Name: assessment of mitochondrial health in cancer-associated fibroblasts isolated from 3d multicellular lung tumor spheroids
Uploaded: 2022-10-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids at JoVE.com

Bu çalışma, DP'ye SERB-Kadın Mükemmellik Ödülü Projesi, Hindistan (SB/WEA-02/2017) ve SERB-Erken Kariyer Araştırma Ödülü Projesi Hindistan (ECR/2017/000892) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, LA ve SR, IIT Ropar ve MHRD'yi araştırma bursları için kabul eder. MK, ICMR'yi araştırma bursu için kabul ediyor.

1. Hücre kültürü
<ol><li>Kültür insan akciğer adenokarsinomu hücre hattı A549 ve RPMI1640 ortamındaki insan monositik hücre hattı THP-1, % 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir odada% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile 37 ° C'de% 1 ile desteklenmiştir.</li>
	<li>DMEM ortamındaki kültür MRC-5 insan akciğer fibroblast hücreleri,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir odada% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin çözeltisi ile 37 ° C'de% 1 penisilin-streptomisin çözeltisi i...

<ol>
	<li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+demonstrates+the+molecular+and+cellular+reprogramming+of+metastatic+lung+adenocarcinoma.">Single-cell RNA sequencing demonstrates the molecular and cellular reprogramming of metastatic lung adenocarcinoma.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-5 (2020).</li><li>Davidson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+reveals+a+dynamic+stromal+niche+that+supports+tumor+growth.">Single-cell RNA sequencing reveals a dynamic stromal niche that supports tumor growth.</a> Cell Reports. 31 (7), 107628 (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analyses+of+renal+cell+cancers+reveal+insights+into+tumor+microenvironment,+cell+of+origin,+and+therapy+response.">Single-cell analyses of renal cell cancers reveal insights into tumor microenvironment, cell of origin, and therapy response.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (24), (2021).</li><li>Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+patient+specificity+in+the+engineering+of+tumor+models.">Addressing patient specificity in the engineering of tumor models.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217 (2019).</li><li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method.">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Tissue Engineering. , 141-151 (2007).</li><li>Dituri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+tumor+spheroid+formation+and+one-step+cancer-associated+fibroblasts+purification+from+hepatocellular+carcinoma+tissue+promoted+by+inorganic+surface+topography.">Complex tumor spheroid formation and one-step cancer-associated fibroblasts purification from hepatocellular carcinoma tissue promoted by inorganic surface topography.</a> Nanomaterials. 11 (12), 3233 (2021).</li><li>Arora, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multicellular+3D+tumor+model+to+study+cellular+heterogeneity+and+plasticity+in+NSCLC+tumor+microenvironment.">Development of a multicellular 3D tumor model to study cellular heterogeneity and plasticity in NSCLC tumor microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 12, 881207 (2022).</li><li>Nurmik, M., Ullmann, P., Rodriguez, F., Haan, S., Letellier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+search+of+definitions:+Cancer-associated+fibroblasts+and+their+markers.">In search of definitions: Cancer-associated fibroblasts and their markers.</a> International Journal of Cancer. 146 (4), 895-905 (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1&#945;+is+necessary+for+activation+and+tumour-promotion+effect+of+cancer-associated+fibroblasts+in+lung+cancer.">HIF-1&#945; is necessary for activation and tumour-promotion effect of cancer-associated fibroblasts in lung cancer.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (12), 5457-5469 (2021).</li><li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+heterogeneity+and+versatility+of+cancer-associated+fibroblasts+in+the+tumor+microenvironment.">Biological heterogeneity and versatility of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment.</a> Oncogene. 38 (25), 4887-4901 (2019).</li><li>Whitaker-Menezes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+stromal-epithelial+&amp;#34;lactate+shuttle&amp;#34;+in+human+tumors:+MCT4+is+a+marker+of+oxidative+stress+in+cancer-associated+fibroblasts.">Evidence for a stromal-epithelial &amp;#34;lactate shuttle&amp;#34; in human tumors: MCT4 is a marker of oxidative stress in cancer-associated fibroblasts.</a> Cell cycle. 10 (11), 1772-1783 (2011).</li><li>Mandujano-Tinoco, E. A., Gallardo-P&#233;rez, J. C., Mar&#237;n-Hern&#225;ndez, A., Moreno-S&#225;nchez, R., Rodr&#237;guez-Enr&#237;quez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-mitochondrial+therapy+in+human+breast+cancer+multi-cellular+spheroids.">Anti-mitochondrial therapy in human breast cancer multi-cellular spheroids.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1833 (3), 541-551 (2013).</li><li>Bregman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology. , (2002).</li><li>Berry, E. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+hemes+a,+b,+and+c+from+pyridine+hemochrome+spectra.">Simultaneous determination of hemes a, b, and c from pyridine hemochrome spectra.</a> Analytical Biochemistry. 161 (1), 1-15 (1987).</li><li>Avagliano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+cancer+associated+fibroblasts:+the+slavery+of+stromal+fibroblasts.">Metabolic reprogramming of cancer associated fibroblasts: the slavery of stromal fibroblasts.</a> BioMed Research International. , (2018).</li><li>Lorusso, G., R&#252;egg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+and+its+contribution+to+tumor+evolution+toward+metastasis.">The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).</li><li>Liu, T., Zhou, L., Li, D., Andl, T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+build+and+secure+the+tumor+microenvironment.">Cancer-associated fibroblasts build and secure the tumor microenvironment.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 60 (2019).</li><li>Sebastian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+analysis+of+tumor-derived+fibroblasts+and+normal+tissue-resident+fibroblasts+reveals+fibroblast+heterogeneity+in+breast+cancer.">Single-cell transcriptomic analysis of tumor-derived fibroblasts and normal tissue-resident fibroblasts reveals fibroblast heterogeneity in breast cancer.</a> Cancers. 12 (5), 1307 (2020).</li><li>Elyada, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+single-cell+analysis+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+reveals+antigen-presenting+cancer-associated+fibroblasts.">Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts.</a> Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).</li><li>Ganguly, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts:+Versatile+players+in+the+tumor+microenvironment.">Cancer-associated fibroblasts: Versatile players in the tumor microenvironment.</a> Cancers. 12 (9), 2652 (2020).</li><li>Harryvan, T. J., Verdegaal, E. M., Hardwick, J. C., Hawinkels, L. J., vander Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+the+cancer-associated+fibroblast-T-cell+axis+in+solid+malignancies.">Targeting of the cancer-associated fibroblast-T-cell axis in solid malignancies.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1989 (2019).</li><li>Santi, A., Kugeratski, F. G., Zanivan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts:+the+architects+of+stroma+remodeling.">Cancer associated fibroblasts: the architects of stroma remodeling.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700167 (2018).</li></ol>

