Name: assessment of mitochondrial health in cancer-associated fibroblasts isolated from 3d multicellular lung tumor spheroids
Uploaded: 2022-10-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo SERB-Women Excellence Award Project, Índia (SB/WEA-02/2017) e pelo SERB-Early Career Research Award Project, Índia (ECR/2017/000892) para a DP. Os autores, LA e SR reconhecem o IIT Ropar e o MHRD por suas bolsas de pesquisa. MK reconhece o ICMR por sua bolsa de pesquisa.

1. Cultura celular
<ol><li>Cultura de adenocarcinoma pulmonar humano da linhagem celular A549 e linhagem celular monocítica humana THP-1 em meio RPMI1640 suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C em uma câmara umidificada com 5% de CO2.</li>
	<li>Cultura de células fibroblásticas pulmonares humanas MRC-5 em meio DMEM suplementadas com FBS a 10% e solução de penicilina-estreptomicina a 37 °C em câmara umidificada com CO2 a 5%.</li>
</ol><p class...

<ol>
	<li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+demonstrates+the+molecular+and+cellular+reprogramming+of+metastatic+lung+adenocarcinoma.">Single-cell RNA sequencing demonstrates the molecular and cellular reprogramming of metastatic lung adenocarcinoma.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-5 (2020).</li><li>Davidson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+reveals+a+dynamic+stromal+niche+that+supports+tumor+growth.">Single-cell RNA sequencing reveals a dynamic stromal niche that supports tumor growth.</a> Cell Reports. 31 (7), 107628 (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analyses+of+renal+cell+cancers+reveal+insights+into+tumor+microenvironment,+cell+of+origin,+and+therapy+response.">Single-cell analyses of renal cell cancers reveal insights into tumor microenvironment, cell of origin, and therapy response.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (24), (2021).</li><li>Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+patient+specificity+in+the+engineering+of+tumor+models.">Addressing patient specificity in the engineering of tumor models.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217 (2019).</li><li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method.">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Tissue Engineering. , 141-151 (2007).</li><li>Dituri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+tumor+spheroid+formation+and+one-step+cancer-associated+fibroblasts+purification+from+hepatocellular+carcinoma+tissue+promoted+by+inorganic+surface+topography.">Complex tumor spheroid formation and one-step cancer-associated fibroblasts purification from hepatocellular carcinoma tissue promoted by inorganic surface topography.</a> Nanomaterials. 11 (12), 3233 (2021).</li><li>Arora, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multicellular+3D+tumor+model+to+study+cellular+heterogeneity+and+plasticity+in+NSCLC+tumor+microenvironment.">Development of a multicellular 3D tumor model to study cellular heterogeneity and plasticity in NSCLC tumor microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 12, 881207 (2022).</li><li>Nurmik, M., Ullmann, P., Rodriguez, F., Haan, S., Letellier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+search+of+definitions:+Cancer-associated+fibroblasts+and+their+markers.">In search of definitions: Cancer-associated fibroblasts and their markers.</a> International Journal of Cancer. 146 (4), 895-905 (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1&#945;+is+necessary+for+activation+and+tumour-promotion+effect+of+cancer-associated+fibroblasts+in+lung+cancer.">HIF-1&#945; is necessary for activation and tumour-promotion effect of cancer-associated fibroblasts in lung cancer.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (12), 5457-5469 (2021).