Name: assessment of mitochondrial health in cancer-associated fibroblasts isolated from 3d multicellular lung tumor spheroids
Uploaded: 2022-10-21T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el Proyecto del Premio a la Excelencia de las Mujeres SERBIAS, India (SB/WEA-02/2017) y el Proyecto del Premio de Investigación de Carrera Temprana SERB, India (ECR/2017/000892) al PD. Los autores, LA y SR reconocen a IIT Ropar y MHRD por sus becas de investigación. MK reconoce a ICMR por su beca de investigación.

1. Cultivo celular
<ol><li>Cultivo de adenocarcinoma de pulmón humano línea celular A549, y línea celular monocítica humana THP-1 en medios RPMI1640 suplementados con 10% FBS y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C en una cámara humidificada con 5% deCO2.</li>
	<li>Cultivo de células de fibroblastos pulmonares humanos MRC-5 en medio DMEM suplementado con FBS al 10% y solución de penicilina-estreptomicina al 1% a 37 °C en una cámara humidificada con 5% deCO2.</li>
</ol>...

<ol>
	<li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+demonstrates+the+molecular+and+cellular+reprogramming+of+metastatic+lung+adenocarcinoma.">Single-cell RNA sequencing demonstrates the molecular and cellular reprogramming of metastatic lung adenocarcinoma.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-5 (2020).</li><li>Davidson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+reveals+a+dynamic+stromal+niche+that+supports+tumor+growth.">Single-cell RNA sequencing reveals a dynamic stromal niche that supports tumor growth.</a> Cell Reports. 31 (7), 107628 (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analyses+of+renal+cell+cancers+reveal+insights+into+tumor+microenvironment,+cell+of+origin,+and+therapy+response.">Single-cell analyses of renal cell cancers reveal insights into tumor microenvironment, cell of origin, and therapy response.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (24), (2021).</li><li>Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+patient+specificity+in+the+engineering+of+tumor+models.">Addressing patient specificity in the engineering of tumor models.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217 (2019).</li><li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method.">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Tissue Engineering. , 141-151 (2007).</li><li>Dituri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+tumor+spheroid+formation+and+one-step+cancer-associated+fibroblasts+purification+from+hepatocellular+carcinoma+tissue+promoted+by+inorganic+surface+topography.">Complex tumor spheroid formation and one-step cancer-associated fibroblasts purification from hepatocellular carcinoma tissue promoted by inorganic surface topography.</a> Nanomaterials. 11 (12), 3233 (2021).</li><li>Arora, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multicellular+3D+tumor+model+to+study+cellular+heterogeneity+and+plasticity+in+NSCLC+tumor+microenvironment.">Development of a multicellular 3D tumor model to study cellular heterogeneity and plasticity in NSCLC tumor microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 12, 881207 (2022).</li><li>Nurmik, M., Ullmann, P., Rodriguez, F., Haan, S., Letellier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+search+of+definitions:+Cancer-associated+fibroblasts+and+their+markers.">In search of definitions: Cancer-associated fibroblasts and their markers.</a> International Journal of Cancer. 146 (4), 895-905 (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1&#945;+is+necessary+for+activation+and+tumour-promotion+effect+of+cancer-associated+fibroblasts+in+lung+cancer.">HIF-1&#945; is necessary for activation and tumour-promotion effect of cancer-associated fibroblasts in lung cancer.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (12), 5457-5469 (2021).