Bu çalışma, modifiye edilmiş bir asılı damla yöntemi kullanılarak tümör hücrelerini, stromal hücre popülasyonunu (yani fibroblastları) ve immün hücre popülasyonunu (yani monositleri) içeren çok hücreli tümör sferoidlerinin gelişimini tanıtmaktadır. Fibroblastlar ve monositler/makrofajlar, tümör mikroçevresini (TME) oluşturan en önemli popülasyonlar arasındadır ve varlıkları genellikle kötü hasta prognozu ile bağlantılıdır16. TME'de mevcut olduğunda, fibrob...

Solid tümörler, tümör mikroçevresi (TME) tarafından yönlendirilen heterojen hücre popülasyonlarından oluşur, ancak hücrelerin çoğunun kökeni henüz keşfedilmemiştir. Esas olarak stromal ve immün hücreler (fibroblastlar, endotel hücreleri, monositler, makrofajlar, dendritik hücreler, B hücreleri, T hücreleri ve bunların alt kümeleri) akciğer, meme, böbrek ve diğer katı kanserlerdeki tümör heterojenliğini yansıtır 1,2,3. Her bir alt tipin kökenini ve trans-farklılaşma potansiyellerini anlamak, bu kanserlere karşı ileri tedaviler geliştirmek için son derece gereklidir. İnsan biyopsilerindeki bu çeşitli hücre popülasyonunun analizi, tümör tipi, bölgesi, evresi, numune miktarının sınırlandırılması ve hastaya özgü değişkenlikler nedeniyle çeşitli zorluklarla kendini göstermektedir4. Bu nedenle, sadece güvenilir değil, aynı zamanda in vivo tümör durumunu simüle edebilen, tümör-stroma çapraz konuşmasını ve hastalık patofizyolojisine katılımını incelemek için ideal olduğunu kanıtlayan deneysel bir modele ihtiyaç vardır.
Üç boyutlu (3D) çok hücreli tümör sferoid (MCTS) kültürleri, doğal muadillerine benzerlikleri nedeniyle tümörlerin in vitro model bir sistemidir. MCTS, katı tümörlerin yönlerini, mekansal mimarileri, fizyolojik tepkileri, çözünür mediatörlerin salınması, gen ekspresyon paternleri ve ilaç direnci mekanizmaları dahil olmak üzere 2D hücre kültürü modellerinden daha iyi çoğaltabilir. Ayrıca, MCTS'nin temel avantajlarından biri, tümör heterojenitesini ve tümör mikroçevresini (TME) incelemek için kullanılabilmesidir. Asılı bırakma yöntemi, MCTS5'i geliştirmek ve analiz etmek için en yaygın kullanılan araçtır. Bu yöntemde, ortama sahip farklı hücreler, tutarlı bir 3D agrega tarzında büyümesine izin veren ve inceleme için erişilmesi kolay olan damlacıklar şeklinde askıya alınır. Teknik basittir; çok fazla hücre gerektirmez ve küresel gelişim için agaroz gibi özel bir substratın gerekliliğini ortadan kaldırır6. Bu yöntemin ek bir avantajı, tekniğinin tekrarlanabilirliğinde yatmaktadır. Ayrıca, bu yöntem aynı zamanda erken tümör anjiyogenezini simüle etmek için endotel hücreleri ve tümör hücreleri gibi karışık hücre popülasyonlarını birlikte kültürlemek için de kullanılmıştır7.
Bu çalışmada, akciğer tümörü mikroçevresini taklit eden asılı damla yöntemi kullanılarak akciğer adenokarsinom hücreleri, fibroblastlar ve monositler ile çok hücreli 3D akciğer tümörü sferoidleri hazırlanmıştır. Daha sonra mitokondriyal sağlığı araştırmak için kanserle ilişkili fibroblast (CAF) popülasyonu izole edildi. Bu sferoidlerin geliştirilmesinin ardındaki ana fikir, sferoidlerdeki hücreler arasındaki çapraz konuşma, fibroblastları miyo-fibroblast benzeri aktif bir CAF durumuna dönüştürebileceğinden, CAF'ları izole etmektir. İkincisi, bu çalışma aynı zamanda anormal ROS üretiminin ve mitokondriyal disfonksiyonun normal fibroblastları daha agresif CAF fenotipine doğru nasıl yönlendirdiğini de gösterebilir. Tümör sferoidleri içinde toplanan fibroblastların, artmış ROS aktivitesi ve metabolik gen ekspresyonunun indüksiyonu ile miyofibroblastik özellikler kazandığı bulunmuştur. Bu protokol, tümör mikroçevresinin CAF'ı aktive etmedeki önemini vurgulamaktadır ve in vitro üretim ve CAF fenotipik özelliklerinin incelenmesi için mükemmel bir model olabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human &#945;-SMA</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>Cat# IC1420A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fibroblast microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-050-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549 lung adenocarcinoma cells</td>
			<td>NCCS Pune</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC-5 fetal lung fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 Human monocytes</td>
			<td>NCCS Pune</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>Cat# 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,6-dichloroindophenol (DCPIP)</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 55287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# C3099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCFDA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# D6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>Cat# 17892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 62858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZcoun Lactate Dehydrogenase Cell Assay Kit</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>Cat# CCK036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 87786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse heart Cytochrome c</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 81551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-iT Red hypoxia reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# H10498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# T3168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 69824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nacl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH MB Grade</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 54941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 85124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenazine methosulfate (PMS)</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 55782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>Cat# P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Cell Lysis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 4458235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# A7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# 205222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 89904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate hexahydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>Cat# 36313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO cDNA synthesis kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11754-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Cat# 172-5124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL core imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Serial Number F0518-1727-0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica fluorescent inverted microscope</td>
			<td>s</td>
			<td>DMi8 automated S/N 424150)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi MACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of mitochondrial health in cancer-associated fibroblasts isolated from 3d multicellular lung tumor spheroids

Kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF'lar), tümör mikroortamında bulunan ve tümör büyümesini ve ilerlemesini kolaylaştıran en bol stromal hücreler arasındadır. Tümör sekretumu, düşük dereceli inflamasyon, hipoksi ve redoks dengesizliği dahil olmak üzere tümör mikroçevresi içindeki karmaşıklık, heterotipik etkileşimi teşvik eder ve inaktif yerleşik fibroblastların aktif CAF'lar haline gelmesine izin verir. CAF'lar, glikolitik olarak daha aktif oldukları, daha yüksek seviyelerde reaktif oksijen türleri (ROS) ürettikleri ve laktat ihracatçısı MCT-4'ü aşırı eksprese ettikleri için normal fibroblastlardan (NF'ler) metabolik olarak ayırt edilirler ve bu da mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin (MPTP) açılmasına yol açar. Burada, insan akciğer adenokarsinom hücrelerinden (A549), insan monositlerinden (THP-1) ve insan akciğer fibroblast hücrelerinden (MRC5) oluşan çok hücreli 3D tümör sferoidlerinden izole edilen aktif CAF'ların mitokondriyal sağlığını analiz etmek için bir yöntem tanımlanmıştır. Tümör sferoidleri farklı zaman aralıklarında parçalandı ve manyetik aktive hücre sıralaması yoluyla CAF'lar izole edildi. CAF'ların mitokondriyal membran potansiyeli, JC-1 boyası, 2',7'-diklorodihidrofloresein diasetat (DCFDA) boyaması ile ROS üretimi ve izole CAF'larda enzim aktivitesi kullanılarak değerlendirildi. İzole CAF'ların mitokondriyal sağlığını analiz etmek, ters Warburg etkisinin daha iyi anlaşılmasını sağlar ve ayrıca metabolik akılar ve buna karşılık gelen düzenleyici mekanizmalar gibi CAF mitokondriyal değişikliklerinin akciğer kanseri heterojenliği üzerindeki sonuçlarını incelemek için de uygulanabilir. Bu nedenle, bu çalışma mitokondriyal sağlık üzerindeki tümör-stroma etkileşimlerinin anlaşılmasını savunmaktadır. Mitokondriyal spesifik ilaç adaylarını, tümör mikroortamında potansiyel terapötikler olarak CAF'lara karşı etkinlikleri açısından kontrol etmek için bir platform sağlayacak ve böylece akciğer kanseri progresyonunda CAF katılımını önleyecektir.

Şekil 1, mikroskop altında 7. gün ve 10. günde gözlemlendiği gibi asılı damla yöntemiyle üç farklı hücre popülasyonu (A549 (akciğer adenokarsinomu), MRC-5 (fibroblastlar) ve THP-1 (monositler) kullanılarak çok hücreli tümör sferoidlerinin gelişimini göstermektedir. 7. günde, sferoidler 260 ± 5.3 μm çapında kompakt ve sertti ve 10. günde sferoidler 480 ± 7.5 μm çapındaydı (Şekil 1A üst panel, Şekil ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids at JoVE.com

Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

Çok hücreli 3D tümör sferoidleri, akciğer adenokarsinom hücreleri, fibroblastlar ve monositler ile hazırlandı ve bunu kanserle ilişkili fibroblastların (CAF'lar) bu sferoidlerden izole edilmesi izledi. İzole CAF'lar, mitokondriyal transmembran potansiyelini, reaktif oksijen türlerini ve enzimatik aktiviteleri inceleyerek mitokondriyal sağlığı değerlendirmek için normal fibroblastlarla karşılaştırıldı.