</li><li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+heterogeneity+and+versatility+of+cancer-associated+fibroblasts+in+the+tumor+microenvironment.">Biological heterogeneity and versatility of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment.</a> Oncogene. 38 (25), 4887-4901 (2019).</li><li>Whitaker-Menezes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+stromal-epithelial+&amp;#34;lactate+shuttle&amp;#34;+in+human+tumors:+MCT4+is+a+marker+of+oxidative+stress+in+cancer-associated+fibroblasts.">Evidence for a stromal-epithelial &amp;#34;lactate shuttle&amp;#34; in human tumors: MCT4 is a marker of oxidative stress in cancer-associated fibroblasts.</a> Cell cycle. 10 (11), 1772-1783 (2011).</li><li>Mandujano-Tinoco, E. A., Gallardo-P&#233;rez, J. C., Mar&#237;n-Hern&#225;ndez, A., Moreno-S&#225;nchez, R., Rodr&#237;guez-Enr&#237;quez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-mitochondrial+therapy+in+human+breast+cancer+multi-cellular+spheroids.">Anti-mitochondrial therapy in human breast cancer multi-cellular spheroids.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1833 (3), 541-551 (2013).</li><li>Bregman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology. , (2002).</li><li>Berry, E. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+hemes+a,+b,+and+c+from+pyridine+hemochrome+spectra.">Simultaneous determination of hemes a, b, and c from pyridine hemochrome spectra.</a> Analytical Biochemistry. 161 (1), 1-15 (1987).</li><li>Avagliano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+cancer+associated+fibroblasts:+the+slavery+of+stromal+fibroblasts.">Metabolic reprogramming of cancer associated fibroblasts: the slavery of stromal fibroblasts.</a> BioMed Research International. , (2018).</li><li>Lorusso, G., R&#252;egg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+and+its+contribution+to+tumor+evolution+toward+metastasis.">The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).</li><li>Liu, T., Zhou, L., Li, D., Andl, T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+build+and+secure+the+tumor+microenvironment.">Cancer-associated fibroblasts build and secure the tumor microenvironment.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 60 (2019).</li><li>Sebastian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+analysis+of+tumor-derived+fibroblasts+and+normal+tissue-resident+fibroblasts+reveals+fibroblast+heterogeneity+in+breast+cancer.">Single-cell transcriptomic analysis of tumor-derived fibroblasts and normal tissue-resident fibroblasts reveals fibroblast heterogeneity in breast cancer.</a> Cancers. 12 (5), 1307 (2020).</li><li>Elyada, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+single-cell+analysis+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+reveals+antigen-presenting+cancer-associated+fibroblasts.">Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts.</a> Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).</li><li>Ganguly, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts:+Versatile+players+in+the+tumor+microenvironment.">Cancer-associated fibroblasts: Versatile players in the tumor microenvironment.</a> Cancers. 12 (9), 2652 (2020).</li><li>Harryvan, T. J., Verdegaal, E. M., Hardwick, J. C., Hawinkels, L. J., vander Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+the+cancer-associated+fibroblast-T-cell+axis+in+solid+malignancies.">Targeting of the cancer-associated fibroblast-T-cell axis in solid malignancies.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1989 (2019).</li><li>Santi, A., Kugeratski, F. G., Zanivan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts:+the+architects+of+stroma+remodeling.">Cancer associated fibroblasts: the architects of stroma remodeling.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700167 (2018).</li></ol>