</li><li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+heterogeneity+and+versatility+of+cancer-associated+fibroblasts+in+the+tumor+microenvironment.">Biological heterogeneity and versatility of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment.</a> Oncogene. 38 (25), 4887-4901 (2019).</li><li>Whitaker-Menezes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+stromal-epithelial+&amp;#34;lactate+shuttle&amp;#34;+in+human+tumors:+MCT4+is+a+marker+of+oxidative+stress+in+cancer-associated+fibroblasts.">Evidence for a stromal-epithelial &amp;#34;lactate shuttle&amp;#34; in human tumors: MCT4 is a marker of oxidative stress in cancer-associated fibroblasts.</a> Cell cycle. 10 (11), 1772-1783 (2011).</li><li>Mandujano-Tinoco, E. A., Gallardo-P&#233;rez, J. C., Mar&#237;n-Hern&#225;ndez, A., Moreno-S&#225;nchez, R., Rodr&#237;guez-Enr&#237;quez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-mitochondrial+therapy+in+human+breast+cancer+multi-cellular+spheroids.">Anti-mitochondrial therapy in human breast cancer multi-cellular spheroids.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1833 (3), 541-551 (2013).</li><li>Bregman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology. , (2002).</li><li>Berry, E. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+hemes+a,+b,+and+c+from+pyridine+hemochrome+spectra.">Simultaneous determination of hemes a, b, and c from pyridine hemochrome spectra.</a> Analytical Biochemistry. 161 (1), 1-15 (1987).</li><li>Avagliano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+cancer+associated+fibroblasts:+the+slavery+of+stromal+fibroblasts.">Metabolic reprogramming of cancer associated fibroblasts: the slavery of stromal fibroblasts.</a> BioMed Research International. , (2018).</li><li>Lorusso, G., R&#252;egg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+and+its+contribution+to+tumor+evolution+toward+metastasis.">The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).</li><li>Liu, T., Zhou, L., Li, D., Andl, T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+build+and+secure+the+tumor+microenvironment.">Cancer-associated fibroblasts build and secure the tumor microenvironment.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 60 (2019).</li><li>Sebastian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+analysis+of+tumor-derived+fibroblasts+and+normal+tissue-resident+fibroblasts+reveals+fibroblast+heterogeneity+in+breast+cancer.">Single-cell transcriptomic analysis of tumor-derived fibroblasts and normal tissue-resident fibroblasts reveals fibroblast heterogeneity in breast cancer.</a> Cancers. 12 (5), 1307 (2020).</li><li>Elyada, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+single-cell+analysis+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+reveals+antigen-presenting+cancer-associated+fibroblasts.">Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts.</a> Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).</li><li>Ganguly, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts:+Versatile+players+in+the+tumor+microenvironment.">Cancer-associated fibroblasts: Versatile players in the tumor microenvironment.</a> Cancers. 12 (9), 2652 (2020).</li><li>Harryvan, T. J., Verdegaal, E. M., Hardwick, J. C., Hawinkels, L. J., vander Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+the+cancer-associated+fibroblast-T-cell+axis+in+solid+malignancies.">Targeting of the cancer-associated fibroblast-T-cell axis in solid malignancies.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1989 (2019).</li><li>Santi, A., Kugeratski, F. G., Zanivan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts:+the+architects+of+stroma+remodeling.">Cancer associated fibroblasts: the architects of stroma remodeling.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700167 (2018).</li></ol>