3D Çok Hücreli Akciğer Tümörü Sferoidlerinden İzole Edilen Kanserle İlişkili Fibroblastlarda Mitokondriyal Sağlığın Değerlendirilmesi

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

Bu protokol, kanserle ilişkili fibroblastları veya CAF'yi aktive etmede tümör mikro ortamının önemini vurgulamaktadır. Fenotipik özellikleri incelemek için in vitro model mükemmel olabilir. CAF biyolojisindeki en büyük kısıtlamalar, primer tümör biyopsi örneklerinden CAF'nin sınırlı mevcudiyetidir.Dolayısıyla bu teknik, CAF biyolojisinin çeşitli yönlerini incelemek için kullanılabilir. Bu çalışmada anormal çapraz üretim ve CAF aktivasyonu ile ilişkili mitokondriyal disfonksiyon kötü tümör prognozuna yol açmıştır. Bu yöntemin uygulanması, tümörün travma etkileşimlerini, özellikle CAF aktivasyonunu ve mitokondriyal sağlığı değerlendirmek için yararlı olacaktır.Yeni uyuşturucu hedeflerini keşfetmek için. Bireyler bu tekniği uygulamadan önce hücre prosedüründe deneyim sahibi olmalıdır. Bu tekniğin görsel olarak gösterilmesi, CAF popülasyonunu tümör sferoidlerinden izole etmedeki kritik adımların ve CAF biyolojisini incelemek için aşağı akış uygulamalarının anlaşılmasını sağlayacaktır.Laboratuvarımın asistanları Bayan Leena Arora, Bayan Moyna Kalia ve Bayan Soumyajit Roy deneyleri gerçekleştiriyor. DMEM'deki insan akciğer adenokarsinomu A549 ve insan akciğer fibroblastı MRC-5 yapışkan hücreleri ve RPMI'daki insan monositleri THP-1 hücreleri, T25 şişelerinde% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derecede büyüme ortamını tamamlamaya başlamak için.Üç gün sonra,% 80 ila% 85 hücre akıtlığında, A549 ve MRC-5 hücrelerini bir dakika boyunca bir mililitre PBS ile yıkayın. Daha sonra, hücreleri 37 santigrat derecede beş dakika boyunca 500 mikrolitre% 0.25 tripsin EDTA çözeltisi ile inkübe ederek hasat edin. Ardından, tripsini inaktive etmek için hemen dört mililitre tam büyüme ortamı ekleyin.Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe toplayın ve beş dakika boyunca 125 x g'de toplayın. Süpernatantı çıkarın ve hücreleri beş mililitrelik tam bir büyüme ortamında yeniden askıya alın. Çok hücreli tümör sferoidlerini oluşturmak için, bir mililitre hacim için bir hücre sayacı kullanarak A549, MRC-5 ve THP-1 hücre numaralarını sayın.Saydıktan sonra, hücre süspansiyonunu 5: 4: 1 oranında hazırlayın ve tam DMEM ile hacmi bir mililitreye kadar yapın. Daha sonra, 90 milimetrelik bir kültür kabının kapağına 25 mikrolitre hücre süspansiyon karışımı damlası yerleştirin. Tabağın dibini 10 mililitre steril suyla doldurun.Kapağı suyla dolu hidrasyon odasının üzerine dikkatlice ters çevirin ve çanağı üç gün boyunca bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Dördüncü günde, sferoidleri mikroskop altında izleyin. Görüntü almak için güç düğmesini açın.90 milimetrelik kültür kabını sahneye yerleştirin ve 10 x büyütmeyi seçin. Lensleri ayarlayın ve hücre