Name: automatic separation and collection of cancer-related substances from clinical samples
Uploaded: 2023-01-13T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automatic Separation and Collection of Cancer-Related Substances from Clinical Samples at JoVE.com

כתב יד זה נתמך בחלקו על ידי הקרן לפיתוח מכשור רפואי בקוריאה (KMDF, מענק מס 'RS-2020-KD000019) והמכון לפיתוח תעשיית הבריאות של קוריאה (KHIDI, מענק מס' HI19C0521020020).

כל דגימות הדם השלמות התקבלו מחולי סרטן ריאות. המחקר והניתוח בקלינומיקס מתבצעים על ידי המכון לחקר גנומיקה של סרטן, ואישור מחקר IRB על ידי הממשלה מובל על ידי ועדת הביקורת המוסדית של המרכז הרפואי אסאן (IRB NO. 2021-0802) עם מספר IRB רשום למחקר בקלינומיקס.
1. הכנת מדגם
<ol><li>אסוף 9 מ"...

<ol>
	<li>Babayan, A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+liquid+biopsy+approaches+for+early+detection+and+monitoring+of+cancer.">Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer.</a> Genome Medicine. 10 (1), 21 (2018).</li><li>Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy:+monitoring+cancer-genetics+in+the+blood.">Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).</li><li>Bardelli, A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies,+what+we+do+not+know+(yet).">Liquid biopsies, what we do not know (yet).</a> Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).</li><li>Mattox, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+liquid+biopsies+for+cancer.">Applications of liquid biopsies for cancer.</a> Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).</li><li>Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+liquid+biopsies+for+the+early+detection+of+cancer.">The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer.</a> NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36 (2017).</li><li>Scudellari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myths+that+will+not+die.">Myths that will not die.</a> Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).</li><li>Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+oncology:+origins,+optimism,+and+potential.">Precision oncology: origins, optimism, and potential.</a> The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).</li><li>Prasad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspective:+The+precision-oncology+illusion.">Perspective: The precision-oncology illusion.</a> Nature. 537 (7619), 63 (2016).</li><li>Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+liquid+biopsies+into+the+management+of+cancer.">Integrating liquid biopsies into the management of cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-and+late-stage+human+malignancies.">Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies.</a> Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).</li><li>Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+distribution+of+cell-free+DNA+in+oncology.">Size distribution of cell-free DNA in oncology.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455 (2021).</li><li>Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+(CTC)+detection:+clinical+impact+and+future+directions.">Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions.</a> Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).</li><li>Loeian, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+using+the+nanotube-CTC-chip:+capture+of+invasive+CTCs+with+high+purity+using+preferential+adherence+in+breast+cancer+patients.">Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients.</a> Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).</li><li>Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugation+affects+the+purity+of+liquid+biopsy-based+tumor+biomarkers.">Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers.</a> Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+isolation,+culture,+and+downstream+molecular+analysis.">Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis.</a> Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).</li><li>Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+and+next-generation+sequencing+in+the+service+of+personalized+medicine+for+lung+cancer.">Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer.</a> Oncotarget. 7 (43), 71013 (2016).</li><li>Lowes, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+(CTC)+and+cell-free+DNA+(cfDNA)+workshop+2016:+scientific+opportunities+and+logistics+for+cancer+clinical+trial+incorporation.">Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505 (2016).</li><li>Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+of+cell-free+DNA+in+different+tumor+types.">Concentration of cell-free DNA in different tumor types.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).</li><li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+as+an+indicator+of+early+and+systemic+recurrence+after+surgical+resection+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).</li><li>Heidrich, I., A&#269;kar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies:+Potential+and+challenges.">Liquid biopsies: Potential and challenges.</a> International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).</li><li>Celec, P., Vlkov&#225;, B., Laukov&#225;, L., B&#225;b&#237;&#269;kov&#225;, J., Boor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA:+the+role+in+pathophysiology+and+as+a+biomarker+in+kidney+diseases.">Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1 (2018).</li><li>Thierry, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+quantification+of+circulating+DNA+in+mice+with+human+colorectal+cancer+xenografts.">Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).</li><li>Moreira, V. G., de la Cera Mart&#237;nez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+and+clearance+of+cell-free+plasma+DNA+in+hemodialysis+quantified+by+real-time+PCR.">Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).</li><li>Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+clearance+kinetics+and+liver+uptake+of+mononucleosomes+in+mice.">Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice.</a> Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).</li><li>Meng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+in+patients+with+breast+cancer+dormancy.">Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy.</a> Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).</li><li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+circulating+tumour+cell+research.">Challenges in circulating tumour cell research.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+circulating+tumor+cells+in+non-small-cell-lung-cancer+patients+using+a+multi-flow+microfluidic+channel.">Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 5 (1), 8 (2019).</li><li>Sajay, B. N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+optimal+and+unbiased+approach+for+tumor+cell+isolation.">Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation.</a> Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).</li><li>Bailey, P. C., Martin, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+CTC+biology+and+clinical+impact+emerging+from+advances+in+capture+technology.">Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology.</a> Cells. 8 (6), 553 (2019).</li><li>Ahn, S. M., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body+fluid+proteomics:+Prospects+for+biomarker+discovery.">Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery.</a> Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).</li></ol>