El presente estudio introduce el desarrollo de esferoides tumorales multicelulares que comprenden células tumorales, población de células estromales (es decir, fibroblastos) y población de células inmunes (es decir, monocitos) utilizando un método modificado de gota colgante. Los fibroblastos y los monocitos/macrófagos se encuentran entre las poblaciones más significativas que constituyen el microambiente tumoral (EMT), y su presencia a menudo está relacionada con un mal pronósticodel paciente...

Los tumores sólidos están compuestos por poblaciones celulares heterogéneas que son guiadas por el microambiente tumoral (TME), sin embargo, el origen de la mayoría de las células aún no se ha descubierto. Principalmente las células estromales e inmunes (fibroblastos, células endoteliales, monocitos, macrófagos, células dendríticas, células B, células T y sus subconjuntos) reflejan la heterogeneidad tumoral en los cánceres de pulmón, mama, riñón y otros cánceres sólidos 1,2,3. Comprender el origen de cada subtipo y su potencial de transdiferenciación es de suma necesidad para desarrollar terapias avanzadas contra estos cánceres. El análisis de esta población celular diversa en biopsias humanas se presenta con varios desafíos debido al tipo de tumor, sitio, etapa, limitación de la cantidad de muestra y variabilidades específicas del paciente4. Por lo tanto, se necesita un modelo experimental, que no solo sea confiable sino que también pueda simular la condición tumoral in vivo, demostrando ser ideal para estudiar la diafonía tumor-estroma y su participación en la fisiopatología de la enfermedad.
Los cultivos tridimensionales (3D) multicelulares de esferoides tumorales (MCTS) son un sistema modelo de tumores in vitro ventajoso debido a su parecido con sus contrapartes naturales. MCTS puede replicar mejor aspectos de tumores sólidos que los modelos de cultivo celular 2D, incluida su arquitectura espacial, respuestas fisiológicas, liberación de mediadores solubles, patrones de expresión génica y mecanismos de resistencia a los medicamentos. Además, una ventaja principal de MCTS es que se puede utilizar para estudiar la heterogeneidad tumoral y el microambiente tumoral (TME). El método de caída colgante es la herramienta más comúnmente empleada para desarrollar y analizar MCTS5. En este método, las diferentes células con medios se suspenden en forma de gotas, lo que permite su crecimiento de forma coherente en 3D agregado y es fácil de acceder para su examen. La técnica es sencilla; No requiere muchas células y elimina la necesidad de un sustrato especializado como la agarosa para el desarrollo de esferoides6. Una ventaja adicional de este método radica en la reproducibilidad de su técnica. Además, este método también se ha utilizado para cocultivar poblaciones de células mixtas, como células endoteliales y células tumorales, para simular la angiogénesis tumoral temprana7.
En este estudio, se prepararon esferoides tumorales pulmonares 3D multicelulares con células de adenocarcinoma de pulmón, fibroblastos y monocitos utilizando el método de gota colgante que imita el microambiente del tumor pulmonar. Luego, la población de fibroblastos asociados al cáncer (CAF) se aisló para investigar la salud mitocondrial. La idea principal detrás del desarrollo de estos esferoides es aislar los CAF, ya que la diafonía entre las células en los esferoides podría transformar los fibroblastos en un estado de CAF activado similar al miofibroblasto. En segundo lugar, este estudio también puede representar cómo la producción aberrante de ROS y la disfunción mitocondrial impulsan a los fibroblastos normales hacia el fenotipo CAF más agresivo. Se encontró que los fibroblastos ensamblados dentro de los esferoides tumorales ganaron características miofibroblásticas, con el aumento de la actividad de ROS y la inducción de la expresión génica metabólica. Este protocolo destaca la importancia del microambiente tumoral en la activación de CAF y podría ser un excelente modelo para la generación in vitro y el estudio de las características fenotípicas de CAF.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human &#945;-SMA</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>Cat# IC1420A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fibroblast microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-050-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549 lung adenocarcinoma cells</td>
			<td>NCCS Pune</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC-5 fetal lung fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 Human monocytes</td>
			<td>NCCS Pune</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>Cat# 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,6-dichloroindophenol (DCPIP)</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 55287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# C3099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCFDA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# D6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>Cat# 17892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 62858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZcoun Lactate Dehydrogenase Cell Assay Kit</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>Cat# CCK036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 87786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse heart Cytochrome c</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 81551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-iT Red hypoxia reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# H10498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# T3168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 69824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nacl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH MB Grade</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 54941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 85124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenazine methosulfate (PMS)</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 55782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>Cat# P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Cell Lysis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 4458235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# A7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# 205222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 89904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate hexahydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 36313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO cDNA synthesis kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11754-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Cat# 172-5124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL core imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Serial Number F0518-1727-0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica fluorescent inverted microscope</td>
			<td>s</td>
			<td>DMi8 automated S/N 424150)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi MACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of mitochondrial health in cancer-associated fibroblasts isolated from 3d multicellular lung tumor spheroids