toplanmasını ve çoğalmasını analiz etmek için hücreleri inceleyin. Görüntüyü yakalamak için sağlanan dondurma ve kaydetme düğmelerine basın.Görüntülemeden sonra, her damlacıktan 20 mikrolitre ortamı taze bir ortamla dikkatlice aspire ederek büyüme ortamını değiştirin. Live-dead görüntüleme için, birinci anahtar olan Ctr advanced'i, ardından CPU'yu açın ve yazılım sisteminin önyüklenmesini bekleyin. Önyüklendiğinde, sferoidler içeren 90 milimetrelik çanağı ters floresan mikroskobun sahnesine yerleştirin.Ardından, yazılımdaki floresan seçeneğini seçerek ve calcein ve Texas Red kanalı için FITC'yi seçerek görüntüleri 10 x büyütmede gözlemleyin ve yakalayın. Ardından, görüntüyü canlı olarak yayınlayın ve görüntüleyin seçeneğini belirleyin. Uygun optimizasyon için floresan yoğunluğunu ayarlayın ve güvenli düğmeye tıklayın.Bir mililitrelik pipet ve 15 mililitrelik bir tüp kullanarak her biri yedi ve 10. günde 200 tümör, sferoid toplayın. Daha sonra sferoidleri beş dakika boyunca 125 x g'de santrifüjleme ile pelet edin ve süpernatanı dikkatlice aspire edin. Sferoidleri 200 mikrolitre PBS ile yıkayın, tekrar santrifüj yapın ve süpernatanı atın.Küresel parçalanma için 400 mikrolitre% 0.25 tripsin EDTA çözeltisi ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Sferoidlerin tamamen parçalanması için kuvvetli pipetleme yapın. Bir mililitre tam DMEM büyüme ortamı ekleyerek tripsini nötralize edin.Daha sonra küresel süspansiyonu santrifüj edin ve peleti bir mililitre tam DMEM ortamında yeniden askıya almadan önce süpernatantı atın. Gösterildiği gibi toplam hücre sayısını sayın. Kanserle İlişkili Fibroblastların veya CAF'ların tümör sferoidlerinden izolasyonu için, 80 mikrolitre soğuk manyetik aktif hücre sıralama veya MACS tamponunda yedinci hücrelere 1 x 10 oranında yeniden askıya alın.Hücre süspansiyonuna 20 mikrolitre anti-fibroblast mikroboncuk ekleyin, tüpe hafifçe dokunarak ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe ederek iyice karıştırın. Kuluçkadan sonra, hücreleri bir mililitre soğuk MACS tamponu ile yıkayın. Daha sonra, peleti 500 mikrolitre MACS tamponunda yeniden askıya almadan önce süpernatantı santrifüj edin ve aspire edin.Manyetik boncuk bazlı hücre ayrımı için, MACS sütununu üç mililitre MACS tamponu ile durulayarak hazırlayın. Hücre süspansiyonunu sütuna yerleştirin ve etiketsiz hücre popülasyonunu içeren akışı toplayın. Ardından, separatörden çıkarmadan önce sütunu üç mililitre MACS tamponu ile üç kez yıkayın.Ardından sütunu toplama tüpüne yerleştirin. Anti-fibroblast mikroboncuk etiketli hücreleri, beş mililitre MACS tamponu ekleyerek ve pistonu kolona sıkıca iterek toplayın. Aşağı akış uygulamalarına geçmeden önce etiketli hücreleri santrifüj yapın.