הכמות והריכוז של cfDNA ו- CTC תלויים באדם, בשלב ובסוג הסרטן. זה גם תלוי במצבו של המטופל 2,4,5,10,20. בפרט, בשלבים המוקדמים או הטרום סרטניים של סרטן, הריכוזים של חומרים הקשורים לסרטן הם נמוכים מאוד, ולכן קיימת אפש...

גילוי מוקדם ומדויק של מחלות שונות, כולל סרטן, הוא הגורם החשוב ביותר בקביעת אסטרטגיית טיפול 1,2,3,4. בפרט, גילוי מוקדם של סרטן קשור קשר הדוק עם סיכויי הישרדות מוגברים עבור המטופל 5,6,7,8. לאחרונה, ביופסיות נוזליות היו באור הזרקורים לגילוי מוקדם של סרטן. גידולים מוצקים עוברים אנגיוגנזה ומשחררים חומרים שונים לדם. בפרט, דנ"א במחזור (ctDNAs), רנ"א במחזור (ctRNAs), חלבונים, שלפוחיות כגון אקסוזומים ותאי גידול במחזור הדם (CTCs) נמצאו בדמם של חולי סרטן 2,9. למרות שיש הבדלים בכמות החומרים הללו, הם נצפים בעקביות לא רק בשלבים המוקדמים אלא גם בשלבים מאוחרים יותר 6,10. עם זאת, הבדלים בודדים אלה הם גבוהים מאוד; לדוגמה, כמות הדנ"א נטול התאים (cfDNA) המכילה ctDNA היא פחות מ-1,000 ננוגרם, ומספר ה-CTCs קטן מ-100 ב-10 מ"ל של דם שלם מחולי סרטן11,12,13. מחקרים רבים אפיינו סרטן בשימוש בחומרים אלה בכמויות קטנות יותר (כלומר, cfDNA, ctDNA ו- CTCs). כדי להשיג תוצאות מדויקות, חשוב להפריד במדויק כמויות קטנות של חומרים עם טוהר גבוה13,14. שיטות צנטריפוגה קונבנציונליות משמשות בדרך כלל, אך הן קשות לטיפול ויש להן טוהר נמוך בהתאם למיומנות המשתמש. מאז גילוי ה-CTCs, פותחו מספר טכניקות הפרדה, כגון צנטריפוגה או הפרדת דרגות צפיפות, אימונובייד ושיטות מיקרופלואידיות. מספר טכניקות הכלה פותחו מאז גילוי CTCs. עם זאת, טכניקות אלה מוגבלות לעתים קרובות כאשר יש צורך לבודד תאים מן השבבים השונים ואת הממברנות המשמשים לבודד אותם15. כמו כן, שיטות התיוג דורשות ציוד כגון FACS, ויש מגבלות לתהליך במורד הזרם עקב זיהום תיוג.
לאחרונה, השימוש בביופסיות נוזליות גדל, ומחקרים שונים נערכים לגילוי מוקדם של סרטן. למרות ששיטה זו פשוטה, עדיין ישנם קשיים בניתוח במורד הזרם, ומחקרים שונים מנסים להתגבר על קשיים אלה16,17. בנוסף, אתרים רבים, כולל בתי חולים, דורשים שיטות אוטומטיות, ניתנות לשחזור וטוהר גבוה הנוחות לשימוש. כאן פיתחנו מעבדה על דיסק להפרדה אוטומטית של חומרים מדגימות דם לאחר ביופסיה נוזלית. התקנים אלה מבוססים על העיקרון של צנטריפוגה, מיקרופלואידיקה ולכידת תאים בגודל נקבוביות. ישנם שלושה סוגים של דיסקים: LBx-1 יכול לרכוש פלזמה וציפוי באפי, בעוד LBx-2 יכול לרכוש פלזמה ו- PBMC מדם שלם עם נפח של פחות מ -10 מ"ל; FAST-auto יכול גם לרכוש CTCs באמצעות קרום הניתן להסרה מהדיסק. ניתן להשתמש בעד ארבעה מכל דיסק בהפעלה אחת. מעל לכל, היתרון של מכשיר ושיטה זו הוא כי הוא יכול לקבל מגוון רחב של חומרים שמקורם בסרטן מאותה דגימה באמצעות כמות קטנה של דם. משמעות הדבר היא כי הדם של המטופל רק צריך להיות נמשך פעם אחת. בנוסף, יש לו את היתרון של אי הכללת טעויות עקב הבדלים בתקופת דגימת הדם. פלטפורמה זו קלה לשימוש ומספקת תוצאות מדויקות עבור ביופסיות נוזליות ויישומים במורד הזרם. בפרוטוקול זה, השימוש במכשיר ובמחסנית מוצג.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4150 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2992AA</td>
			<td>Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit&#160;</td>
			<td>Apostle</td>
			<td>A17622-250</td>
			<td>5 mL X 50 preps version</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer blood collection tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>367525</td>
			<td>EDTA Blood Collection Tube (10 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioViewCCBS</td>
			<td>Clinomics</td>
			<td></td>
			<td>BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MHCD4522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAST Auto cartridge</td>
			<td>Clinomics</td>
			<td>CLX-M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBx-1 cartridge</td>
			<td>Clinomics</td>
			<td>CLX-M4101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBx-2 cartridge</td>
			<td>Clinomics</td>
			<td>CLX-M4201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPR-2000 instrument</td>
			<td>Clinomics</td>
			<td>CLX-I2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass</td>
			<td>Marienfeld Superior</td>