Los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) se encuentran entre las células estromales más abundantes presentes en el microambiente tumoral, lo que facilita el crecimiento y la progresión del tumor. La complejidad dentro del microambiente tumoral, incluyendo el secretoma tumoral, la inflamación de bajo grado, la hipoxia y el desequilibrio redox, fomenta la interacción heterotípica y permite la transformación de fibroblastos residentes inactivos para convertirse en CAF activos. Los CAF se distinguen metabólicamente de los fibroblastos normales (NF) ya que son más activos glucolíticamente, producen niveles más altos de especies reactivas de oxígeno (ROS) y sobreexpresan el exportador de lactato MCT-4, lo que lleva a la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (MPTP). Aquí se ha descrito un método para analizar la salud mitocondrial de CAF activados aislados de los esferoides tumorales 3D multicelulares que comprenden células de adenocarcinoma de pulmón humano (A549), monocitos humanos (THP-1) y células de fibroblastos de pulmón humano (MRC5). Los esferoides tumorales se desintegraron en diferentes intervalos de tiempo y, mediante la clasificación celular activada magnéticamente, se aislaron los CAF. El potencial de membrana mitocondrial de los CAF se evaluó mediante colorante JC-1, la producción de ROS mediante tinción de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína diacetato (DCFDA) y la actividad enzimática en los CAF aislados. El análisis de la salud mitocondrial de CAF aisladas proporciona una mejor comprensión del efecto Warburg inverso y también se puede aplicar para estudiar las consecuencias de los cambios mitocondriales de CAF, como los flujos metabólicos y los mecanismos reguladores correspondientes sobre la heterogeneidad del cáncer de pulmón. Por lo tanto, el presente estudio aboga por una comprensión de las interacciones tumor-estroma en la salud mitocondrial. Proporcionaría una plataforma para verificar la eficacia de los candidatos a fármacos mitocondriales específicos contra los CAF como posibles terapias en el microambiente tumoral, evitando así la participación de CAF en la progresión del cáncer de pulmón.

La Figura 1 muestra el desarrollo de esferoides tumorales multicelulares utilizando tres poblaciones celulares diferentes: A549 (adenocarcinoma de pulmón), MRC-5 (fibroblastos) y THP-1 (monocitos), por el método de gota colgante como se observó en el día 7 y el día 10 bajo el microscopio. El día 7, los esferoides eran compactos y rígidos con un diámetro de 260 ± 5,3 μm, y el día 10, los esferoides tenían 480 ± 7,5 μm de diámetro (Figura 1A panel s...

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Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

Se prepararon esferoides tumorales 3D multicelulares con células de adenocarcinoma de pulmón, fibroblastos y monocitos, seguidos del aislamiento de fibroblastos asociados al cáncer (CAF) de estos esferoides. Los CAF aislados se compararon con fibroblastos normales para evaluar la salud mitocondrial mediante el estudio del potencial transmembrana mitocondrial, las especies reactivas de oxígeno y las actividades enzimáticas.

Evaluación de la salud mitocondrial en fibroblastos asociados al cáncer aislados de esferoides tumorales de pulmón multicelulares 3D