O presente estudo apresenta o desenvolvimento de esferoides tumorais multicelulares compreendendo células tumorais, população de células estromais (isto é, fibroblastos) e população de células imunes (ou seja, monócitos) usando um método modificado de gota suspensa. Fibroblastos e monócitos/macrófagos estão entre as populações mais significativas que constituem o microambiente tumoral (EMT), e sua presença está frequentemente ligada ao mau prognóstico do paciente16. Quando presen...

Os tumores sólidos são compostos por populações celulares heterogêneas que são guiadas pelo microambiente tumoral (EMT), no entanto, a origem da maioria das células ainda não foi descoberta. Principalmente células estromais e imunes (fibroblastos, células endoteliais, monócitos, macrófagos, células dendríticas, células B, células T e seus subconjuntos) refletem a heterogeneidade tumoral em câncer de pulmão, mama, renal e outros cânceres sólidos 1,2,3. Compreender a origem de cada subtipo e seu potencial de transdiferenciação é de extrema necessidade para o desenvolvimento de terapias avançadas contra esses tipos de câncer. A análise dessa população celular diversificada em biópsias humanas apresenta-se com diversos desafios devido ao tipo de tumor, localização, estágio, limitação da quantidade de amostra e variabilidades específicas do paciente4. Assim, é necessário um modelo experimental, que não seja apenas confiável, mas também possa simular a condição tumoral in vivo, mostrando-se ideal para o estudo do crosstalk tumor-estroma e seu envolvimento na fisiopatologia da doença.
As culturas tridimensionais (3D) de tumores multicelulares esferoides (MCTS) são um sistema modelo in vitro vantajoso de tumores devido à sua semelhança com contrapartes naturais. O MCTS pode replicar melhor aspectos de tumores sólidos do que os modelos de cultura de células 2D, incluindo sua arquitetura espacial, respostas fisiológicas, liberação de mediadores solúveis, padrões de expressão gênica e mecanismos de resistência a medicamentos. Além disso, uma das principais vantagens do MCTS é que ele pode ser usado para estudar a heterogeneidade tumoral e o microambiente tumoral (EMT). O método hanging-drop é a ferramenta mais comumente empregada para desenvolver e analisar o MCTS5. Neste método, as diferentes células com meios são suspensas na forma de gotículas, o que permite o seu crescimento de forma agregada 3D coerente e é de fácil acesso para exame. A técnica é simples; não requer muitas células e elimina a necessidade de um substrato especializado como a agarose para o desenvolvimento esferoide6. Uma vantagem adicional deste método reside na reprodutibilidade de sua técnica. Além disso, esse método também tem sido utilizado para co-cultivar populações de células mistas, como células endoteliais e células tumorais, para simular a angiogênese tumoral precoce7.
Neste estudo, esferoides de tumores pulmonares 3D multicelulares foram preparados com células de adenocarcinoma pulmonar, fibroblastos e monócitos usando o método de gota suspensa que imita o microambiente do tumor pulmonar. Em seguida, a população de fibroblastos associados ao câncer (CAF) foi isolada para investigar a saúde mitocondrial. A ideia principal por trás do desenvolvimento desses esferoides é isolar os CAFs, pois o crosstalk entre as células em esferoides poderia transformar os fibroblastos em um estado CAF ativado semelhante a um miofibroblasto. Em segundo lugar, este estudo também pode descrever como a produção aberrante de ERO e a disfunção mitocondrial impulsionam os fibroblastos normais em direção ao fenótipo CAF mais agressivo. Verificou-se que fibroblastos montados dentro de esferoides tumorais ganharam características miofibroblásticas com aumento da atividade das EROs e indução da expressão gênica metabólica. Este protocolo destaca a importância do microambiente tumoral na ativação da CAF e pode ser um excelente modelo para geração in vitro e estudo das características fenotípicas da CAF.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human &#945;-SMA</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>Cat# IC1420A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fibroblast microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-050-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549 lung adenocarcinoma cells</td>
			<td>NCCS Pune</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC-5 fetal lung fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 Human monocytes</td>
			<td>NCCS Pune</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>Cat# 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,6-dichloroindophenol (DCPIP)</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 55287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# C3099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCFDA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# D6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>Cat# 17892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 62858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZcoun Lactate Dehydrogenase Cell Assay Kit</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>Cat# CCK036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 87786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse heart Cytochrome c</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 81551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-iT Red hypoxia reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# H10498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# T3168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 69824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nacl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH MB Grade</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 54941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 85124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenazine methosulfate (PMS)</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 55782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>Cat# P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Cell Lysis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 4458235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# A7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# 205222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 89904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate hexahydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 36313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO cDNA synthesis kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11754-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Cat# 172-5124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL core imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Serial Number F0518-1727-0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica fluorescent inverted microscope</td>
			<td>s</td>
			<td>DMi8 automated S/N 424150)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi MACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of mitochondrial health in cancer-associated fibroblasts isolated from 3d multicellular lung tumor spheroids