			<td>HSU-0101040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag 2 Magnet Stand</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque Solution</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>density gradient solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tip, 10 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AX-TF-10</td>
			<td>Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tip, 200 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AX-TF-200</td>
			<td>Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tip, 100 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AX-TF-100</td>
			<td>Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tip, 1000 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AX-TF-1000</td>
			<td>Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>324204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>433284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Science Wipers</td>
			<td>Yuhan-Kimberly</td>
			<td>41117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex glove</td>
			<td>Microflex</td>
			<td>63-754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Bead Separation Rack</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>VP 772F2M-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Pipetting&#160; (0.5-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Pipetting&#160; (2-20 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Pipetting&#160; (10-100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Pipetting&#160; (20-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Pipetting&#160; (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium With DAPI&#160;- Aqueous, Fluoroshield</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Human IgG Control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1-001-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS BX-UCB</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>9217316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>53-9003-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffered Saline Solution)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040CVC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet Aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4-000-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Glass</td>
			<td>Marienfeld Superior</td>
			<td>HSU-1000612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StainTray Staining box</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Serological Pipette (10 mL)</td>
			<td>SPL</td>
			<td>91010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160;X-100 solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN&#160;20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole Blood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stored at 4-8 &#176;C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator)</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>010-00157</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automatic separation and collection of cancer-related substances from clinical samples

לאחרונה, ביופסיות נוזליות שימשו לאבחון מחלות שונות, כולל סרטן. נוזלי גוף מכילים חומרים רבים, כולל תאים, חלבונים וחומצות גרעין שמקורם ברקמות רגילות, אך חלק מחומרים אלה מקורם גם באזור החולה. החקירה והניתוח של חומרים אלה בנוזלי הגוף ממלאים תפקיד מרכזי באבחון מחלות שונות. לכן, חשוב להפריד במדויק את החומרים הנדרשים, וכמה טכניקות מפותחות לשימוש למטרה זו.
פיתחנו סוג מעבדה על דיסק של מכשיר ופלטפורמה בשם CD-PRIME. מכשיר זה הוא אוטומטי ויש לו תוצאות טובות עבור זיהום מדגם ויציבות הדגימה. יתר על כן, יש לו יתרונות של תשואת רכישה טובה, זמן פעולה קצר, ושכפול גבוה. בנוסף, בהתאם לסוג הדיסק שיש להרכיב, ניתן להפריד פלזמה המכילה DNA ללא תאים, תאי גידול במחזור, תאים חד-גרעיניים של דם היקפי או ציפויי באפי. לפיכך, רכישת מגוון חומרים הנמצאים בנוזלי הגוף יכולה להיעשות עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם, כולל המחקר של omics.