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

Este protocolo destaca la importancia del microambiente tumoral en la activación de los fibroblastos asociados al cáncer o CAF. Podría ser un excelente modelo in vitro para estudiar las características fenotípicas. Las principales limitaciones en la biología de CAF radican en la disponibilidad limitada de CAF a partir de muestras de biopsia de tumor primario.Por lo tanto, esta técnica se puede utilizar para estudiar diversos aspectos de la biología de CAF. Este estudio muestra la producción cruzada aberrante y la disfunción mitocondrial asociada con la activación de CAF que conduce a un mal pronóstico tumoral. La aplicación de este método sería útil para evaluar las interacciones traumáticas del tumor, particularmente la activación de CAF y la salud mitocondrial.Con el fin de explorar los nuevos objetivos farmacológicos. Las personas deben tener experiencia en el procedimiento celular antes de realizar esta técnica. La demostración visual de esta técnica permitirá comprender los pasos críticos para aislar a la población de CAF de los esferoides tumorales y las aplicaciones posteriores para estudiar la biología de CAF.La señorita Leena Arora, la señorita Moyna Kalia y la señora Soumyajit Roy, asistentes de mi laboratorio, realizan los experimentos. Para comenzar a crecer adenocarcinoma de pulmón humano A549 y fibroblastos de pulmón humano MRC-5 adherentes a células en DMEM y monocitos humanos células THP-1 en RPMI medio de crecimiento completo en matraces T25 a 37 grados centígrados en una cámara humidificada con 5% de dióxido de carbono.Después de tres días, al 80 a 85% de confluencia celular, lave las células A549 y MRC-5 con un mililitro de PBS durante un minuto. A continuación, cosechar las células incubándolas con 500 microlitros de solución de EDTA de tripsina al 0,25% durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Luego, agregue inmediatamente cuatro mililitros de medio de crecimiento completo para inactivar la tripsina.Recoja la suspensión celular en un tubo de 15 mililitros y gránela a 125 x g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en un medio de crecimiento completo de cinco mililitros. Para establecer los esferoides tumorales multicelulares, cuente los números de células A549, MRC-5 y THP-1 utilizando un contador de células para un mililitro de volumen.Después de contar, prepare la suspensión celular en una proporción de 5: 4: 1 y recupere el volumen a un mililitro con DMEM completo. A continuación, coloque una gota de 25 microlitros de mezcla de suspensión celular en la cubierta de una placa de cultivo de 90 milímetros. Llene el fondo del plato con 10 mililitros de agua estéril.Invierta cuidadosamente la tapa sobre la cámara de hidratación llena de agua y coloque el plato en una incubadora de cultivo celular durante tres días. En el cuarto día, monitoree los esferoides bajo el microscopio. Para adquirir imágenes, encienda el interruptor de encendido.Coloque el plato de cultivo de 90 milímetros en el escenario y seleccione el aumento de 10x. Ajuste las lentes y examine las células para analizar la agregación y proliferación celular. Pulse los botones congelar y guardar que se proporcionan para capturar la imagen.Después de la obtención de imágenes, reemplace el medio de crecimiento aspirando cuidadosamente 20 microlitros de medio de cada gota con un medio fresco. Para imágenes de muertos vivos, encienda Ctr avanzado, que es el interruptor uno, luego la CPU y espere a que se inicie el sistema de software. Cuando arranque, coloque el plato de 90 milímetros que contiene esferoides en la etapa del microscopio fluorescente invertido.Luego observe y capture imágenes con un aumento de 10x seleccionando la opción de fluorescencia en el software y seleccionando el FITC para el canal de calceína y Texas Red. A continuación, seleccione la opción, en vivo y vea la imagen. Ajuste la intensidad de fluorescencia para una optimización adecuada y haga clic en el botón seguro.Recolectar 200 tumores, esferoides cada uno en el día siete y 10 usando una pipeta de un mililitro y un tubo de 15 mililitros. Luego granular los esferoides por centrifugación a 125 x g durante cinco minutos y aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Lave los esferoides con 200 microlitros de PBS, centrifugar nuevamente y deseche el sobrenadante.Agregue 400 microlitros de solución de EDTA de tripsina al 0,25% para la desintegración de esferoides e incube a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Realizar un pipeteo vigoroso para la desintegración completa de los esferoides. Neutralice la tripsina agregando un mililitro de medio de crecimiento DMEM completo.Luego centrifugar la suspensión esferoide y desechar el sobrenadante antes de volver a suspender el pellet en un mililitro de medio DMEM completo. Cuente el número total de celdas como se demuestra. Para el aislamiento de fibroblastos asociados al cáncer o CAF de los esferoides tumorales, resuspender 1 x 10 a las séptimos células en 80 microlitros de clasificación de células activadas magnéticas frías o tampón MACS.Agregue 20 microlitros