en økning i kalcein-AM-fluorescens fra dag syv til dag 10.Hypoksisk farging viste en hypoksisk kjerne i midten av dagen 10 sfæroider. Videre ble det observert oppregulering av E-cadherin og Mki-67 genuttrykk med økning i dager med dannelse av tumorsfæroider. CAF isolert fra dag 10 tumorsfæroider var ca. 69 % ACTA2-positive.CAF-ene viste tredobling i ACTA2 og ti ganger i kollagen type 1 alfa 2-kjeden sammenlignet med MRC-5 fibroblaster. En signifikant økning i ROS-nivåer på dag 10 tumorsfæroider ble observert sammenlignet med dag syv, noe som tyder på mulig involvering av ROS-generasjon på CAF-aktivering. En signifikant økning ble observert i cellulære ROS-nivåer i CAFs, isolert fra dag syv og dag 10 tumorsfæroider.Videre ble en endring av mitokondriell membranpotensial sett ved JC-1-farging. En induksjon av GLUT1- og MCT4-genuttrykk ble observert i CAFs sammenlignet med normale fibroblaster. Signifikant induksjon av laktatdehydrogenase, cytokrom C-oksidase og succinatdehydrogenaseenzymaktivitet ble observert i CAF sammenlignet med normale fibroblaster.Et forhold på 5: 4: 1 av A549, MRC-5 og THP-1-celler må brukes til vellykket utvikling av 3D multicellulær tumorsfæroid. Fibroblastpopulasjonen er kritisk for stivheten til tumorsfæroidene. I likhet med kationløsning og karakterisering kan man også bruke denne tumorsfæroiden til å oppnå tumorassosiert makrofagcellepopulasjon, som er medskyldig i tumorprogresjon.Denne sfæroidanalysen vil hjelpe oss å forstå hvordan kreftceller krysset fibroblast er involvert i CAFs-aktiveringen, og kan også brukes til å sjekke mitokondrielle spesifikke legemiddelkandidater.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

Lunge svulst celle rekruttering analysen

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

I Vivo EPR vurdering av pH, pO2, Redox Status, og konsentrasjoner av fosfat og glutation i svulst Microenvironment

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Etablering av en lunge kolonisering analysen for sirkulerende svulst celle effekt i lunge vev

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

En 3D spheroid modell som en mer fysiologisk system for kreft-Associated fibroblaster differensiering og Invasion in vitro studier

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Etablering og karakterisering av små tarm Nevroendokrine tumor Spheroids

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Påvisning av lungetumorprogresjon hos mus ved ultralydavbildning

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

En musemodell for å undersøke rollen som kreftassosierte fibroblaster i tumorvekst

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Isolering av primærkreft-assosierte fibroblaster fra en syngeneisk murinemodell av brystkreft for studiet av målrettede nanopartikler

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Utforske mitokondriell energimetabolisme av enkelt 3D microtissue sfæroider ved hjelp av ekstracellulær fluksanalyse

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Etablering av 3-dimensjonale sfæroider fra pasientavledede tumorprøver og evaluering av deres følsomhet overfor legemidler

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...