המטרה של טכניקה זו היא לבודד בקלות ובאופן אוטומטי חומרים הקשורים לסרטן מדם שלם. בפרט, כל אחד יכול להשתמש בטכניקה זו בכל תחומי המחקר והניתוח המתאימים. ההפרדה בו זמנית וניתנת לשחזור של חומרים מרובים בדגימת דם אחת היא משמעותית בביופסיות נוזליות. דיסקיות LBx-1 ו- LBx-2 משמשות לבידוד פלזמה וציפוי בא...

Watch this Scientific Journal Video about Automatic Separation and Collection of Cancer-Related Substances from Clinical Samples at JoVE.com

Automatic Separation and Collection of Cancer-Related Substances from Clinical Samples

מאמר זה מתאר את היישום של ציוד אוטומטי כדי להפריד ולאסוף בקלות וביעילות, כגון DNA ללא תאים ותאי גידול במחזור, מדם שלם.

הפרדה ואיסוף אוטומטיים של חומרים הקשורים לסרטן מדגימות קליניות

Recently, liquid biopsies have been used to diagnose various diseases, including cancer. Body fluids contain many substances, including cells, proteins, ...

הפרוטוקול שלנו ידידותי למשתמש. באמצעות טכניקה זו, כל אחד יכול בקלות לבודד רכיב מן הדם. ניתן למזער את הזיהום ולהפריד חומרים בצורה מדויקת.עם אוטומציה והקמת פרוטוקול זה, חוקרים יכולים להשיג בקלות חומרים הקשורים לסרטן עם טוהר גבוה, אשר מועיל עבור מחקרים שונים במורד הזרם. בפרט, הוא צפוי לספק יתרונות חשובים למחקר משתמשי הקצה. מי שידגים את ההליך שלהם יהיה ג'יי ג'ונג, חוקר בכיר ועוזר מנהל במכון לחקר הגנומיקה של הסרטן.כדי להתחיל, טען את מחסנית LBx 1 על-ידי בחירת סוג המחסנית בלוח מסך המגע של המכשיר. לחץ על לחצן החץ כדי לשנות את מספר הדוגמאות. לאחר מכן, פתח את דלת המכשיר והכנס את כל המחסניות לשימוש לפי סדר המספר על מחזיק המחסנית.לקבלת ארבע מחסניות בסך הכל, הנח את מחסנית הדמה בשטח הריק של מחזיק המחסנית. השתמש בגלגל התמיכה כדי להרכיב את המחסנית ולהדק את אום הנעילה כדי לאבטח אותה. סגור את הדלת ולחץ על לחצן ההפעלה במסך לוח המגע.המכשיר סוגר את השסתומים במחסניות דבר שאורך כ-30 שניות. עקוב אחר ההודעה כדי לפתוח את הדלת. הסר את גלגל התמיכה והסר את המחסנית הסגורה באמצעות שסתום ממחזיק המחסנית.פיפטה מקסימום של 10 מיליליטר של דגימת דם שלמה באמצעות פיפטה סרולוגית. הכנס את קצה הפיפטה עמוק לתוך פתח הדגימה של המחסנית, והזריק באיטיות את כל דגימת הדם. לאחר הכנסת המחסניות למכשיר, סגור את דלת המכשיר ולחץ על כפתור אישור.פרווה פלזמה ובאפי מופרדים באופן אוטומטי מדם שלם, אשר לוקח בערך 30 דקות. לאחר הפרדת הפלזמה ומעיל הבאפי, תופיע הודעה על המסך מלווה בצליל אזעקה. עצור את האזעקה על-ידי פתיחת הדלת או לחיצה על לחצן העצירה.פתח את הדלת. הסר את המחסנית והנח אותה על השולחן. לשחזר שלושה מיליליטר של פלזמה מן מוצא פלזמה באמצעות קצה פיפטה של מיליליטר אחד.לאחר מכן, החזירו שלושה מיליליטרים של ציפוי באפי משקע מעיל באפי באמצעות קצה פיפטה של מיליליטר אחד. לאחר מכן, טען את מחסנית LBx 2 על ידי בחירת שם המחסנית בלוח מסך המגע של המכשיר. לחץ על לחצן החץ כדי לשנות את מספר הדוגמאות ובצע את אותו הליך המוצג עבור מחסנית LBx 1 כדי להכניס את המחסנית למחזיק המחסנית.