de microperlas antifibroblastos en la suspensión celular, mezcle bien golpeando suavemente el tubo e incubándolo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación, lave las células con un mililitro de tampón MACS frío. Luego centrifugar y aspirar el sobrenadante antes de resuspender el pellet en 500 microlitros de tampón MACS.Para la separación celular basada en perlas magnéticas, prepare la columna MACS enjuagándola con tres mililitros de tampón MACS. Coloque la suspensión celular en la columna y recoja el flujo a través de la población celular no etiquetada. A continuación, lave la columna tres veces con tres mililitros de tampón MACS antes de retirarla del separador.Luego coloque la columna en el tubo de recolección. Recoja las células marcadas con microperlas antifibroblastos agregando cinco mililitros de tampón MACS y empujando firmemente el émbolo hacia la columna. Centrifugar las celdas marcadas antes de proceder a aplicaciones posteriores.Cuente el número de CAF aislados y use aproximadamente 6 x 10 a la cuarta célula para el análisis de citometría de flujo. Lave las células una vez con PBS, luego centrifugar y aspirar el sobrenadante. A continuación, agregue 100 microlitros de tampón de permeabilización celular e incube las células a cuatro grados centígrados durante 30 minutos con vórtice intermitente para mantener una suspensión de una sola célula.Nuevamente, después de la centrifugación y la resuspensión de las células en tampón de permeabilización, agregue dos microlitros de anticuerpo anti-SMA antihumano conjugado APC e incube a cuatro grados centígrados durante 45 minutos. Después de la incubación, agregue un mililitro de tampón de permeabilización y centrifugar para eliminar el exceso de anticuerpos. Resuspender el pellet en 400 microlitros de tampón de permeabilización para citometría de flujo.Seleccione las células positivas para ACTA2 después de distinguir las poblaciones de células en función de su dispersión hacia adelante y hacia los lados. Selección de la población de singletes seguida de la selección de las células positivas ACTA2 que aparecen como un pico único en el histograma de parámetro único. El desarrollo de esferoides tumorales multicelulares y el análisis de muertos vivos se muestran aquí.En el séptimo día, los esferoides eran compactos y rígidos con aproximadamente 260 micras de diámetro. El día 10, los esferoides tenían 480 micras de diámetro. En el ensayo de viabilidad celular, se observó una disminución en la fluorescencia del yoduro de propidio y un aumento en la fluorescencia de calceína-AM desde el día siete hasta el día 10.La tinción hipóxica reveló un núcleo hipóxico en el centro de los esferoides del día 10. Además, se observó una regulación positiva de la expresión génica de E-cadherina y Mki-67 con el aumento de días de formación de esferoides tumorales. Los CAF aislados de los esferoides tumorales del día 10 fueron aproximadamente 69% ACTA2 positivos.Los CAF mostraron una regulación positiva triple en ACTA2 y diez veces en la cadena alfa 2 de colágeno tipo 1 en comparación con los fibroblastos MRC-5. Se observó un aumento significativo en los niveles de ROS en los esferoides tumorales del día 10 en comparación con el día siete, lo que sugiere la posible participación de la generación de ROS en la activación de CAF. Se observó un aumento significativo en los niveles celulares de ROS en CAFs, aislados a partir del día siete y del día 10 de los esferoides tumorales.Además, se observó una alteración del potencial de la membrana mitocondrial mediante tinción JC-1. Se observó una inducción de la expresión génica de GLUT1 y MCT4 en CAFs en comparación con fibroblastos normales. Se observó una inducción significativa de la actividad de la lactato deshidrogenasa, la citocromo C oxidasa y la succinato deshidrogenasa en los CAF en comparación con los fibroblastos normales.Se debe usar una proporción de 5: 4: 1 de células A549, MRC-5 y THP-1 para el desarrollo exitoso del esferoide tumoral multicelular 3D. La población de fibroblastos es crítica para la rigidez de los esferoides tumorales. Similar a la solución y caracterización de cationes, también se puede usar este esferoide tumoral para obtener población de células de macrófagos asociada al tumor, que es cómplice en la progresión tumoral.Este análisis de esferoides nos ayudaría a comprender cómo las células cancerosas que cruzan fibroblastos están involucradas en la activación de CAFs, y también se puede utilizar para comprobar los candidatos a fármacos específicos mitocondriales.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

Ensayo de reclutamiento de células de pulmón Tumor

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

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En Vivo EPR evaluación de pH, pO2, estado Redox y concentraciones de fosfato y glutatión en el microambiente tumoral

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Establecimiento de esferoides tridimensionales a partir de muestras tumorales derivadas de pacientes y evaluación de su sensibilidad a los fármacos

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