İzole edilmiş CAF'ların sayısını sayın ve akış sitometrisi analizi için dördüncü hücrelere yaklaşık 6 x 10 kullanın. Hücreleri PBS ile bir kez yıkayın, ardından süpernatanı santrifüj yapın ve aspire edin. Daha sonra, 100 mikrolitre hücre geçirgenlik tamponu ekleyin ve tek bir hücre süspansiyonunu korumak için aralıklı vorteksleme ile hücreleri 30 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.Yine, santrifüjleme ve hücreleri geçirgenlik tamponunda yeniden askıya aldıktan sonra, iki mikrolitre APC konjuge anti-insan alfa SMA antikoru ekleyin ve 45 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, fazla antikoru gidermek için bir mililitre geçirgenlik tamponu ve santrifüj ekleyin. Akış sitometrisi için peleti 400 mikrolitre geçirgenlik tamponunda yeniden askıya alın.ACTA2 pozitif hücreleri, hücre popülasyonlarını ileri ve yan saçılmalarına göre ayırt ettikten sonra seçin. Tekli popülasyonun seçilmesi ve ardından tek parametreli histogramda tek bir tepe noktası olarak görünen ACTA2 pozitif hücrelerinin seçilmesi. Çok hücreli tümör sferoidlerinin gelişimi ve canlı-ölü analizi burada gösterilmiştir.Yedinci günde, sferoidler yaklaşık 260 mikron çapında kompakt ve sertti. 10. günde, sferoidlerin çapı 480 mikrondu. Hücre canlılığı testinde, propidium iyodür floresansında bir azalma ve yedinci günden 10. güne kadar kalsein-floresansında bir artış gözlenmiştir.Hipoksik boyama, günün merkezinde 10 sferoid hipoksik bir çekirdek ortaya çıkardı. Ayrıca, E-kadherin ve Mki-67 gen ekspresyonunun yukarı regülasyonu, tümör sferoid oluşum günlerindeki artışla birlikte gözlenmiştir. 10. gün tümör sferoidlerinden izole edilen CAF'lar yaklaşık% 69 ACTA2 pozitifti.CAF'lar, MRC-5 fibroblastlarına kıyasla ACTA2'de üç kat ve kollajen tip 1 alfa 2 zincirinde on kat yukarı regülasyon gösterdi. 10. gün tümör sferoidlerinde ROS düzeylerinde yedinci güne kıyasla anlamlı bir artış gözlendi ve bu da ROS üretiminin CAF aktivasyonuna olası katılımını düşündürdü. Yedinci gün ve 10. gün tümör sferoidlerinden izole edilen CAF'larda hücresel ROS seviyelerinde anlamlı bir artış gözlenmiştir.Ayrıca, JC-1 boyaması ile mitokondriyal membran potansiyelinde bir değişiklik görülmüştür. Normal fibroblastlara kıyasla CAF'larda GLUT1 ve MCT4 gen ekspresyonunun indüksiyonu gözlendi. CAF'larda laktat dehidrojenaz, Sitokrom C oksidaz ve süksinat dehidrogenaz enzim aktivitesinin normal fibroblastlara göre anlamlı indüksiyonu gözlendi.3D çok hücreli tümör sferoidinin başarılı gelişimi için A549, MRC-5 ve THP-1 hücrelerinin 5: 4: 1 oranı kullanılmalıdır. Fibroblast popülasyonu, tümör sferoidlerinin sertliği için kritik öneme sahiptir. Katyon çözeltisi ve karakterizasyonuna benzer şekilde, bu tümör sferoidi, tümör progresyonunda bir suç ortağı olan tümörle ilişkili makrofaj hücresi popülasyonunu elde etmek için de kullanılabilir.Bu sferoid analiz, kanserli hücrelerin fibroblastı nasıl geçtiğini anlamamıza yardımcı olacaktır ve ayrıca mitokondriyal spesifik ilaç adaylarını kontrol etmek için de kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