לאחר הכנסת המחסנית וסגירת הדלת, לחץ על לחצן ההפעלה במסך לוח המגע. בצע את ההליך שהוצג קודם לכן כדי להסיר את המחסנית הסגורה באמצעות שסתום ממחזיק המחסנית ולהניח אותה על השולחן. פיפטה את תמיסת גרדיאנט הצפיפות באמצעות פיפטה סרולוגית.הכנס את קצה הפיפטה עמוק לתוך הכניסה של המחסנית ולהזריק לאט את התמיסה. לאחר מכן, פיפטה את כל דגימת הדם ולהזריק אותה באיטיות לתוך פתח הדגימה. לאחר הכנסה ואבטחה של המחסנית, סגור את הדלת ולחץ על כפתור אישור.לאחר שהפלזמה וה- PBMC מופרדים באופן אוטומטי מדם שלם, תופיע הודעה המלווה בצליל אזעקה. פתח את הדלת והסר את המחסנית. לשחזר שלושה מיליליטר של פלזמה מן מוצא פלזמה באמצעות קצה פיפטה של מיליליטר אחד, ולאחר מכן, לשחזר שלושה מיליליטר של PBMC מן מוצא PBMC.באופן דומה, עבור מחסנית FAST-auto, לאחר הסרת המחסנית הסגורה בשסתום ממחזיק המחסנית, הזרקת שישה מיליליטר של פתרון PBS לכניסת PBS של המחסנית. לאחר מכן, פיפטה שלושה מיליליטר של דם שלם או מעיל באפי שהתקבלו LBx 1, או דגימת PBMC המתקבלת LBx 2, ולאט לאט להזריק את הדגימה לתוך פתח הדגימה של המחסנית. לאחר הכנסת המחסנית ואבטחתה, סגור את הדלת ולחץ על כפתור אישור.לאחר השלמת ההעשרה האוטומטית של CTCs, הפסק את האזעקה. הסר את המחסנית והכנס את מסיר הלוח האחורי, או BPR, לארבעת החורים בחזית המחסנית. לחץ על הכנף הכחולה כהה עם האגודלים של שתי הידיים ולאחר מכן, לחץ על הגוף הכחול בהיר עד שהוא לוחץ.הסר בזהירות את גוף המחסנית על ידי הרמתו. בעדינות רבה, להרים את קרום המסנן על ידי הקצה באמצעות פינצטה, ומניחים את הממברנה לתוך צינור 1.5 מיליליטר להכנת חומצת גרעין, או על זכוכית שקופית עבור מכתים. במידת הצורך, לשחזר את הדם מסונן לשקע הדם באמצעות קצה פיפטה של מיליליטר אחד.ה-cfDNAs שחולצו הוערכו באמצעות Bioanalyzer, וקלטות מסך cfDNA שימשו יחד עם סולם אלקטרוני. הקו הירוק שימש ליישור הסולם והמדגם. סימני המשולש מציינים את רצועת הדנ"א.לרוב cfDNA יש אורך של 166 זוגות בסיסים וחלקם קיימים בכפולות שלמות של אורך. בדרך כלל, הריכוז של cfDNA מודד עד גודל של 50 עד 700 זוגות בסיסים. למרות שיש הבדל בכמות המתקבלת מכל דגימה בודדת, כגון 8.47 ננוגרם למיליליטר, ו-5.2 ננוגרם למיליליטר, התוצאות של מיצוי cfDNA היו טובות הן לריכוז והן לחלוקת הגודל בכל המקרים.תוצאות אלה מצביעות על כך ששיטת LBx 1 מפרידה במדויק בין פלזמה המכילה cfDNA. ב-FAST-auto, הממברנה הוסרה והוכתמה בנוגדנים פלואורסצנטיים כדי לזהות CTCs ותאי דם לבנים. הממברנה המוכתמת, שהונחה על שקופיות זכוכית, נצפתה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.לאחר צביעת הממברנה, תאים מראים DAPI או אותות חיוביים גרעיניים בכחול, בעוד EpCAM ו- CK או CTCs חיוביים מודגשים בירוק, ו- CD45 או WBC חיובי מודגשים באדום. זה לא קשה להסיר את הממברנה. עם זאת, יש צורך להיזהר על אובדן וזיהום של CTCs.דם שלם, PBMC ומעיל באפי זמינים כולם. במקום זאת, אתה רק צריך להגדיר את עוצמת הקול כולה. ניתן להשתמש גם בנוזלים אחרים, אם כי יידרשו בדיקות.טכניקה זו יכולה להיות מופעלת ישירות בבתי חולים ואת החומר ניתן להשיג במהירות.