Os fibroblastos associados ao câncer (CAFs) estão entre as células estromais mais abundantes presentes no microambiente tumoral, facilitando o crescimento e a progressão do tumor. A complexidade dentro do microambiente tumoral, incluindo secretoma tumoral, inflamação de baixo grau, hipóxia e desequilíbrio redox, promove a interação heterotípica e permite a transformação de fibroblastos residentes inativos para se tornarem CAFs ativos. Os CAFs distinguem-se metabolicamente dos fibroblastos normais (NFs), pois são mais glicoliticamente ativos, produzem níveis mais altos de espécies reativas de oxigênio (ROS) e superexpressam o exportador de lactato MCT-4, levando à abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (MPTP). Aqui um método foi descrito para analisar a saúde mitocondrial de CAFs ativados isolados dos esferoides tumorais 3D multicelulares compostos por células de adenocarcinoma pulmonar humano (A549), monócitos humanos (THP-1) e células de fibroblastos pulmonares humanos (MRC5). Os esferoides tumorais foram desintegrados em diferentes intervalos de tempo e, por meio da triagem celular ativada por magnetismo, os CAFs foram isolados. O potencial de membrana mitocondrial dos CAFs foi avaliado por meio do corante JC-1, da produção de ROS pela coloração de diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFDA) e da atividade enzimática nos CAFs isolados. A análise da saúde mitocondrial de CAFs isolados fornece uma melhor compreensão do efeito Warburg reverso e também pode ser aplicada para estudar as consequências das alterações mitocondriais do CAF, como fluxos metabólicos e os mecanismos regulatórios correspondentes na heterogeneidade do câncer de pulmão. Assim, o presente estudo defende a compreensão das interações tumor-estroma na saúde mitocondrial. Ele forneceria uma plataforma para verificar os candidatos a medicamentos específicos mitocondriais quanto às suas eficácias contra CAFs como terapêuticas potenciais no microambiente tumoral, evitando assim o envolvimento do CAF na progressão do câncer de pulmão.

A Figura 1 mostra o desenvolvimento de esferoides tumorais multicelulares utilizando três populações celulares diferentes - A549 (adenocarcinoma pulmonar), MRC-5 (fibroblastos) e THP-1 (monócitos) - pelo método da queda suspensa, conforme observado no dia 7 e no dia 10 ao microscópio. No 7º dia, os esferoides eram compactos e rígidos, com 260 ± 5,3 μm de diâmetro, e no 10º dia, os esferoides tinham 480 ± 7,5 μm de diâmetro (Figura 1A no painel sup...

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Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

Esferoides tumorais 3D multicelulares foram preparados com células de adenocarcinoma pulmonar, fibroblastos e monócitos, seguidos pelo isolamento de fibroblastos associados ao câncer (CAFs) desses esferoides. CAFs isolados foram comparados com fibroblastos normais para avaliar a saúde mitocondrial estudando o potencial transmembranar mitocondrial, espécies reativas de oxigênio e atividades enzimáticas.

Avaliação da Saúde Mitocondrial em Fibroblastos Associados ao Câncer Isolados de Esferoides de Tumores Pulmonares Multicelulares 3D