Akciğer tümör hücre işe alım tahlil

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Kanser Araştırmaları

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Vivo EPR pH, pO2, Redox durumu ve fosfat konsantrasyonları ve glutatyon tümör Microenvironment olarak değerlendirilmesi

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Tümör hücre görselleştirme akciğer dokusu içinde dolaşan bir akciğer kolonizasyon tahlil kurulması

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Kanser Ilişkili fibroblastlar farklılaşma ve Invazyon In vitro etütler için daha fizyolojik bir sistem olarak bir 3D Küroid modeli

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

İnce Barsak Nöroendokrin Tümör Spheroidlerinin Kurulması ve Karakterizasyonu

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Ultrason Görüntüleme ile Farelerde Akciğer Tümörü İlerlemesinin Saptanması

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Kanserle İlişkili Fibroblastların Tümör Büyümesindeki Rolünü Araştırmak İçin Bir Fare Modeli

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Hedeflenen Nanopartiküllerin Çalışması için Meme Kanserinin Singeneik Murine Modelinden Primer Kanserle İlişkili Fibroblastların İzolasyonu

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Hücre Dışı Akı Analizi Kullanarak Tek 3D Mikrodoku Sferoidlerinin Mitokondriyal Enerji Metabolizmasını Keşfetmek

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Hasta Kaynaklı Tümör Örneklerinden 3 Boyutlu Sferoidlerin Oluşturulması ve İlaçlara Duyarlılıklarının Değerlendirilmesi

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...