automatic-separation-collection-cancer-related-substances-from

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ultrasonographic Evaluation of Breast Cancer-related Lymphedema

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet exists. Progressive Resistance Exercise (PRE) is expected to improve lymphedema without additional swelling. This study showed the therapeutic effects of PRE on lymphedema by using ultrasonography to measure the change in thickness of the muscle and subcutaneous tissue. The thickness of subcutaneous tissue decreased more in the PRE group than in the non-PRE group. Ultrasonography is widely used in many clinics because of its easy accessibility, safety, and inexpensiveness. Ultrasound is one of the best tools for diagnosing and determining treatment efficacy on breast cancer-related lymphedema (BCRL).

This study utilized ultrasonography for diagnosis and follow-up tests to confirm treatment efficacy of Progressive Resistance Exercise (PRE) in breast cancer-related lymphedema (BCRL). Ultrasonography can be applied effectively to ensure diagnosis and treatment of lymphedema.

הערכת Ultrasonographic של Lymphedema סרטן הקשורים השד

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. In the clinical setting, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues are widely used for genetic testing. However, FFPE DNA is generally damaged and fragmented during the fixation process with formalin. Therefore, FFPE DNA is sometimes not adequate for genetic testing because of low quality and quantity of DNA. Here we present a method of touch imprint cytology (TIC) to obtain genomic DNA from cancer cells, which can be observed under a microscope. Cell morphology and cancer cell numbers can be evaluated using TIC specimens. Furthermore, the extraction of genomic DNA from TIC samples can be completed within two days. The total amount and quality of TIC DNA obtained using this method was higher than that of FFPE DNA. This rapid and simple method allows researchers to obtain high-quality DNA for genetic testing (e.g., next generation sequencing analysis, digital PCR, and quantitative real time PCR) and to shorten the turnaround time for reporting results.

Obtaining high-quality genomic DNA from tumor tissues is an essential first step for analyzing genetic alterations using next generation sequencing. In this article, we present a simple and rapid method to enrich tumor cells and obtain intact DNA from touch imprint cytology specimens.

שיטה פשוטה ומהירה להשיג גידול איכותיים הדנ א של דגימות קליני-פתולוגיים באמצעות מגע ההטבעה ציטולוגיה

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to objectively measure the severity of this condition. Here we describe an optimized method for assessing mitochondrial function of PBMCs collected from fatigued cancer patients. Using a compact extracellular flux system and sequential injection of respiratory inhibitors, we examined PBMC mitochondrial functional status by measuring basal mitochondrial respiration, spare respiratory capacity, and energy phenotype, which describes the preferred energy pathway to respond to stress. Fresh PBMCs are readily available in the clinical setting using standard phlebotomy. The entire assay described in this protocol can be completed in less than 4 hours without the involvement of complex biochemical techniques. Additionally, we describe a normalization method that is necessary for obtaining reproducible data. The simple procedure and normalization methods presented allow for repeated sample collection from the same patient and generation of reproducible data that can be compared between time points to evaluate potential treatment effects.

Our goal was to develop a practical protocol to evaluate mitochondrial dysfunction associated with fatigue in cancer patients. This innovative protocol is optimized for clinical use involving only standard phlebotomy and basic laboratory procedures.