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

Este protocolo destaca a importância do microambiente tumoral na ativação dos fibroblastos associados ao câncer ou CAF. Poderia ser um excelente modelo in vitro para estudar características fenotípicas. As principais restrições na biologia do CAF reside na disponibilidade limitada de CAF a partir de amostras de biópsia de tumor primário.Portanto, essa técnica pode ser usada para estudar vários aspectos da biologia do CAF. Este estudo descreve a produção cruzada aberrante e a disfunção mitocondrial associada à ativação da CAF, levando a um prognóstico tumoral desfavorável. A aplicação deste método seria útil para avaliar as interações traumáticas do tumor, particularmente a ativação do CAF e a saúde mitocondrial.A fim de explorar os novos alvos de drogas. Os indivíduos devem ter experiência em procedimento celular antes de realizar esta técnica. A demonstração visual desta técnica permitirá compreender as etapas críticas no isolamento da população CAF dos esferoides tumorais e aplicações a jusante para estudar a biologia CAF.A senhorita Leena Arora, a senhorita Moyna Kalia e a Sra. Soumyajit Roy, assistentes do meu laboratório, realizam os experimentos. Para começar a crescer adenocarcinoma de pulmão humano A549 e fibroblastos pulmonares humanos MRC-5 células aderentes em DMEM e monócitos humanos células THP-1 em meio de crescimento completo RPMI em frascos T25 a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada com dióxido de carbono a 5%.Após três dias, com 80 a 85% de confluência celular, lave as células A549 e MRC-5 com um mililitro de PBS por um minuto. Em seguida, colha as células incubando-as com 500 microlitros de solução de EDTA a 0,25% de tripsina por cinco minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione imediatamente quatro mililitros de meio de crescimento completo para inativar a tripsina.Recolha a suspensão celular num tubo de 15 mililitros e solte-a a 125 x g durante cinco minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em um meio de crescimento completo de cinco mililitros. Para estabelecer esferoides tumorais multicelulares, conte os números de células A549, MRC-5 e THP-1 usando um contador de células para um volume de mililitro.Após a contagem, prepare a suspensão celular na proporção de 5:4:1 e compense o volume para um mililitro com DMEM completo. Em seguida, coloque uma gota de 25 microlitros de mistura de suspensão celular na tampa de um prato de cultura de 90 milímetros. Encha o fundo do prato com 10 mililitros de água estéril.Inverta cuidadosamente a tampa sobre a câmara de hidratação cheia de água e coloque o prato em uma incubadora de cultura de células por três dias. No quarto dia, monitore os esferoides sob o microscópio. Para adquirir imagens, ligue o interruptor de alimentação.Coloque o prato de cultura de 90 milímetros no palco e selecione a ampliação de 10 x. Ajuste as lentes e examine as células para analisar a agregação e proliferação celular. Pressione os botões de congelamento e salvamento fornecidos para capturar a imagem.Após a imagem, substitua o meio de crescimento aspirando cuidadosamente 20 microlitros de meio de cada gota por um meio fresco. Para imagens de mortos-vivos, ative o Ctr avançado, que é o switch um, depois a CPU e aguarde a inicialização do sistema de software. Quando inicializado, coloque o prato de 90 milímetros contendo esferoides no palco do microscópio fluorescente invertido.Em seguida, observe e capture imagens com ampliação de 10 x selecionando a opção de fluorescência no software e selecionando o FITC para o canal calceína e Texas Red. Em seguida, selecione a opção, viva e visualize a imagem. Ajuste a intensidade de fluorescência para otimização apropriada e clique no botão seguro.Colete 200 tumores, esferoides cada um no sétimo e 10º dia usando uma pipeta de um mililitro e um tubo de 15 mililitros. Em seguida, elimine os esferoides por centrifugação a 125 x g por cinco minutos e aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Lave os esferoides com 200 microlitros de PBS, centrifugar novamente e descartar o sobrenadante.Adicionar 400 microlitros de solução de EDTA de tripsina a 0,25% para desintegração esferoide e incubar a 37 graus Celsius durante 10 minutos. Realize pipetagem vigorosa para a completa desintegração dos esferoides. Neutralize a tripsina adicionando um mililitro de meio de crescimento DMEM completo.Em seguida, centrifugar a suspensão esferoide e descartar o sobrenadante antes de ressuspender o pellet em um mililitro de meio DMEM completo. Conte o número total de células conforme demonstrado. Para o isolamento de fibroblastos associados ao câncer ou CAFs dos esferoides tumorais, ressuspeite 1 x 10 para as sétimas células em 80 microlitros de classificação de células ativadas magnéticas a frio ou tampão MACS.Adicione 20 microlitros de microesferas antifibroblásticas na suspensão celular, misture bem batendo suavemente no tubo e incubando-o à temperatura ambiente por 30 minutos. Após a incubação, lave as células com um mililitro de tampão MACS frio. Em seguida, centrifugar e aspirar o sobrenadante antes de ressuspender o pellet em 500 microlitros de tampão MACS.Para a separação celular à base de grânulos magnéticos, prepare a coluna MACS enxaguando-a com três mililitros de tampão MACS. Coloque a suspensão celular na coluna e colete o fluxo através da contenção da população celular não rotulada. Em seguida, lave a coluna três vezes com três mililitros de tampão MACS antes de removê-la do separador.Em seguida, coloque a coluna no tubo de coleta. Colete as células marcadas com microesferas antifibroblastos adicionando cinco mililitros de tampão MACS e empurrando firmemente o êmbolo para a coluna. Centrifugar as células rotuladas antes de prosseguir para aplicações a jusante.Conte o número de CAFs isolados e use aproximadamente 6 x 10 até a quarta célula para análise de citometria de fluxo. Lave as células uma vez com PBS, depois centrifugar e aspirar o sobrenadante. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de permeabilização celular e incube as células a quatro graus Celsius por 30 minutos com vórtice intermitente para manter uma única suspensão celular.Novamente, após centrifugação e ressuspensão das células em tampão de permeabilização, adicione dois microlitros de anticorpo AME alfa humano conjugado com APC e incube a quatro graus Celsius por 45 minutos. Após a incubação, adicione um mililitro de tampão de permeabilização e centrifugar para remover o excesso de anticorpo. Ressuspender o pellet em 400 microlitros de tampão de permeabilização para citometria de fluxo.Selecione as células positivas para ACTA2 depois de distinguir as populações de células com base em sua dispersão frontal e lateral. Seleção da população singlete seguida da seleção das células positivas para ACTA2 que aparecem como um único pico no histograma de parâmetro único. O desenvolvimento de esferoides tumorais multicelulares e a análise de mortos vivos são mostrados aqui.No sétimo dia, os esferoides eram compactos e rígidos, com aproximadamente 260 mícrons de diâmetro. No dia 10, os esferoides tinham 480 mícrons de diâmetro. No ensaio de viabilidade celular, observou-se uma diminuição na fluorescência do iodeto de propídio e um aumento na fluorescência calceína-AM do sétimo ao dia 10.A coloração hipóxica revelou um núcleo hipóxico no centro do dia 10 esferoides. Além disso, observou-se regulação positiva da expressão gênica de E-caderina e Mki-67 com o aumento dos dias de formação de esferoides tumorais. Os CAFs isolados dos esferoides tumorais do dia 10 foram aproximadamente 69%ACTA2 positivos.Os CAFs apresentaram regulação positiva tripla no ACTA2 e dez vezes na cadeia alfa 2 do colágeno tipo 1 em comparação com os fibroblastos MRC-5. Um aumento significativo nos níveis de EROs no 10º dia foi observado esferoides tumorais em comparação com o sétimo dia, sugerindo o possível envolvimento da geração de ERO na ativação do CAF. Um aumento significativo foi observado nos níveis de EROs celulares em CAFs, isolados a partir do sétimo dia e do dia 10 esferoides tumorais.Além disso, uma alteração do potencial de membrana mitocondrial foi observada pela coloração JC-1. Uma indução da expressão gênica de GLUT1 e MCT4 foi observada em CAFs em comparação com fibroblastos normais. Indução significativa da atividade da enzima lactato desidrogenase, citocromo C oxidase e succinato desidrogenase foi observada em CAFs em comparação com fibroblastos normais.Uma proporção de 5:4:1 de células A549, MRC-5 e THP-1 deve ser usada para o desenvolvimento bem-sucedido de esferoides tumorais multicelulares 3D. A população de fibroblastos é fundamental para a rigidez dos esferoides tumorais. Semelhante à solução catiônica e caracterização, pode-se também usar este esferoide tumoral para obter a população de células de macrófagos associados ao tumor, que é cúmplice na progressão tumoral.Esta análise esferoide nos ajudaria a entender como as células cancerosas cruzadas fibroblastos estão envolvidos na ativação dos CAFs, e também pode ser usado para verificar os candidatos a drogas mitocondriais específicas.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

Ensaio de recrutamento de células de Tumor de pulmão

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Pesquisa do câncer

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Na Vivo Avaliação de EPR de pH, pO2, Status Redox e as concentrações de fosfato e glutationa no microambiente do Tumor

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

O estabelecimento de um ensaio de colonização de pulmão para visualização de células de Tumor nos tecidos do pulmão de circulação

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Um modelo de spheroid 3D como um sistema mais fisiológico para fibroblastos associados ao cancro diferenciação e invasão in vitro estudos

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Estabelecimento e caracterização de spheroids do tumor neuroendócrino das entranhas pequenas

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Detecção de Progressão do Tumor Pulmonar em Camundongos por ultrassom

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Um Modelo de Camundongo para Investigar o Papel de Fibroblastos Associados ao Câncer no Crescimento Tumoral

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Isolamento de fibroblastos associados ao câncer primário de um modelo de murina síndica do câncer de mama para o estudo de nanopartículas-alvo

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Explorando o metabolismo de energia mitocondrial de spheróides microtissue 3D únicos usando análise de fluxo extracelular

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...