הערכת תפקידה של פונקציית מיטוכונדריאלי עייפות הקשורים לסרטן

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer (NSCLC). Testing for PD-L1 expression with the PD-L1 immunohistochemistry (IHC) 22C3 companion diagnostic assay, which gives a tumor proportion score (TPS), has been validated on tumor tissue. We developed an optimized laboratory-developed test (LDT) that uses the 22C3 antibody (Ab) concentrate on a widely available IHC autostainer for biopsy and cytology specimens. The PD-L1 TPS was evaluated with 120 paired whole-tumor tissue sections and biopsy samples and with 70 paired biopsy and cytology samples (bronchial washes, n = 40; pleural effusions, n = 30). The 22C3 Ab concentrate-based LDT showed a high concordance rate between biopsy (~100%) and cytology (~95%) specimens when compared to PD-L1 IHC expression determined using the PD-L1 IHC 22C3 companion assay at both TPS cut points (&#8805;1%, &#8805;50%). The optimized LDT presented here, using the 22C3 Ab concentrate to determine the PD-L1 expression in both tumor tissue and in cytology specimens, will expand the ability of laboratories worldwide to assess the eligibility of patients with NSCLC for treatment with pembrolizumab monotherapy in a reliable and reproducible manner.

To expand the ability of laboratories worldwide to assess the eligibility of patients with lung cancer for treatment with pembrolizumab, in a reliable and reproducible manner, we developed an assay that uses the 22C3 antibody concentrate on a widely available immunohistochemical autostainer, for both biopsy and cytology specimens.

באמצעות 22C 3 נוגדן Anti-PD-L1 להתרכז ביופסיה ודוגמאות ציטולוגיה של חולי סרטן ריאות שאינם קטנים התא

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% with current standard of care. Tumors often recur within 9 months following initial surgery, radiation and chemotherapy, at which point treatment options become limited. This highlights the pressing need for the development of better therapeutics to prolong survival and increase the quality of life for these patients.
Tumor Treating Fields (TTFields) therapy was developed to take advantage of the effect of low frequency alternating electrical fields on cells for cancer therapy. TTFields have been demonstrated to disrupt cells during mitosis and slow tumor growth. There is also growing evidence that they act through stimulating immune responses within exposed tumors. The advantages of TTFields therapy include its noninvasive approach and increased quality of life compared to other treatment modalities such as cytotoxic chemotherapies. The Food and Drug Administration approved TTFields therapy for the treatment of recurrent glioblastoma in 2011 and for newly diagnosed glioblastoma in 2015. We report on the effects of TTFields during mitosis, the results of electric fields modeling, and proper transducer array placement. Our protocol outlines the clinical application of TTFields on a patient post-surgery, using the second-generation device.

Glioblastoma is the most common and aggressive primary brain malignancy in adults, with most tumors recurring after initial treatment. Tumor Treating Fields (TTFields) therapy is the newest treatment modality for glioblastoma. Here, we describe the proper application of TTFields-transducer arrays on patients and discuss theory and aspects of treatment.

היישום הקליני של הגידול לטיפול שדות טיפול ב גליובלסטומה

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL of blood) warrant a poor prognosis and are correlated with shorter overall survival in several cancers (e.g., breast, prostate and colorectal). Currently, the anti-EpCAM-coated magnetic bead-based CTC capturing system is the gold standard test approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for enumerating CTCs in the bloodstream. This test is based on the use of magnetic beads coated with anti-EpCAM markers, which specifically target epithelial cancer cells. Many studies have illustrated that EpCAM is not the optimal marker for CTC detection. Indeed, CTCs are a heterogeneous subpopulation of cancer cells and are able to undergo an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) associated with metastatic proliferation and invasion. These CTCs are able to reduce the expression of cell surface epithelial marker EpCAM, while increasing mesenchymal markers such as vimentin. To address this technical hurdle, other isolation methods based on physical properties of CTCs have been developed. Microfluidic technologies enable a label-free approach to CTC enrichment from whole blood samples. The spiral microfluidic technology uses the inertial and Dean drag forces with continuous flow in curved channels generated within a spiral microfluidic chip. The cells are separated based on the differences in size and plasticity between normal blood cells and tumoral cells. This protocol details the different steps to characterize the programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression of CTCs, combining a spiral microfluidic device with customizable immunofluorescence (IF) marker set.

The characterization of circulating tumor cells (CTCs) is a popular topic in translational research. This protocol describes a semi-automatic immunofluorescence (IF) assay for PD-L1 characterization and enumeration of CTCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) patient samples.

Semi-אוטומטי PD-L1 אפיון וספירה של תאים סרטניים במחזור בין שאינם קטנים תאים סרטן ריאות חולים על ידי Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

קבלת סרטן גזע כדורים מגינקולוגית סרטן השד גידולים

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Measuring the Motor Aspect of Cancer-Related Fatigue using a Handheld Dynamometer

Cancer-related fatigue (CRF) is commonly reported by patients both during and after receiving treatment for cancer. Current CRF diagnoses rely on self-report questionnaires which are subject to report and recall biases. Objective measurements using a handheld dynamometer, or handgrip device, have been shown in recent studies to correlate significantly with subjective self-reported fatigue scores. However, variations of both the handgrip fatigue test and fatigue index calculations exist in the literature. The lack of standardized methods limits the utilization of the handgrip fatigue test in the clinical and research settings. In this study, we provide detailed methods for administering the physical fatigue test and calculating the fatigue index. These methods should supplement existing self-reported fatigue questionnaires and help clinicians assess fatigue symptom severity in an objective and quantitative manner.

Simple and accessible methods were developed to measure the motor aspect of cancer-related fatigue objectively and quantitatively. We describe, in detail, ways to administer the physical fatigue test using a simple handgrip device as well as methods to calculate fatigue indices.

מדידת ההיבט המוטורי של עייפות הקשורה לסרטן באמצעות מדידת דינמיות של כף-יד

Cancer-related fatigue (CRF) is commonly reported by patients both during and after receiving treatment for cancer. Current CRF diagnoses rely on ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

בידוד והערכה תפקודית של תאי גזע מסרטן השד האנושי מדגימות תאים ורקמות

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Simple and Fast Rolling Circle Amplification-Based Detection of Topoisomerase 1 Activity in Crude Biological Samples

Isothermal amplification-based techniques such as the rolling circle amplification have been successfully employed for the detection of nucleic acids, protein amounts, or other relevant molecules. These methods have shown to be substantial alternatives to PCR or ELISA for clinical and research applications. Moreover, the detection of protein amount (by Western blot or immunohistochemistry) is often insufficient to provide information for cancer diagnosis, whereas the measurement of enzyme activity represents a valuable biomarker. Measurement of enzyme activity also allows for the diagnosis and potential treatment of pathogen-borne diseases. In all eukaryotes, topoisomerases are the key DNA-binding enzymes involved in the control of the DNA topological state during important cellular processes and are among the important biomarkers for cancer prognosis and treatment.
Over the years, topoisomerases have been substantially investigated as a potential target of antiparasitic and anticancer drugs with libraries of natural and synthetic small-molecule compounds that are investigated every year. Here, the rolling circle amplification method, termed rolling circle enhanced enzyme activity detection (REEAD) assay that allows for the quantitative measurement of topoisomerase 1 (TOP1) activity in a simple, fast, and gel-free manner is presented.By cleaving and ligating a specially designed DNA substrate, TOP1 converts a DNA oligonucleotide into a closed circle, which becomes the template for rolling circle amplification, yielding ~103 tandem repeat rolling circle products. Depending on the nucleotide incorporation during the amplification, there is the possibility of different readout methods, from fluorescence to chemiluminescence to colorimetric. As each TOP1-mediated cleavage-ligation generates one closed DNA circle, the assay is highly sensitive and directly quantitative.

A protocol for the sensitive and quantitative detection of topoisomerase 1 activity using the rolling circle enhanced enzyme activity detection assay is described. The method allows detection of topoisomerase 1 activity from purified components or cell/tissue extracts. This protocol has wide-ranging applications in any field involving detection of enzymatic activity.

זיהוי פשוט ומהיר של הגברה מבוססת מעגל של פעילות טופואיזומראז 1 בדגימות ביולוגיות גולמיות

Isothermal amplification-based techniques such as the rolling circle amplification have been successfully employed for the detection of nucleic acids, ...